БИОФИЗИКА, 2022, том 67, № 5, с. 897-905

БИОФИЗИКА КЛЕТКИ

УДК 57.033, 57.013

ИЗМЕНЕНИЕ КОНФОРМАЦИИ И РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕМОГЛОБИНА

В ЭРИТРОЦИТЕ ПРИ ИНГИБИРОВАНИИ Na⁺/K⁺-АТФазы

И.Ю. Петрушанко**, Г.В. Максимов*^, ***, #

*Биологический факультет Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова,

Ленинские горы, 1/24, Москва, 119991, Россия

**Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта, Москва, ул. Вавилова, 32, Москва, 119991, Россия

***Национальный исследовательский технологический университет «МИСиС»,

Ленинский просп., 4/1, Москва, 119049, Россия

^#E-mail: gmaksimov@mail.ru

Поступила в редакцию 18.07.2022 г.

После доработки 29.07.2022 г.

Принята к публикации 02.08.2022 г.

С помощью спектроскопии комбинационного рассеяния, инфракрасной спектроскопии и лазер-

ной интерференционной микроскопии выявлены как изменения морфологии, так и изменения

конформации гемоглобина в эритроците в результате увеличения соотношения [Na⁺]_in и [K⁺]_in при

блокировании Na⁺/K⁺-АТФазы клетки. Установлено, что блокирование Na⁺/K⁺-АТФазы приво-

дит не только к увеличению [Na⁺]_in в клетке, но и к увеличению положительного заряда на цито-

плазматической поверхности плазматической мембраны. В этих условиях выявлены изменения

конформации как гема, так и белковой глобулы гемоглобина, а именно, снижение плотности упа-

ковки молекулы гемоглобина, которые могут быть связаны как с сорбцией Na⁺ (или Са²⁺) с гемо-

глобином, так и с увеличением количества молекул воды в клетке и перераспределением гемогло-

бина. Вероятно, перераспределение гемоглобина и изменение плотности упаковки участка глобина

оказывают влияние на конформацию гема, увеличивая вероятность нахождения гема гемоглобина

в «куполообразной форме» и, таким образом, повышает его способность связывать О₂.

Ключевые слова: спектроскопия комбинационного рассеяния, гемоглобин, эритроциты, объем эритро-

цита.

DOI: 10.31857/S0006302922050064, EDN: JIEVCW

больных с хронической почечной недостаточно-

В настоящее время большой интерес вызыва-

стью [4] и при уремии [4, 5]. Важно, что перерас-

ют исследования, связанные с механизмом регу-

ляции конформации и распределения гемоглоби-

пределение ионов в эритроците сопровождается

на при изменениях ионного гомеостаза эритро-

изменениями мембранного потенциала, которые

цита. Вероятно, изменения морфологии или

модифицируют состояние мембранных белков и

объема эритроцита приводят к изменению спо-

липидов [2]. Существенную роль в поддержании

собности гемоглобина (Гб) связывать или сбра-

ионного гомеостаза, а также в регуляции объема и

сывать лиганды (в том числе О₂ и NO_x). Очевид-

формы эритроцита выполняет фермент Na⁺/K⁺-

но, эти процессы могут как вызвать нарушения

АТФаза (Na⁺/K⁺-аденозинтрифосфатаза, EC

газообмена в организме, так и быть последствием

3.6.3.9) [6, 7]. Перенос ферментом ионов против

ряда патологий [1-3]. Так, увеличение внутри-

градиента их концентрации осуществляется за

клеточной концентрации ионов Na⁺ выявлено усчет гидролиза АТФ и поддерживает низкий уро-

вень [Na⁺]_in в клетке [8]. Важную роль в измене-

Сокращения: Гб - гемоглобин, СЭ - суспензия эритроци-

нии функций эритроцитов выполняет процесс

тов, ЛИМ - лазерная интерференционная микроскопия,

КР - комбинационное рассеяние, ИК - инфракрасный,

PLB - среда, имитирующая плазму крови (Plasma-Like

регуляции соотношения ионов Na⁺ и K⁺ в цито-

Buffer).

плазме клетки [9].

897

898

СЛАТИНСКАЯ и др.

Однако в настоящее время мало известно, ка-

комплекте с прибором Zetasizer Nano ZS, и пакет

ким образом изменения ионного гомеостаза

программ MS Excel.

и/или мембранного потенциала при работе

Измерение объема эритроцита. Контроль за из-

Na⁺/K⁺-АТФазы в эритроците регулируют рас-

менениями объема и формы эритроцита прово-

пределение гемоглобина в клетке и его конфор-

дили при помощи лазерного интерференционно-

мацию. Целью работы было исследование кон-

го микроскопа (ЛИМ), разработанного во ВНИ-

формации и перераспределения гемоглобина в

ИОФИ на базе микроинтерферометра Линника

эритроците при блокировании активности

МИИ-4 (ЛОМО, Россия) с объективом

30×

(NA = 0.65) и полупроводниковым лазером

Na⁺/K⁺-АТФазы уабаином.

(λ = 650 нм) с мощностью лазера на объекте менее

2 мВт. Размер регистрируемого кадра составлял

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

195×145 мкм. Для анализа полученных изображе-

ний использовали ПЗС-видеокамеру VS-415U

Выделение эритроцитов. Объектом исследова-

(NPK «Videoscan», Россия), с размером матрицы

ния служила суспензия эритроцитов (СЭ) из ку-

битальной крови доноров (объект предоставлен

6.5×4.83 мм и разрешением 782×582 точек. Общее

время регистрации изображения составляло

НМИЦ кардиологии им. академика А.Е. Чазова).

10 сек [10, 11]. Образец наносили на предметное

В качестве антикоагулянта использовали гепа-

стекло с зеркальной поверхностью и накрывали

рин (5 Ед/мл крови). После забора кровь хранили

сверху предметным стеклом. Препарат с СЭ нахо-

при 4°С. Для выделения СЭ использовали физио-

дился в буфере Аллена и в буфере Аллена с 1 мМ

логический фосфатный буфер Аллена (145 мМ

уабаином [12]. Все измерения проводили после

NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ CaCl₂, 4 мM Na₂HPO₄,

часовой инкубации СЭ в растворах. Для восста-

1 мM NaH₂PO₄, 1 мМ MgSO₄, 5 мМ глюкозы,

новления фазового изображения по девяти реги-

рН 7.4). Очистку СЭ от компонентов плазмы и бе-

стрируемым интерферограммам методом фазо-

лых форменных элементов крови проводили сле-

вых шагов, использовали программу WinPhast,

дующим образом: к цельной крови добавляли бу-

для последующей работы с изображениями -

фер Аллена в соотношении 1 : 3, тщательно пере-

программы FIJI (США) и Origin 2017 (Microcal

мешивали и центрифугировали (Laborfuge 400R,

Inc., США).

ThermoScientific, США) при 1500 g в течение

Метод ЛИМ позволяет рассчитать фазовый

5 мин при 4°С. Полученный супернатант отделя-

объем эритроцитов [13-15] по формуле:

ли от осадка. Процедуру осаждения эритроцитов

повторяли дважды при тех же условиях центри-

ОРХ

mean

(1)

фугирования. Полученную суспензию эритроци-

тов хранили на льду не более 3 ч.

где S - площадь клетки, рассчитанная методом

Инкубация СЭ с уабаином. Для инкубации СЭ

наименьших квадратов по фоновому значению,

с уабаином (G-Strophanthin, Sigma, США), гото-

ОРХ - оптическая разность хода светового луча.

вили раствор с 10 мМ уабаином (#75640, Fluka,

Измерения объема эритроцита с помощью ЛИМ

Швейцария) в буфере Аллена и добавляли его к

проведено на 60 клетках.

образцам СЭ (конечная концентрация уабаина

1 мМ). Время инкубации СЭ в приготовленной

Спектроскопия комбинационного рассеяния. Ре-

среде составляло 60 мин.

гистрацию спектров комбинационного рассея-

ния (КР, Рамановская спектроскопия) гемогло-

Регистрация ζ-потенциала плазматической мем-

бина проводили с помощью конфокального мик-

браны эритроцита. Для контроля за изменениями

роскоп-спектрометра NTEGRA-SPECTRA (NT-

ζ-потенциала плазматической мембраны эритро-

MDT, Россия) в диапазоне частотного сдвига

цита 1 мл СЭ (Нt = 40%) пробу СЭ разводили в

1000 раз буфером Аллена. Далее 1 мл полученного

1000-3200 см^-1 с шагом измерения 1 см^-1, охла-

раствора помещали в одноразовую капиллярную

ждение CCD камеры -50°C, объектив 5× с апер-

поликарбонатную U-образную кювету DTS1070

турой 0.15, решетка 600, мощность лазера на об-

(Malvern, Великобритания) с золотыми электро-

разце 3 мВт, длина волны возбуждения 532 нм,

дами и тщательно перемешивали во избежание

время регистрации одного спектра - 15-30 с, ко-

образования пузырей воздуха или скопления СЭ

личество накоплений сигнала - 3. Для регистра-

в одной из частей кюветы. Измерения проводили

ции сигнала образец помещали в гематокритный

в термостатирующей ячейке прибора Zetasizer

капилляр с диаметром поперечного сечения 1 мм

Nano ZS (Malvern, Великобритания) при 25°С.

(«АгатМед», Россия), который запаивали для гер-

Время адаптации образца к температуре - 60 с,

метичности. Каждое измерение проводили не ме-

количество проведенных измерений - 100. Каж-

нее пяти раз. Для обработки результатов исполь-

дое измерение включало не менее пяти повторов.

зовали программное обеспечение Origin 2017. Об-

Для обработки результатов использовали про-

работка сигнала включала в себя вычитание

граммное обеспечение Malvern, поставляемое в

базовой линии.

БИОФИЗИКА том 67

№ 5

2022

ИЗМЕНЕНИЕ КОНФОРМАЦИИ И РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕМОГЛОБИНА

899

Таблица 1. Соотношение интенсивностей полос спектра КР гемоглобина [16-21]

Отношение пиков спектра

Значение соотношений

Выраженность симметричных и асимметричных колебания пиррольных колец.

I₁₃₇₅/I₁₁₇₂

Снижение величины соотношения характеризует возрастание подвижности

гема

Вклад валентных колебаний связей винильных групп к симметричным

I₁₅₈₀/I₁₃₇₅

колебаниям пиррольных колец. Относительная способность Гб выделять

лиганды

Вклад несимметричных колебаний метиленовых групп аминокислот глобина

I₂₈₈₀/I₂₉₃₀

по отношению к колебанию концевых метильных радикалов (возрастает при

увеличении упорядоченности СH_n-групп)

Для анализа полученных результатов исполь-

Флуоресценция триптофана белков эритроцита.

зовали соотношение интенсивностей абсолют-

Для контроля за изменениями конформации бел-

ных величин полос спектра КР гемоглобина

ков эритроцита (в первую очередь, гемоглобина)

(табл. 1).

регистрировали изменения времени жизни флуо-

ресценции триптофана с помощью метода счета

Инфракрасная спектроскопия. Регистрацию

одиночных фотонов с корреляцией по времени.

инфракрасных (ИК) спектров молекул в эритро-

Для этого, флуоресценцию белков эритроцита

ците проводили в буфере Аллена с использовани-

возбуждали импульсным субнаносекундным УФ-

ем приставки НПВО (неполного внутреннего от-

светодиодом (EPLED 265, Edinburgh Instruments,

ражения) на инфракрасном Фурье-спектрометре

Шотландия), с максимальным излучением при

Spectrum Two (Perkin Elmer, США). Для регистра-

260 нм, скорректированным металлическим по-

ции ИК-спектра 2 мкл образца наносили на окно

лосовым фильтром (260 нм, ширина 15 нм, Chro-

регистратора и подсушивали, контролируя вклад

ma, США), выдающий импульсы длительностью

ИК-полос от ОН-групп воды в течение 5 мин при

700 пс со средней мощностью 0.6 мкВт при часто-

температуре 25°C. Регистрацию ИК-спектра от

те повторения 20 МГц. Регистрацию сигнала флу-

молекул эритроцита проводили в диапазоне 550-

оресценции (в диапазоне 300-400 нм, с максиму-

мом при 340 нм) осуществляли через коллимаци-

4000 см^-1 с шагом измерения 4 см^-1. Время реги-

онную линзу спектрографа (PML-SPEC, Becker &

страции составляло 20 с. Измерения проводили в

Hickl GmbH, Германия), оснащенного детекто-

количестве повторов не менее 12. Для анализа по-

ром PML-16-С и решеткой 1200 штрих/мм с раз-

ложения максимумов пиков полос и построения

решением 6.25 нм. Аппаратуру TCSPC использо-

соотношений интенсивностей полос, осуществ-

вали в режиме FIFO, регистрируя поток фотонов

ляли коррекцию базовой линии спектра в про-

в программном обеспечении для измерений

грамме Origin 2017. Для анализа изменений струк-

SPCM 9.82 (Becker & Hickl GmbH, Германия).

туры белковой части гемоглобина в эритроците

использовали соотношения интенсивностей по-

Измерения проводили в кварцевой кювете

лос ИК-спектра (табл. 2) [22, 23].

(толщина поглощающего слоя 10 мм). Регистра-

Таблица 2. Соотношение интенсивностей полос спектра ИК гемоглобина [22, 23]

Отношение пиков спектра

Значение соотношений

I₁₆₅₀/I₁₅₄₀

Характеризует изменение вклада Amide I/Amide II. Смещение положения пика

Amide I (1650 см^-1) указывает на изменение общего конформационного

состояния белка в клетке

I₁₆₅₀/I₁₂₄₃

Различия по белкам*

I₁₄₅₀/I₁₂₄₃

Различия по аминокислотам*

I₂₉₃₀/I₁₂₄₃

Различия по жирным кислотам*

Примечание. * - Если после вычета базовой линии полоса с максимумом при 1243 см^-1 одинакова, то ее можно

использовать в качестве внутреннего стандарта оценки количественных изменений [10].

БИОФИЗИКА том 67

№ 5

2022

900

СЛАТИНСКАЯ и др.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

цию потока около 10⁶ фотонов проводили в тече-

ние 10 с. Для получения максимальной величины

Исследование изменений морфологии эритроци-

отношения сигнал/шум измерения проводили

та при блокировании Na⁺/K⁺-АТФазы. Известно,

троекратно. В эксперименте СЭ разводили в

что при селективном связывании уабаина с

1000 раз в буфере Аллена в термостатирующей

Na⁺/K⁺-АТФазой блокируется активный транс-

ячейке при 25°С. Время адаптации образца к тем-

пературе - 60 с. Все эксперименты проводили не

порт - выход из клетки Na⁺ и вход K⁺[28]. При

менее трех раз. Изменения интенсивности, вре-

этом происходит накопление Na⁺ внутри клетки,

мени жизни и спектра флуоресценции обрабаты-

на 88% снижается вход К⁺ [29] и, как следствие,

вали с помощью пакета программ SPCImage 8.0

наблюдается увеличение объема эритроцита.

(Becker & Hickl, Германия).

С помощью ЛИМ нами установлено, что после

Определение содержания ионов Na⁺ и К⁺ в

инкубации эритроцитов с уабаином снижается

величина фазового объема и амплитуда оптиче-

эритроците. Для выделения СЭ использовали сре-

ской разности хода луча света за счет перераспре-

ду, имитирующего плазму крови (PLB - Plasma-

деления Гб вследствие входа воды при накопле-

Like Buffer) сдедующего состава: 115 мМ NaCl,

4 мМ KCl, 25 мМ NaHCO₃, 0.75 мМ MgSO₄,

нии [Na⁺]_in. Вероятно, увеличение объема эрит-

10 мМ глюкозы, 0.015 мМ ZnCl₂, 0.2 мМ глицина,

роцита при блокировании насоса [29-31] может

0.2 мМ глутамата натрия, 0.1 мМ аргинина,

сопровождаться как изменением трансмембран-

0.6 мМ глютамина, 0.2 мМ аланина, 20 мМ

ного потенциала, так и поверхностного заряда

HEPES (pH 7.4 при 5% CO₂) [24]. PLB добавляли

плазматической мембраны эритроцита. Действи-

к крови в соотношении 8 : 1. Образцы центрифу-

тельно, при повышении [Na⁺]_in происходит де-

гировали в течение 10 мин при 1500 g, после чего

поляризация мембранного потенциала, которая

супернатант отбирали и проводили отмывку СЭ

запускает обратную моду Na⁺/Ca²⁺-обменника,

от компонентов плазмы дважды. К отмытой СЭ

увеличивая [Са²⁺]_in. Также основную роль в ста-

добавляли

1.8 мл PLB, ресуспендировали и

билизации объема эритроцитов выполняют каль-

аликвотировали по 90 мкл. В экспериментальные

ций-активируемые калиевые каналы [32]. Веро-

образцы вносили 10 мкл 10 мМ уабаина, а в кон-

ятно, этими процессами обусловлено увеличение

трольные образцы - 10 мкл PLB. После трехчасо-

вой инкубации эритроцитов с уабаином в CO₂-

заряда мембраны с -15.2 ± 0.2 до -13.2 ± 0.2 мВ, а

также перераспределение Гб в клетке (рис. 1а,в).

инкубаторе пробы помещали на лед и вносили

1.5 мл ледяного 0.1 M MgCl₂. Далее центрифуги-

В следующей серии экспериментов исследова-

ровали 10 мин при 2000 g и отбирали супернатант.

ли изменения [Na⁺]_in и [K⁺]_in эритроцита при

Отмывку повторяли дважды. Затем к осадку до-

действии уабаина (рис. 2). Доказано, что при бло-

бавляли по 1.5 мл 5% трихлоруксусной кислоты

кировании Na⁺/K⁺-АТФазы содержание [Na⁺]_in

(#152592, MP Biomedicals, США) и оставляли об-

в эритроците возрастает, при этом наблюдается

разцы на ночь при 4°С. После осаждения клеточ-

ных белков трихлоруксусной кислотой [25] об-

тенденция к снижению содержания

[K⁺]_in

разцы центрифугировали 10 мин при 13700 g. Су-

(рис. 2). Полученные данные подтверждают уве-

пернатант переносили в пробирки и определяли

личение соотношения содержания ионов натрия

и калия в эритроците при блокировании насоса

[Na⁺]_in и [K⁺]_in на атомно-абсорбционном спек-

[33].

трометре «Квант-2М» («КОРТЭК», Россия) [26].

Осадок растворяли в 1.5 мл 0.1 М NaOH и опреде-

Исследование изменений конформации гемогло-

ляли содержание белка методом Бредфорда [27] с

бина эритроцитов при блокировании Na⁺/K⁺-

использованием Quick Start™ Bradford 1× Dye Re-

АТФазы. Установлено, что блокирование актив-

agent (#5000205, BioRad, США) на спектрофото-

ности Na⁺/K⁺-АТФазы приводит к увеличению

метре V560 (JASCO, Япония).

[Na⁺]_in и поверхностного заряда мембраны, а так-

Полученные данные обрабатывали стандарт-

же перераспределению Гб в цитоплазме клетки

ными статистическими методами в пpогpамме

(рис. 1). Мы предположили, что эти процессы мо-

Statistica 8.0: вычисляли среднее арифметическое

гут быть фактором активации ряда внутриклеточ-

значение (M) и стандартную ошибку среднего

ных процессов (активация фосфолипаз), которые

(SE) для экспериментальных и контрольных ре-

меняют упорядоченность жирнокислотных хво-

зультатов. Используя t-критерий Стьюдента

стов мембранных липидов, снижая долю примем-

(p < 0.05), оценивали достоверность полученных

бранного Гб, связанного с белком полосы 3, а

результатов, а непараметрический критерий Вил-

также формирования комплекса Гб и белка поло-

кокcона применяли для оценки значимости раз-

сы 3 за счет отрицательно заряженного компо-

личий двух связанных выборок (p < 0.05).

нента белка полосы 3 [34-36]. Как отмечалось

БИОФИЗИКА том 67

№ 5

2022

ИЗМЕНЕНИЕ КОНФОРМАЦИИ И РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕМОГЛОБИНА

901

Рис. 1. Изменение величины оптической разности хода светового луча луча света и поверхностного заряда эритроци-

тов после 60-минутной инкубации в растворе с 1 мМ уабаина: (а) - фазовый профиль эритроцита, полученный мето-

дом ЛИМ (черная кривая - контроль, серая кривая - после инкубации с уабаином); (б) - среднее значение оптиче-

ской разности хода, полученное методом ЛИМ; (в) - ζ-потенциал мембран эритроцитов, (г) - фазовый объем (фор-

мула (1)). Данные представлены как среднее ± SE (* - p ≤ 0.05).

снижение величины соотношения I₁₅₈₀/I₁₃₇₅)

выше, при увеличении [Na+]in концентрация

(рис. 3). В частности, выявлены изменения в кон-

Са²⁺ внутри эритроцита может увеличиться за

формации гема, характеризующие снижение по-

счет активации Са-каналов или обратной моды

движности гема (увеличение интенсивности со-

Na-Са-обменника. Все это может влиять на кон-

отношения I₁₃₇₅/I₁₁₇₂) и снижение способности

формацию Гб, а также на количество свободных

Гб выделять лиганды (снижение величины соот-

ОН-групп тирозина белка полосы 3 [37, 38]. В

ношения I₁₅₈₀/I₁₃₇₅), что может быть вызвано как

связи с этим мы исследовали связь данных про-

цессов с изменением конформации Гб в клетке.

деполяризацией мембраны, так и снижением

плотности Гб за счет входа воды, экранирования

С помощью метода КР установлено, что в

Гб молекулами воды, а также селективного свя-

условиях блокирования Na⁺/K⁺-АТФазы (депо-

зывания катионов Na⁺ белками [30]. Отметим,

ляризация мембраны и вход ионов Na⁺ в клетку)

что накопление внутриклеточного натрия приво-

наблюдаются изменения в спектре гема гемогло-

дит и к изменению конформации глобиновой ча-

бина (область валентных колебаний пирролов,

сти молекулы Гб (выявлена тенденция к сниже-

соотношение I₁₃₇₅/I₁₁₇₂), свидетельствующие об

нию упорядоченности СH_n-групп (снижение ве-

изменении конформации гема (доля гема в «ку-

личины соотношения I₂₈₈₀/I₂₉₃₀), что указывает

полообразной форме»), доли комплексов окси- и

на снижение плотности упаковки глобулы глоби-

дезоксигемоглобина, сродства Гб к лигандам

на и коррелирует с данными, свидетельствующи-

(увеличение величины соотношения I₁₃₇₅/I₁₁₇₂ и

ми о снижении плотности распределения гемо-

БИОФИЗИКА том 67

№ 5

2022

ИЗМЕНЕНИЕ КОНФОРМАЦИИ И РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕМОГЛОБИНА

903

Рис. 4. (а) - ИК-спектр суспензии эритроцитов; (б) - величины соотношений интенсивностей полос ИК-спектра,

представленные как изменение относительно контроля (суспензия эритроцитов без добавления уабаина в буфере Аллена);

(в) - время жизни триптофановой флуоресценции, представленное как изменение относительно контроля (суспензия

эритроцитов без добавления уабаина в буфере Аллена). Данные представлены как среднее ± SE (* - p ≤ 0.05).

глобина (по величине оптической разности хода

I₁₆₅₀/I₁₂₄₃), но смещение полосы 1650 до 1647 см^-1

светового луча) в клетке.

может свидетельствовать об изменении длины

Для более детального исследования измене-

сопряжения между амидными связями С=О во

ний конформации глобина гемоглобина и состо-

вторичной структуре белка.

яния липидов плазматической мембраны эритро-

цита при блокировании насоса использовали

В дополнительной серии экспериментов нами

ИК-спектроскопию (рис. 4). Установлено, что в

были выявлены изменения конформации белков

данных условиях наблюдаются изменения в ва-

СЭ (Гб, белки плазматической мембраны, цитос-

лентных колебаниях связей СН₃-групп амино-

келета и т. д.) (снижение времени жизни флуо-

ресценции триптофанов, рис. 4в). Поскольку ге-

кислотных остатков (I₁₄₅₀/I₁₂₄₃) и увеличение ве-

моглобин является основным белком эритроци-

личины соотношения I₂₉₃₀/I₁₂₄₃, характеризую-

тов, составляя около 98% всех белков цитоплазмы

щего

упорядоченность

жирнокислотных

клетки, то изменения его конформации будут

«хвостов» фосфолипидов плазматической мем-

вносить основной вклад в изменение флуорес-

браны эритроцита. Например, при инкубации

ценции триптофанов. Таким образом, наблюдае-

клеток с уабаином возрастает интенсивность по-

мые изменения в первую очередь свидетельству-

лосы 1738 см^-1(рис. 4а), которая характеризует

ют об изменении конформации глобина за счет

растяжение С=О-связей фосфолипидов мембра-

изменения положения триптофанов глобина

ны [39, 40]. При инкубации эритроцитов с уабаи-

близ гема, либо в окружения молекул Гб (напри-

ном не выявлены изменения соотношения

мер, в белке полосы 3). Все это, вероятно, отража-

I₁₆₅₀/I₁₅₄₀ (отношение Amide I к Amide II) и

ет перераспределение молекул Гб в цитоплазме и

БИОФИЗИКА том 67

№ 5

2022

904

СЛАТИНСКАЯ и др.

снижение плотности упаковки глобулы Гб (рис. 1

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

и 3).

Эксперименты с кровью человека проведены в

соответствии с принципами биомедицинской

этики, сформулированными в Хельсинкской де-

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

кларации 1964 г. и ее последующих обновлениях,

и одобрены локальным биоэтическим комитетом

С помощью методов оптической спектроско-

Московского государственного университета

пии (КР, ИК и ЛИМ) исследованы как измене-

имени М.В. Ломоносова.

ния морфологии эритроцитов, так и изменения

конформации Гб в эритроците в результате уве-

личения соотношения [Na⁺]_in и [K⁺]_in в клетке.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Установлено, что блокирование Na⁺/K⁺-АТФа-

C. J. Brearley, J. K. Aronson, N. A. Boon, et al., Clin.

Sci., 85 (6), 725 (1993).

зы приводит не только к увеличению [Na⁺]_in в

С. С. Коваленко, Е. Ю. Паршина, А. И. Юсипович

клетке, но и увеличению положительного заряда

и др., Биофизика, 59 (6), 1093 (2014).

на цитоплазматической поверхности плазмати-

ческой мембраны (рис. 1 и 2). В этих условиях вы-

С. М. Иванова, О. И. Лабецкая, Н. А. Анисимов

явлены изменения конформации как гема, так и

и др., Авиакосмич. и экологич. медицина, 53 (2),

белковой глобулы Гб, а именно, снижение плот-

62 (2019).

ности упаковки молекулы Гб, которые могут быть

E. W. Weiler L. F. Saldanha, F. Khalil-Manesh, et al.,

связаны как с сорбцией Na⁺ с Гб, так и увеличе-

J. Am. Soc. Nephrol., 7 (3), 454 (1996).

нием количества молекул воды в клетке и пере-

L. de Franceshi, O. Oliveri, D. Girelli, et al., Eur. J.

распределением Гб в клетке. Вероятно, перерас-

Clin. Invest., 25 (10), 762 (1995).

пределение Гб и изменение плотности упаковки

L. N. Katyukhin, A. M. Kazennov, M. N. Maslova,

участка глобина оказывают влияние на конфор-

et al., Comp. Biochem. Phys. B, 120 (3), 493 (1998).

мацию гема, увеличивая вероятность нахождения

J.-M. Krzesinski, et al., J. Artif. Organs, 16 (1), 23

гема гемоглобина в «куполообразной форме» и,

(1993).

таким образом, повышает способность выделять

P. L. Jorgensen, K. O. Håkansson, S. J. D.Karlish, and

О₂. Можно предположить, что выявленные изме-

P. L. Jorgensen, Annu. Rev. Physiol., 65 (1),

817

нения обусловлены главным образом изменения-

(2003).

ми во вторичной структуре белка-глобина близ

центров локализации гема в Гб.

А. Г. Погорелов, А. В. Русаков и В. Н. Погорелова,

Биофизика, 51 (5), 852 (2006).

Итак, увеличение соотношения

[Na⁺]_in и

10.

A. I. Yusipovich, M. V. Zagubizhenko, G. G. Levin,

et al., J. Microsc., 244 (3), 223 (2011).

[K⁺]_in в клетке может привести как к деполяриза-

ции плазматической мембраны и изменению

11.

N. Y. Bryzgalova, N. A. Brazhe, A. I. Yusipovich, et al.,

Biophysics, 54 (3), 308 (2009).

конформации примембранного Гб, так и к пере-

распределению и изменению конформации ци-

12.

Г. И. Козинец и Ю. А. Симоварт, Поверхностная

топлазматического Гб. Все вышеперечисленное

цитоархитектоника клеток периферической крови в

нарушает способность эритроцитов переносить

норме и при заболеваниях системы клеток (Валгус,

кислород и является причиной гипоксии в норме

Таллин, 1984).

и при патологии.

13.

P. Mazeron, S. Muller, H. Azouzi, et al., Eur. Biophys.

J., (1997).

14.

A. I. Yusipovich, N. Y. Bryzgalova, E. Y. Parshina,

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

et al., Bull. Exp. Biol. Med., 145 (3), 382 (2008).

Исследование выполнено при финансовой

15.

A. I. Yusipovich, S. M. Novikov, T. A. Kazakova, et al.,

Quant. Electron., 36 (9), 874 (2006).

поддержке Российского фонда фундаментальных

исследований

(№

20-34-90073, для О.В.С.)

16.

S. C. Goheen, L. J. Lis, O. Kucuk, et al., J. Raman

(рис. 1, 3, 4); данные, представленные на рис. 2,

Spectroscopy, 24 (9), 275 (1993).

получены при финансовой поддержке Россий-

17.

N. K. Howell, G. Arteaga, S. Nakai et al. J. Agricult.

ского научного фонда (проект № 19-14-00374-П,

Food Chem. 47 (3), 924 (1999).

для И.Ю.П).

18.

C. H. Camp and M. T. Cicerone, Nat Photonics, 9, 295

(2015).

19.

T. Filho, I. P. Terner, J. Pittman, et al. J. App. Phys,.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

104 (6), 1809 (2008).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

20. N. A. Brazhe, S. Abdali, A. R. Brazhe, et al., Biophys.

интересов.

J., 97 (12), 3206 (2009).

БИОФИЗИКА том 67

№ 5

2022

ИЗМЕНЕНИЕ КОНФОРМАЦИИ И РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕМОГЛОБИНА

905

21. D. M. Scholler, M. Y. Wang, and B. M. Hoffman, J.

31. Н. В. Калягина, М. В. Мартынов и Ф. И. Атаулла-

Biol. Chem. 254 (10), 4072 (1979).

ханов, Биол. мембраны, 30 (2), 115 (2013).

22. S. Din, E. L. Aisha, A. Bahay, et al., Radiat. Phys.

32. Ф. И. Атауллаханов, А. Б. Кляткина, В. М. Витвиц-

Chem., 44 (1-2), 195 (1994).

кий и др., Биол. мембраны, 10 (5), 519 (1993).

23. M. Polakovs, N. Mironova-Ulmane, and N. Kurjane,

33. И. А. Медведева, М. Н. Маслова и А. А. Панов,

In Proc. 6^th Int. Conf. on Advanced Optical Materials and

Физиол. журн. им. И.М. Сеченова, 78 (11), 119

Devices (Springer, 2008), p. 714214.

(1992).

24. A. Makhro, L. Kaestner, and A. Bogdanova, In NMDA

34. J. S. Wiley and K. E. McCulloch, Pharmacol. Thera-

Receptors (Springer, 2017), pp. 265-282.

peut., 18 (2) 271 (1982).

25. A. J. Link and J. LaBaer, Cold Spring Harbor Proto-

35. E. Friederichs, R. A. Farley, and H. J. Meiselman, Am.

cols, 8, pdb-prot5651 (2011).

J. Hematol., 41, 170 (1992).

26. D. A. Fedorov, S. V. Sidorenko, A. I. Yusipovich, et al.,

36. Z. Peng, X. Li, I. V. Pivkin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

Heliyon, 7 (9), e08088 (2021).

USA, 110 (33), 13356 (2013).

27. T. Zor and Z. Selinger, Anal. Biochem., 236 (2), 302

37. G. Minetti, G. Piccinini, C. Balduini, et al., Biochem.

(1996).

J., 320 (2), 445 (1996).

28. С. Н. Орлов, Бюл. сибирской медицины, 18 (2),

38. O. V. Slatinskaya, N. A. Brazhe, S. N. Orlov, et al., Bio-

234 (2019).

chemistry (Moscow), 15 (3), 230 (2021).

29. Е. Д. Суглобова, В. Н. Спиридонов, Ю. А. Борисов

и др., Нефрология, 2 (4), 68 (1998).

39. R. Gasper, et al., Biochim. Biophys. Acta, 1788 (6),

1263 (2009).

30. S. Sidorenko, V. Rebrov, V. G. Verkhov, et al., Chem.

Biol. Ecol., 16 (3), 279 (2016).

40. P. Lasch, et al., Vibr. Spec., 28 (1), 147 (2002).

Changes in Conformation and Distribution of Hemoglobin in the Erythrocyte

during Inhibition of Na⁺/K⁺-ATPase Activity

O.V. Slatinskaya*, P.I. Zaripov**, N.A. Brazhe*, I. Yu. Petrushanko**, and G.V. Maksimov*^,***

*Faculty of Biology, Lomonosov Moscow State University, Leninskie Gory 1/24, Moscow, 119991 Russia

**Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, ul. Vavilova 32, Moscow, 119991 Russia

***National Research Technological University MISiS, Leninskiy prosp. 4/1, Moscow, 119049 Russia

Raman spectroscopy, infrared spectroscopy and laser interference microscopy revealed the changes in eryth-

rocyte morphology and the hemoglobin conformational changes induced by an increase in the

[Na⁺]_in/[K⁺]_in ratio when Na⁺/K⁺-ATPase was blocked in a cell. It has been established that the loss of

Na⁺/K⁺-ATPase leads to [Na⁺]_in accumulation in the cell, and the cytoplasmic surface of the plasma mem-

brane becomes less negative. Under these conditions, the following changes in the conformation of both the

heme and the molten globule of hemoglobin were observed: the packing density of the hemoglobin molecule

decreases; it can be due to the sorption of Na⁺ (or Ca²⁺) from hemoglobin and to an increase in number of

water molecules in the cell and the redistribution of hemoglobin in a cell. It is likely that the redistribution of

hemoglobin and the change in the packing density of the globin site affect the conformation of the heme, in-

creasing the probability of finding the heme of hemoglobin in a "dome-shaped form" and, thus, increasing

the ability to bind O₂.

Keywords: Raman spectroscopy, hemoglobin, erythrocyte, red blood cells, erythrocyte volume

БИОФИЗИКА том 67

№ 5

2022