БИОХИМИЯ, 2021, том 86, вып. 4, с. 607 - 614
УДК 541.14
ВЛИЯНИЕ ДЕТЕРГЕНТОВ И ОСМОЛИТОВ
НА ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТЬ НАТИВНЫХ И МУТАНТНЫХ
РЕАКЦИОННЫХ ЦЕНТРОВ Rhodobacter sphaeroides
© 2021
Т.Ю. Фуфина*, Л.Г. Васильева
Институт фундаментальных проблем биологии РАН, ФИЦ ПНЦБИ РАН, 142290 Пущино,
Московская область, Россия; электронная почта: tat fufina@yandex.ru
Поступила в редакцию 07.12.2020
После доработки 18.02.2021
Принята к публикации 24.02.2021
Фотосинтетический реакционный центр (РЦ) пурпурной бактерии Rhodobacter sphaeroides является одним
из наиболее изученных трансмембранных пигмент белковых комплексов. Он относительно стабилен, извест
ны условия для его выделения из мембран, очистки и хранения. Однако при внесении аминокислотных
замен в белковую структуру этого РЦ нередко наблюдается значительное снижение стабильности комплек
са. Это выражается в падении выхода РЦ при его выделении и очистке, а также влияет на спектральные
свойства РЦ при хранении и может приводить к гетерогенности образцов. С целью оптимизации условий
работы с мутантными РЦ было исследовано влияние различных детергентов и осмолитов на устойчивость
комплекса к повышенным температурам. Показано, что трегалоза и в меньшей степени сахароза, мальтоза
и гидроксиэктоин в концентрации 1 М замедляют термальную денатурацию РЦ. Также продемонстрирова
но, что холат натрия оказывает значительный стабилизирующий эффект на структуру как нативных, так и
генетически модифицированных РЦ. Использование холата натрия в качестве детергента для растворения
РЦ имеет ряд преимуществ и может быть рекомендовано для хранения и изучения мутантных мембранных
комплексов пурпурных бактерий в длительных экспериментах.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: реакционный центр фотосинтеза, термостабильность мембранных белков, детерген
ты, осмолиты, трегалоза, холат натрия, Rhodobacter sphaeroides.
DOI: 10.31857/S0320972521040126
ВВЕДЕНИЕ
ранного белка концентрацию детергента снижа
ют до уровня, достаточного для образования
Мембранные белки играют важную роль во
гидрофобного окружения белка, предотвраща
многих клеточных процессах и имеют значи
ющего агрегацию и стабилизирующего природ
тельный потенциал в области биотехнологий
ную структуру биополимера [5]. На сегодняш
[1-3]. Для изучения и практического использо
ний день универсального для всех мембранных
вания этих белков важен не только процесс вы
белков детергента не найдено, поэтому для каж
деления их из мембран, но также сохранение на
дого белка индивидуально подбираются как са
тивной структуры и биологической активности.
ми детергенты, так и соотношение детергент/
Для солюбилизации белковых комплексов из
белок, время и условия солюбилизации [4, 5].
мембран применяются детергенты, способству
Согласно одной из принятых классифика
ющие переводу интегральных белков в раство
ций, детергенты делятся на ионные, неионные и
ренное состояние. Используемая при солюби
цвиттерионные [5]. Считается, что в отношении
лизации концентрация детергентов близка к
солюбилизации белков из мембран эффектив
критической концентрации мицеллообразова
ность детергентов уменьшается в следующем
ния, которая индивидуальна для каждого детер
порядке: ионные > цвиттерионные > неионные,
гента [4]. При растворении и хранении мемб
в то время как эффективность детергентов в
поддержании стабильности белков уменьшается
Принятые сокращения: БФео - бактериофеофи
в обратном порядке [6]. Отдельно выделяют со
тин; БХл - бактериохлорофилл; ЛДАО - лаурилдиметила
ли желчных кислот, которые, хотя и являются
миноксид; РЦ - реакционный центр; ТДМ - Tris-доде
ионными детергентами, характеризуются более
цилмальтозид; ТЛ - Tris-ЛДАО; ТОГ - Tris - н октил
мягким действием на структуру белка [7]. В пос
глюкозид; ТТ - Tris - Тритон Х100; ТХ - Tris - холат нат
рия; Р - специальная пара бактериохлорофиллов РA и РB;
ледние годы опубликовано немало эксперимен
ФС2 - фотосистема 2.
тальных работ и обзоров, посвященных различ
* Адресат для корреспонденции.
ным подходам, направленным на стабилизацию
607
608
ФУФИНА, ВАСИЛЬЕВА
структуры мембранных белков в растворе [6, 8,
фотосинтетических комплексов в некоторых ра
9]. В ряде исследований для этой цели использо
ботах использовали мониторинг спектров погло
ваны осмолиты - дисахариды, полиолы, неко
щения при инкубировании РЦ в течение дли
торые аминокислоты, а также эктоины [10-14].
тельного времени в темноте при 4 °С [8] или при
Известно, что осмолиты вырабатываются раз
воздействии 25, 48 и 70 °С [7, 19, 21]. Скорость де
личными организмами в ответ на неблагоприят
натурации белка оценивали методом динамичес
ные условия, такие как нехватка воды и высокие
кого светорассеяния, методом регистрации флу
температуры.
оресценции с использованием фьюжн белков
Фотосинтетический реакционный центр
или по изменению полос бактериохлориновых
(РЦ) пурпурной бактерии Rhodobacter (Rba.)
кофакторов и появлению полос агрегированных
sphaeroides является одним их наиболее изучен
пигментов в спектре поглощения ком плексов.
ных трансмембранных пигмент белковых комп
В данной работе была исследована устойчи
лексов. Он состоит из трех белковых субъединиц
вость фотосинтетических РЦ Rba. sphaeroides
и десяти кофакторов переноса электрона [15].
дикого типа и мутантного комплекса I(L177)H к
Кофакторы представлены четырьмя молекулами
повышенным температурам в присутствии ряда
бактериохлорофилла (БХл), две из которых об
детергентов и осмолитов.
разуют специальную пару, представляющую со
бой первичный донор электрона (Р), двумя мо
лекулами бактериофеофитина (БФео), двумя
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
молекулами убихинона, молекулой каротиноида
и атомом негемового железа. Описанный РЦ от
В данной работе мы изучали изолированные
носительно стабилен, для него подобраны усло
реакционные центры Rba. sphaeroides. Бактери
вия солюбилизации из мембран, очистки и хра
альную культуру выращивали на среде Хатнера в
нения, известны детергенты, способствующие
присутствии тетрациклина (1 мкг/мл) («PanReac
сохранению его фотохимической активности [6,
AppliChem», Испания, Германия) и канамицина
16]. В последние годы в структурно функцио
(5 мкг/мл) («MP Biomedicals», США), как описа
нальных исследованиях РЦ активно использует
но ранее [22]. Реакционные центры выделяли
ся сайт направленный мутагенез с целью заме
методом ионообменной хроматографии [23].
ны определенных аминокислотных остатков
Полученные РЦ растворяли в 20 мМ Tris HCl бу
белковой цепи [17]. В спектре поглощения бак
фере pH 8,0, содержащем 0,1% лаурилдиметил
териальных РЦ хорошо различимы полосы пог
аминоксид (ТЛ буфер) («Sigma Aldrich», США),
лощения бактериохлориновых кофакторов, что
0,05% Тритон Х100 (ТТ буфер) («Helicon», Рос
позволяет судить об изменении пигмент белко
сия),
0,6% н октил глюкозид (ТОГ буфер)
вых взаимодействий, вызванных как внесенны
(«Serva», США) [24], 0,03% додецилмальтозид
ми генетическими модификациями, так и воз
(ТДМ буфер) («PanReac AppliChem»), 0,2% хо
действием неблагоприятных факторов среды. В
лат натрия (ТХ буфер) («Sigma Aldrich») [24].
ходе изучения мутантных РЦ было показано, что
Для смены детергента образец в ТЛ буфере кон
ряд аминокислотных замен вблизи кофакторов
центрировали, затем разбавляли буферным раст
влияет на стабильность комплексов. В результа
вором с необходимым детергентом и снова кон
те мутантные РЦ легче подвергаются денатура
центрировали, повторяя эту процедуру дважды.
ции, что снижает их выход при очистке, затруд
Во всех экспериментах использовали образец
няет кристаллизацию и проведение продолжи
РЦ с оптической плотностью, равной единице -
тельных экспериментов, а также может приво
при 804 нм для дикого типа и при 807 нм для му
дить к спектральной гетерогенности образцов
танта I(L177)H. К образцам добавляли аскорбат
[18]. Одним из примеров такого дестабилизиру
натрия (1 мМ) («Sigma Aldrich») для поддержа
ющего действия точечной мутации является
ния первичного донора электрона в восстанов
описанный нами ранее РЦ Rba. sphaeroides с за
ленном состоянии. Для изучения действия осмо
меной изолейцина 177 в L субъединице на гис
литов образцы РЦ в ТЛ буфере помещали в 1 М
тидин I(L177)H [19]. В связи с этим оптимизация
раствор дисахаридов или гидроксиэктоина, как
условий хранения и изучения мутантных РЦ яв
описано ранее [25]. Термостабильность РЦ оце
ляется актуальной задачей.
нивали при 48, 55 и 70 °С в течение 60 мин сог
Существует ряд подходов для определения
ласно описанной нами методике [19]. Измере
стабильности мембранных белков, такие как
ние спектров поглощения производили на
SDS электрофорез в ПААГ, дифференциальная
спектрофотометре UV 1800 («Shimadzu», Япо
сканирующая калориметрия, метод кругового
ния). Количество интактных РЦ в образце оце
дихроизма [5], использование фьюжн белков с
нивали по поглощению мономерных БХл при
флуоресцентными метками [20]. При изучении
804 нм для дикого типа и при 807 нм для
БИОХИМИЯ том 86 вып. 4 2021
ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТЬ РЕАКЦИОННОГО ЦЕНТРА Rba. sphaeroides
609
I(L177)H), как описано в работе Holden Dye
чению светорассеяния образца, свидетельствую
et al. [21], с учетом светорассеяния образца. Раз
щему о денатурации белка (рис. 1, а, спектр 7).
ложение спектров поглощения на гауссианы и
На рисунке 1, б приведены спектры поглоще
построение кривых изменения поглощения про
ния РЦ дикого типа до нагревания (спектр 1),
водилось с помощью программы Origin
через 10 и 20 мин прогревания при 48 °С (спект
(«OriginLab», США). Дифференциальные (свет
ры 2 и 3 соответственно). Спектры поглощения
минус темнота) спектры поглощения измеряли
РЦ описаны гауссианами, которые отражают по
при постоянном освещении с использованием
ложение полос поглощения БХл и БФео. По из
скрещенных светофильтров СЗС 22 и КС 19 на
менению амплитуды гауссиан хорошо заметно
спектрофотометре UV 1800 («Shimadzu»).
уменьшение поглощения БХл специальной па
ры и мономерных БХл и увеличение поглоще
ния свободных бактериохлоринов при 760 нм.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
На примере трегалозы и гидроксиэктоина
мы определили, что стабилизирующее действие
В спектре поглощения РЦ дикого типа длин
осмолитов на РЦ дикого типа проявлялось при
новолновая полоса с максимумом при 865 нм
концентрации выше 500 мМ (данные не приве
соответствует поглощению первичного донора
дены), поэтому для эксперимента была выбрана
электрона, полоса с максимумом при 804 нм -
концентрация 1 М, используемая также и в ряде
поглощению мономерных БХл, а полоса с мак
других работ [13, 25]. При нагревании РЦ в при
симумом при 760 нм - поглощению молекул
сутствии осмолитов в спектре поглощения об
БФео активной и неактивной цепи переноса
разца наблюдались изменения, аналогичные
электрона (рис. 1, а, спектр 1).
представленным на рис. 1, а, однако денатура
На рисунке 1, а с увеличением времени прог
ция РЦ была замедлена. Так, амплитуда QY по
ревания при 48 °С заметно уменьшение амплиту
лосы мономерных БХл при 804 нм за 60 мин ин
ды длинноволновой полосы поглощения пер
кубации при 48 °С в присутствии трегалозы,
вичного донора электрона и ее сдвиг в коротко
мальтозы, сахарозы или гидроксиэктоина
волновую область. Амплитуда полосы поглоще
уменьшилась на 55, 60, 65 и 70% соответственно.
ния мономерных БХл при 804 нм также умень
В контрольном образце РЦ поглощение при
шается. В то же время поглощение в области
804 нм уменьшилось в 5 раз (рис. 2).
700-800 нм растет в связи с увеличением свето
На рисунке 3, а отражено влияние неионных
рассеяния и появлением в буферном растворе
(Тритон Х 100, додецилмальтозид, н октил глю
свободных бактериохлоринов вследствие темпе
козид), цвиттерионного (лаурилдиметиламин
ратурной денатурации белка РЦ. Инкубация об
оксид - ЛДАО) и анионного (холат натрия) де
разца РЦ в течение 60 мин при температуре 48 °С
тергентов на термостабильность РЦ дикого типа.
приводит к практически полному исчезновению
Показано, что после 60 мин инкубирования РЦ
полос поглощения димера и мономеров БХл,
при 48 °С в буфере, содержащем ЛДАО, додецил
значительному увеличению поглощения бакте
мальтозид, Тритон Х 100, н октил глюкозид или
риохлоринов при 760 нм, появлению полосы аг
холат натрия, амплитуда QY полосы мономерных
регированного БХл при 857 нм, а также к увели
БХл при 804 нм уменьшалась на 80, 55, 50, 15 и
Рис. 1. а - Изменение спектра поглощения РЦ дикого типа в ТЛ буфере до нагревания и после прогревания при 48 °С в
течение 10, 20, 30, 40, 50 и 60 мин (спектры 1-7 соответственно); б - разложение спектра поглощения РЦ дикого типа на
гауссианы до нагревания и после прогревания при 48 °С в течение 10 и 20 мин (спектры 1-3 соответственно)
БИОХИМИЯ том 86 вып. 4 2021
610
ФУФИНА, ВАСИЛЬЕВА
55 °С разрушение комплекса происходило в те
чение первых 10 мин, однако в ТОГ буфере пос
ле 60 мин инкубирования в данных условиях в
образце сохранялось 60% нативных комплексов
РЦ, в ТХ буфере - 85% (рис. 4). При повыше
нии температуры до 70 °С в ТЛ и ТОГ буферных
растворах происходила быстрая денатурация РЦ
с появлением полос агрегированных пигментов
в спектре поглощения образца, что затрудняло
количественную оценку. В то же время исполь
зование ТХ буфера позволило сохранить 35%
интактных РЦ после 60 мин инкубирования при
70 °С (рис. 4, б).
В РЦ дикого типа в ТЛ буфере на свету реги
стрируется уменьшение поглощения полосы
первичного донора электрона, а также коротко
Рис. 2. Изменение поглощения в спектре РЦ дикого типа
волновый сдвиг полосы поглощения мономер
при 804 нм в условиях инкубирования в ТЛ буфере в тече
ных БХл и длинноволновый сдвиг полосы пог
ние 60 мин при 48 °С без добавок ( ); в присутствии 1 М
лощения БФео в поле зарядов P+Q−. В нашей ра
раствора трегалозы (•); мальтозы ( ); сахарозы ( ); гидрок
боте показано, что на свету в РЦ дикого типа в
сиэктоина (♦)
ТХ буфере, как и в ТЛ буфере, происходят ана
логичные спектральные изменения, что указы
5% соответственно. Таким образом, наибольшая
вает на перенос электрона от первичного доно
устойчивость РЦ к указанной температуре была
ра Р к акцептору QA. Амплитуды полос в диффе
отмечена в буферных растворах, содержащих
ренциальном спектре (свет минус темнота) для
холат натрия и н октил глюкозид (рис. 3, а). На
РЦ в ТЛ и ТХ буферах совпадают (рис. 5). Эти
рисунке 3, б представлены спектры поглощения
данные свидетельствуют о том, что холат натрия
РЦ дикого типа в ТХ буфере, измеренные в
не оказывает существенного влияния на про
процессе инкубирования при 48 °С в течение
цесс фотоиндуцированного переноса электрона
60 мин. При прогревании РЦ дикого типа в
в РЦ Rba. sphaeroides.
ТХ буфере, в отличие от ТЛ буфера (рис. 1, а),
Значительное увеличение устойчивости РЦ
не происходит заметных изменений в спектре
к повышенным температурам в присутствии хо
поглощения - соотношение полос пигментов и
лата натрия было также продемонстрировано на
светорассеяние образца остаются постоянными.
мутантном РЦ с аминокислотной заменой
В связи с обнаружением выраженного стаби
I(L177)H. Ранее было показано, что замена изо
лизирующего эффекта холата натрия и в мень
лейцина в позиции реакционного центра L177
шей степени н октил глюкозида на структуру
на гистидин привела к снижению термостабиль
РЦ при 48 °С спектры поглощения образца бы
ности генетически модифицированного РЦ в
ли исследованы и при более высоких температу
ТТ буфере [19]. После 60 мин инкубирования в
рах, 55 и 70 °С (рис. 4, а и б соответственно). При
ТТ буфере при 48 °С амплитуда длинноволно
Рис. 3. а - Изменение поглощения при 804 нм в спектре РЦ дикого типа в условиях инкубирования при 48 °С в течение
60 мин в ТЛ буфере (♦), ТТ буфере ( ), ТДМ буфере (•), ТОГ буфере ( ), ТХ буфере ( ); б - изменение спектра погло
щения РЦ дикого типа в ТХ буфере до нагревания и после прогревания при 48 °С в течение 10, 20, 30, 40, 50 и 60 мин
(спектры 1-7 соответственно)
БИОХИМИЯ том 86 вып. 4 2021
ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТЬ РЕАКЦИОННОГО ЦЕНТРА Rba. sphaeroides
611
Рис. 4. Изменение поглощения при 804 нм в спектре РЦ дикого типа при 55 °С (а) и при 70 °С (б) в ТЛ буфере ( ), ТОГ бу
фере (•) и ТХ буфере ( )
вой полосы поглощения мономерных БХл в РЦ
нее описанных условиях [26] в буфере, содержа
дикого типа снизилась на 45%, а в мутантном
щем холат натрия, кристаллы не образовыва
РЦ - на 55% [19]. В настоящей работе продемон
лись, тогда как в буфере с ЛДАО появились три
стрировано, что при инкубировании РЦ дикого
гональные кристаллы. Эти результаты свиде
типа и мутантного образца I(L177)H при 48 °С в
тельствует в пользу того, что холат натрия не
течение 60 мин в ТЛ буфере амплитуда полосы
подходит для кристаллизации РЦ Rba. sphaero/
мономерных БХл снижалась на 80 и 85% соответ
ides в данных условиях.
ственно, при этом для мутантного РЦ в ТХ бу
фере амплитуда снижалась менее чем на 10%,
что также близко к термостабильности РЦ дико
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
го типа в аналогичных условиях (рис. 3, а; 6, а).
На рисунке 6, б показано изменение поглоще
Реакционный центр Rba. sphaeroides характе
ния РЦ I(L177)H при 807 нм в условиях инкуби
ризуется относительной стабильностью и зна
рования образца при 55 °С в буфере, содержа
чительной устойчивостью к повышенным тем
щем ЛДАО или холат натрия, в присутствии или
пературам [21, 27]. Необходимость стабилиза
в отсутствие 1 М трегалозы. Показано, что при
ции структуры РЦ возникает при работе с мутант
55 °С в ТЛ буфере денатурация мутантного РЦ
ными комплексами, поскольку внесение нап
происходила в первые 10 мин инкубирования,
равленных аминокислотных замен вблизи ко
однако в ТХ буфере спустя 60 мин инкубирова
факторов нередко нарушает пигмент белковые
ния поглощение при 807 нм оставалось на уров
не 80%. Добавление трегалозы в буфер с холатом
натрия дополнительно способствовало повыше
нию термостабильности РЦ I(L177)H (рис. 6, б).
Таким образом, добавление в буфер холата нат
рия способствует достижению устойчивости му
тантного комплекса к повышенным температу
рам на уровне РЦ дикого типа.
Мы отметили, что хранение РЦ I(L177)H в
буфере с холатом натрия при -20 °С не приводит
к изменениям спектров поглощения образцов
после процедуры оттаивания, в отличие от
ТЛ буфера (Фуфина, неопубликованные дан
ные). Согласно полученным результатам, холат
натрия может быть использован для хранения
описанных генетически модифицированных РЦ
без нарушения их свойств.
Мы также изучили возможность использова
Рис. 5. Дифференциальные (свет минус темнота) спектры
ния холата натрия для кристаллизации РЦ
поглощения РЦ дикого типа в ТЛ буфере (пунктирная ли
I(L177)H. Было показано, что в течение 4-5 не
ния) и ТХ буфере (сплошная линия), измеренные в диапа
дель при кристаллизации методом in surfo в ра
зоне 700-1000 нм
БИОХИМИЯ том 86 вып. 4 2021
612
ФУФИНА, ВАСИЛЬЕВА
Рис. 6. Изменение поглощения при 807 нм в спектре РЦ I(L177)H в условиях инкубирования в течение 60 минут при
)
48 °С (а) и 55 °С (б) в ТЛ буфере (•), ТХ буфере ( ), ТТ буфере ( ), а также в ТЛ буфере в присутствии 1 М трегалозы (
и в ТХ буфере буфере в присутствии 1 М трегалозы ( )
°
взаимодействия. В нашей работе показано, что
В нашей работе показано, что выбор подхо
такие осмолиты, как трегалоза и в меньшей сте
дящего детергента для растворения и хранения
пени сахароза, мальтоза и гидроксиэктоин в
РЦ Rba. sphaeroides является значительно более
концентрации 1 М замедляют термальную дена
важным фактором для стабилизации комплекса
турацию РЦ. Не исключена возможность того,
по сравнению с добавлением осмолитов. Выяв
что влияние осмолитов на термостабильность
лено, что в присутствии холата натрия устойчи
РЦ Rba. sphaeroides, продемонстрированное в
вость РЦ к повышенным температурам близка к
данной работе, не является специфичным и свя
параметрам, характерным для РЦ в составе
зано с увеличением плотности буфера за счет
мембран [21]. При использовании буфера с хола
высокой концентрации дисахаридов, замедляю
том натрия при 48 °С термостабильность РЦ
щей термальную денатурацию белка. Тем не ме
I(L177)H соответствует таковой дикого типа, а
нее полученные результаты согласуются с име
при одновременном использовании буфера с хо
ющимися литературными данными о влиянии
латом натрия и трегалозой термостабильность
осмолитов на стабильность других фотосинте
РЦ мутанта и дикого типа не различаются и при
тических белков. Так, показано, что гидрокси
55 °С. Ранее положительное влияние дезоксихо
эктоин стабилизирует препараты фотосисте
лата на РЦ пурпурных бактерий было отмечено
мы 2 (ФС2) растений и способствует поддержа
при изучении электронной структуры катион
нию функциональной активности этого комп
радикала Р+• в работе Rautter et al. [32]. Заслужи
лекса in vitro [14]. Сообщается также, что добав
вает внимания и работа Gall and Scheer о влия
ление 1 М трегалозы значительно стимулирует
нии детергентов на стабильность изолированных
фотоиндуцированную активность изолирован
комплексов ФС2 растений, более сложного ана
ных комплексов ФС2 [13, 28]. Согласно литера
лога РЦ пурпурных бактерий [7]. Авторами было
турным данным протекторные свойства трега
отмечено, что среди целого ряда использованных
лозы как осмолита предположительно обуслов
детергентов наиболее выраженное стабилизиру
лены такими ее свойствами, как относительная
ющее действие на лабильный комплекс ФС2
инертность гликозидной связи, высокая темпе
проявляли соли желчных кислот - холат, дезок
ратура стеклования, высокая стабильность в
сихолат и 3 [(3 холамидопропил) диметиламмо
широком диапазоне рН и температуры, а также
нио] пропан сульфонат (CHAPS). Авторы пред
высокая гидрофильность [12, 29]. В отношении
положили, что наблюдаемый эффект обусловлен
действия трегалозы на РЦ пурпурных бактерий
скорее структурными особенностями молекул
следует отметить работы лаборатории проф.
солей желчных кислот, чем их ионными свой
Venturoli из университета Болоньи, в которых
ствами [7]. Отметим, что результаты описанной
эти РЦ были исследованы в составе высушен
работы в отношении других детергентов не впол
ных стеклообразных матриц с трегалозой [10]. В
не согласовались с данными нашего исследова
таких образцах при 44 °С спектр поглощения РЦ
ния. Это несоответствие подтверждает тезис о
не изменялся в течение 96 ч [30]. Авторами было
том, что не существует универсального детерген
продемонстрировано, что в процессе первично
та: для каждого мембранного белка необходимо
го переноса электрона вблизи сайта связывания
отдельно подбирать условия для солюбилизации
первичного хинона QA происходят конформа
и состав буфера для хранения [4, 5].
ционные изменения белка, стабилизирующие
Холат натрия, являясь мягким детергентом,
состояние с разделенными зарядами Р+Q– [31].
не эффективен для изолирования белков из
БИОХИМИЯ том 86 вып. 4 2021
ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТЬ РЕАКЦИОННОГО ЦЕНТРА Rba. sphaeroides
613
мембран и при солюбилизации мембранных
Таким образом, в данной работе показано,
комплексов обычно используется совместно с
что присутствие дисахаридов в растворе оказы
другими детергентами [24]. Вместе с тем данная
вает слабый стабилизирующий эффект на
работа показывает, что выбор холата натрия в
структуру РЦ Rba. sphaeroides к повышенным
качестве детергента в буферном растворе для РЦ
температурам, в то время как использование де
Rba. sphaeroides имеет ряд несомненных преиму
тергента холата натрия значительно повышает
ществ. Первое, мицеллы холата обладают не
устойчивость структуры РЦ, что важно при ис
большими размерами, 10-12 Å [33], поэтому
следовании мутантных мембранных комплексов
при концентрировании РЦ на мембранах с по
в длительных экспериментах. Эта характеристи
рами 50-100 кДа молекулы детергента проходят
ка холата натрия может способствовать его при
сквозь них, и концентрация холата натрия в
менению при создании искусственных преобра
растворе РЦ не повышается. Это выгодно отли
зователей световой энергии на основе бактери
чает холат натрия от других часто используемых
альных РЦ, поскольку модификации, вносимые
детергентов, таких как Тритон Х 100, ДМ, ОГ и
в комплекс для адаптации белковой структуры к
ЛДАО [4]. Второе, РЦ, растворенные в буфере с
технологическим требованиям (например, из
холатом натрия, при необходимости можно пе
менение величины редокс потенциала Р, присо
ревести в буфер с другими детергентами, что
единение к полупроводниковой подложке,
затруднительно, например, при использовании
улучшение взаимодействия с искусственным
Тритона Х 100. Наконец, третье важное преиму
донором или акцептором электрона и др.), с
щество - холат натрия не только обладает бóль
большой вероятностью приведут к снижению
шим стабилизирующим действием на РЦ, но
стабильности структуры РЦ [3].
также он значительно дешевле мягких неион
ных детергентов додецилмальтозида и н октил
Финансирование. Работа выполнена в рамках
глюкозида. Холат натрия нечасто используется в
госзадания АААА А17 117030110140 5 (направ
экспериментах с фотосинтетическими комплек
ленный мутагенез реакционных центров), а так
сами, что может объясняться потенциальной
же при частичной финансовой поддержке Рос
возможностью влияния этого детергента на фо
сийского фонда фундаментальных исследова
тохимические процессы в связи с его анионной
ний, проект № 17 00 00207 и № 17 00 00218 (К)
природой. Однако, согласно полученным в на
(изучение термостабильности реакционных
шей работе результатам, холат натрия не оказы
центров).
вает существенного влияния на фотохимичес
Конфликт интересов. Авторы заявляют об от
кую активность РЦ Rba. sphaeroides, что позво
сутствии конфликта интересов.
ляет рекомендовать этот детергент для исполь
Соблюдение этических норм. Статья не содер
зования в решении фундаментальных и при
жит описания каких либо исследований с ис
кладных задач с привлечением фотосинтетичес
пользованием людей и животных в качестве
ких мембранных белков пурпурных бактерий.
объектов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.
Bayley, H., and Jayasinghe, L. (2004) Functional engi
8. Odahara, T. (2004) Stability and solubility of integral mem
neered channels and pores (review), Mol. Membr. Biol., 21,
brane proteins from photosynthetic bacteria solubilized in
209 220, doi: 10.1080/09687680410001716853.
different detergents, Biochim. Biophys. Acta, 1660, 80 92,
2.
Reimhult, E., and Kumar, K. (2008) Membrane biosensor
doi: 10.1016/j.bbamem.2003.11.003.
platforms using nano and microporous supports, Trends
9. Breibeck, J., and Rompel, A. (2019) Successful amphi
Biotechnol., 26, 82 89, doi: 10.1016/j.tibtech.2007.11.004.
philes as the key to crystallization of membrane proteins:
3.
Singh, V. K., Ravi, S. K., Ho, J. W., Wong, J. K. C., Jones,
Bridging theory and practice, Biochim. Biophys. Acta Gen.
M. R., and Tan, S. C. (2018) Biohybrid photoprotein
Subj., 1863, 437 455, doi: 10.1016/j.bbagen.2018.11.004.
semiconductor cells with deep lying redox shuttles achieve
10. Francia, F., Dezi, M., Mallardi, A., Palazzo, G., Cordone,
a 0.7 V photovoltage, Adv. Funct. Mater., 28, 1703689,
L., and Venturoli, G. (2008) Protein matrix coupling/
doi: 10.1002/adfm.201703689.
uncoupling in “dry” systems of photosynthetic reaction
4.
Le Maire, M., Champeil, P., and Moller, J. V. (2000)
center embedded in trehalose/sucrose: the origin of tre
Interaction of membrane proteins and lipids with solubiliz
halose peculiarity, J. Am. Chem. Soc., 130, 10240 10246,
ing detergents, Biochim. Biophys. Acta, 1508, 86 111,
doi: 10.1021/ja801801p.
doi: 10.1016/s0304 4157(00)00010 1.
11. Jain, N. K., and Roy, I. (2010) Trehalose and protein sta
5.
Roy, A. (2015) Membrane preparation and solubilization,
bility, Curr. Protoc. Protein Sci.,
59,
4.9.1 4.9.12,
Methods Enzymol., 557, 45 56, doi: 10.1016/bs.mie.2014.11.044.
doi: 10.1002/0471140864.ps0409s59.
6.
Sadaf, A., Cho K. H., Byrne, B., and Chae, P. S. (2015)
12. Ohtake, S., and Wang, Y. J. (2011) Trehalose: current use
Amphipathic agents for membrane protein study, Methods
and future applications, J. Pharm. Sci., 100, 2020 2053,
Enzymol., 557, 57 94, doi: 10.1016/bs.mie.2014.12.021.
doi: 10.1002/jps.22458.
7.
Gall, B., and Scheer, H. (1998) Stabilization of photosys
13. Мамедов М. Д., Петрова И. О., Яныкин Д. В., Заспа А. А.,
tem II reaction centers: influence of bile salt detergents and
Семенов А. Ю. (2015) Влияние трегалозы на выделение
low pH, FEBS Lett., 431, 161 166, doi: 10.1016/s0014
кислорода и перенос электрона в комплексах фотосисте
5793(98)00739 x.
мы 2, Биохимия, 80, 79 86, doi: 10.1134/S0006297915010071.
БИОХИМИЯ том 86 вып. 4 2021
614
ФУФИНА, ВАСИЛЬЕВА
14.
Yanykin, D. V., Malferrari, M., Rapino, S., Venturoli, G.,
reaction center results in the covalent binding of PA bacte
Semenov, A. Yu., and Mamedov, M. D.
(2019)
riochlorophyll to the L subunit, FEBS Lett., 581, 5769
Hydroxyectoine protects Mn depleted photosystem II
5773, doi: 10.1016/j.febslet.2007.11.032.
against photoinhibition acting as a source of electrons,
24.
Dezi, M., Francia, F., Mallardi, A., Colafemmina, G.,
Photosynth. Res., 141, 165 179, doi: 10.1007/s11120 019
Palazzo, G., and Venturoli, G. (2007) Stabilization of
00617 w.
charge separation and cardiolipin confinement in antenna
15.
Allen, J. P., Feher, G., Yeates, T. O., Komiya, H., and Rees,
reaction center complexes purified from Rhodobacter
D. S. (1987) Structure of reaction center from Rhodobacter
sphaeroides, Biochim Biophys Acta,
1767,
104156,
sphaeroides R 26: the cofactors, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
doi: 10.1016/j.bbabio.2007.05.006.
84, 5730 5734, doi: 10.1073/pnas.84.16.5730.
25.
Lippert, K., and Galinski, E. A. (1992) Enzyme stabiliza
16.
Jones, M.R. (2008) Structural plasticity of reaction centers
tion by ectoine type compatible solutes, Appl. Microbiol.
from purple bacteria, in The Purple Phototrophic Bacteria
Biotechnol., 37, 61 65, doi: 10.1007/BF00174204.
(Hunter, C. N., Daldal, F., Thurnauer, M. C., J. Beatty,
26.
Vasilieva, L. G., Fufina, T. Y., Gabdulkhakov, A. G.,
N., eds) Springer, pp. 295 321.
Leonova, M. M., Khatypov, R. A., and Shuvalov, V. A.
17.
Леонова М. М., Фуфина Т. Ю., Шувалов В. А., Василь
(2012) The site directed mutation I(L177)H in Rhodobacter
ева Л. Г. (2014) Исследование пигмент белковых взаи
sphaeroides reaction center affects coordination of P(A) and
модействий в фотосинтетическом реакционном цент
B(B) bacteriochlorophylls, Biochim. Biophys. Acta, 1817,
ре пурпурных бактерий. Глава в кн. Современные проб/
1407 1417, doi: 10.1016/j.bbabio.2012.02.008.
лемы фотосинтеза, том. 1 (под ред. Аллахвердиева
27.
Hughes, A. V., Rees, P., Heathcote, P., and Jones, M. R.
С.И., Рубина А.Б., Шувалова В.А.), Ижевский Инсти
(2006) Kinetic analysis of the thermal stability of the pho
тут компьютерных исследований, Москва-Ижевск,
tosynthetic reaction center from Rhodobacter sphaeroides,
с. 157 196.
Biophys. J., 90, 4155 4166.
18.
Васильева Л. Г., Фуфина Т. Ю., Габдулхаков А. Г., Шу
28.
Yanykin, D. V., Khorobrykh, A. A., Mamedov, M. D., and
валов В. А. (2015) Разные последствия одинаковых
Klimov, V. V. (2015) Trehalose stimulation of photoin
симметричных мутаций вблизи димера бактериохло
duced electron transfer and oxygen photoconsumption in
рофилла в реакционном центре Rhodobacter sphaeroides,
Mn depleted photosystem
2 membrane fragments,
Биохимия, 80, 767 774, doi: 10.1134/S0006297915060012.
J. Photochem. Photobiol.
B Biol.,
152,
279285,
19.
Фуфина Т. Ю., Васильева Л. Г., Шувалов В. А. (2010)
doi: 10.1016/j.jphotobiol.2015.08.033.
Исследование стабильности мутантного фотосинте
29.
Fernandez, O., Bethencourt, L., Quero, A., Sangwan,
тического реакционного центра Rhodobacter sphaero/
R. S., and Clement, C. (2010) Trehalose and plant stress
ides I(L177)H и установление местоположения бакте
responses: friend or foe, Trends Plant Sci., 15, 409 417,
риохлорофилла, ковалентно связанного с белком, Био/
doi: 10.1016/j.tplants.2010.04.004.
химия, 75, 256 263, doi: 10.1134/s0006297910020112.
30.
Malferrari, M., Francia, F., and Venturoli, G.
(2015)
20.
Kawate, T., and Gouaux, E. (2006) Fluorescence detec
Retardation of protein dynamics by trehalose in dehydrat
tion size exclusion chromatography for precrystallization
ed systems of photosynthetic reaction centers. Insights
screening of integral membrane proteins, Structure, 14,
from electron transfer and thermal denaturation kinetics,
673 681, doi: 10.1016/j.str.2006.01.013.
J. Phys. Chem. B, 119, 13600 13618, doi: 10.1021/acs.
21.
Holden Dye, K., Crouch, L. I., Williams, C. M., Bone,
jpcb.5b02986.
R. A., Cheng, J., et al. (2011) Opposing structural changes
31.
Francia, E., Malferrari, M., SacquinMora, S., and
in two symmetrical polypeptides bring about opposing
Venturoli, G. (2009) Charge recombination kinetics and
changes to the thermal stability of a complex integral mem
protein dynamics in wild type and carotenoidless bacterial
brane protein, Arch. Biochem. Biophys., 505, 160 170,
reaction centers: studies in trehalose glasses, J. Phys.
doi: 10.1016/j.abb.2010.09.029.
Chem., 113, 10389 10398, doi: 10.1021/jp902287y.
22.
Хатыпов Р. А., Васильева Л. Г., Фуфина Т. Ю., Болга
32.
Rautter, J., Lendzian, F., Lubitz, W., Wang, S., and Allen,
рина Т. И., Шувалов В. А. (2005) Влияние замещения
J. P. (1994) Comparative study of reaction centers from
изолейцина L177 гистидином на пигментный состав и
photosynthetic purple bacteria: electron paramagnetic
свойства реакционных центров пурпурной бактерии
resonance and electron nuclear double resonance spec
Rhodobacter sphaeroides, Биохимия,
70,
15271533,
troscopy, Biochemistry, 33, 12077 12084, doi: 10.1021/
doi: 10.1007/s10541 005 0256 3.
bi00206a010.
23.
Fufina, T. Y., Vasilieva, L. G., Khatypov, R. A.,
33.
Маслова, В. А., Киселев, М. А. (2018) Структура ми
Shkuropatov, A. Y., and Shuvalov, V. A. (2007) Substitution
целл холата натрия, Кристаллография, 63, 446 450,
of isoleucine L177 by histidine in Rhodobacter sphaeroides
doi: 10.7868/S0023476118030141.
EFFECT OF DETERGENTS AND OSMOLYTES ON THERMAL STABILITY
OF NATIVE AND MUTANT Rhodobacter sphaeroides REACTION CENTERS
T. Yu. Fufina* and L. G. Vasilieva
Institute of basic biological problems, Russian Academy of Sciences, PSCBR RAS,
142290 Pushchino, Moscow Region, Russia; E/mail: tat/fufina@yandex.ru
Photosynthetic reaction center (RC) of the purple bacterium Rhodobacter sphaeroides is one of the most well studied
transmembrane pigment protein complexes. It is a relatively stable protein with established conditions for its isolation
from membranes, purification, and storage. However, it has been shown that some amino acid substitutions can affect
stability of the RC, which results in a decrease of the RCs yield during its isolation and purification, disturbs spectral
properties of the RCs during storage, and can lead to sample heterogeneity. To optimize conditions for studying mutant
RCs, the effect of various detergents and osmolytes on thermal stability of the complex was examined. It was shown that
trehalose and, to a lesser extent, sucrose, maltose, and hydroxyectoin at 1 M concentration slow down thermal denat
uration of RCs. Sodium cholate was found to have significant stabilizing effect on the structure of native and geneti
cally modified RCs. The use of sodium cholate as a detergent has several advantages and can be recommended for the
storage and investigation of the unstable mutant membrane complexes of purple bacteria in long term experiments.
Keywords: photosynthetic reaction center, thermal stability of membrane proteins, detergents, osmolytes, trehalose,
sodium cholate, Rhodobacter sphaeroides
БИОХИМИЯ том 86 вып. 4 2021
