БИОХИМИЯ, 2022, том 87, вып. 11, с. 1573 - 1583

УДК 577.25

ИЗМЕНЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ СИСТЕМЫ

ИНСУЛИН/ИНСУЛИНОПОДОБНЫХ ФАКТОРОВ РОСТА

В ПОЛЕ СА1 И ЗУБЧАТОЙ ФАСЦИИ ГИППОКАМПА

ПРИ ПРЕДЪЯВЛЕНИИ НОВОГО КОНТЕКСТА

Г.Р. Смирнова, Н.В. Баль, П.М. Балабан*

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН,

117485 Москва, Россия; электронная почта: pmbalaban@gmail.com

Поступила в редакцию 20.05.2022

После доработки 19.09.2022

Принята к публикации 19.09.2022

Формирование памяти - это сложный процесс, основанный на механизмах регуляции как функ-

ционирования синапсов, так и экспрессии генов, кодирующих инсулиноподобные факторы роста.

Мы проанализировали изменения в уровне экспрессии генов, кодирующих белки системы инсулин/

инсулиноподобных факторов роста в ранний период обучения, в дорсальной и вентральной СА1-об-

ласти и зубчатой фасции гиппокампа у мышей через час после предъявления нового контекста как

с негативным подкреплением (модель контекстного условно-рефлекторного замирания), так и без

подкрепления. Обнаружено, что при предъявлении нового контекста, независимо от сочетания с не-

гативным подкреплением, наряду с изменением уровня экспрессии хорошо известных ранних генов

с-Fos (во всех исследованных областях гиппокампа) и Arc (в дорсальной и вентральной областях СА1

и дорсальной зубчатой фасции), изменяется и уровень экспрессии гена субстрата инсулинового ре-

цептора 2, Irs2, в дорсальной области СА1 и вентральной зубчатой фасции, что свидетельствует об

участии системы инсулина/IGFs в ранних стадиях активации нейронов при предъявлении нового

контекста.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: обучение, память, Irs2, гиппокамп, транскриптом, условно-рефлекторное замирание.

DOI: 10.31857/S0320972522110045, EDN: LVITLP

ВВЕДЕНИЕ

• рецепторы: инсулиновый рецептор IR

(изоформы IR-A и IR-B), рецепторы инсулино-

В настоящее время общепринятым являет-

подобных факторов роста 1 и 2 (IGF1R, IGF2R);

ся представление о том, что формирование па-

• различные компоненты сигнальных пу-

мяти - это сложный процесс, включающий из-

тей инсулина и инсулиноподобных факторов,

менения в уровнях экспрессии генов, которые

включая субстраты инсулиновых рецепторов

приводят к долговременным функциональным

(IRS1 и IRS2);

изменениям в нейронах. Внимание нейробио-

• различные вспомогательные белки, на-

логов привлечено в последнее время к исследо-

пример, IGF-связывающие белки (IGFBPs).

ванию роли инсулин/инсулиноподобных фак-

Для некоторых из них показано участие в

торов роста (insulin-like growth factors, IGFs) в

механизмах обучения и памяти. Так, в рабо-

обучении и памяти. IGF-инсулиновая система

те Chen et al. [1] было показано, что уровень

состоит из многих компонентов, включая:

экспрессии гена Igf2 увеличивается через 20 ч

• лиганды: инсулин, инсулиноподобные

после обучения у крыс. Кроме того, показано,

факторы роста 1 и 2 (IGF1, IGF2);

что оверэкспрессия Igf2 в мозге приводила к

улучшению памяти у мышей в модели болезни

Альцгеймера [2].

Принятые сокращения: IGFs - инсулиноподобные

В работе Agis-Balboa et al. [3] продемон-

факторы роста; IGFBPs

- IGF-связывающие белки;

IR - инсулиновый рецептор; IRS1 и IRS2 - субстраты ин-

стрировано, что во время тестирования памяти,

сулиновых рецепторов.

которое можно рассматривать как старт рекон-

* Адресат для корреспонденции.

солидации памяти, наблюдается увеличение

1573

1574

ШВАДЧЕНКО и др.

уровня экспрессии гена Igf2 через час после на-

3-4 месяца вырабатывали обстановочный ус-

поминания о негативном контексте. При этом

ловно-оборонительный рефлекс пассивного

авторы отметили, что увеличение уровня экс-

избегания. Экспериментальных мышей (от-

прессии гена Igf2 в зубчатой фасции и в целом

носящихся к группе с обучением, т.е. с предъ-

гиппокампе не совпадает по своей динамике,

явлением нового контекста и электрокожной

что может свидетельствовать о регион-специ-

стимуляцией) помещали в камеру на 2 мин для

фичной регуляции экспрессии генов [3]. Также

ознакомления с обстановкой, после чего на ре-

была показана регион-специфичная экспрес-

шетку, на которой находились животные, по-

сия гена инсулинового рецептора, Ir, в разных

давался ток силой 0,8 мА и длительностью 2 с,

отделах гиппокампа после обучения: простран-

вызывающий сильную пассивно-оборонитель-

ственное обучение вызывало увеличение уров-

ную реакцию, а через 28 с животных извлекали

ня экспрессии гена Ir в CA1-области гиппокам-

из камеры. Контрольными животными были

па и снижение - в области СА3 [4].

мыши из домашней клетки (пассивный кон-

Помимо этих генов, в литературе существу-

троль) и мыши, которых помещали в экспери-

ют данные о роли других компонентов IGF-ин-

ментальную обстановку, но не подвергали воз-

сулиновой системы, таких как Irs1 [5], Irs2 [6, 7],

действию тока (активный контроль). Через час

Igfbp2 [8] в регуляции работы нервной систе-

после обучения мышь усыпляли высокой дозой

мы, памяти и синаптической пластичности.

изофлурана, затем в холодном фосфатно-со-

Однако нами не было найдено работ по

левом буфере (0,01 M; pH 7,2-7,6) на льду из

сравнению регион-специфичной экспрессии

левого полушария мозга извлекали гиппокамп

генов, вовлечённых в IGF-инсулиновую систе-

и вручную под бинокуляром выделяли из него

му в гиппокампе в первые часы после обучения.

дорсальную и вентральную области СА1 и дор-

Поэтому цель работы состояла в изучении

сальную и вентральную зубчатые фасции. Об-

уровня экспрессии генов IGF-инсулиновой си-

разцы замораживали в жидком азоте и храни-

стемы в разных отделах гиппокампа через час

лись при -80 °С.

после обучения и после предъявления ново-

Часть образцов была исключена из экс-

го контекста. В качестве исследуемых отделов

перимента из-за низкого качества или малого

гиппокампа были выбраны область СА1 и зуб-

количества выделенной РНК. В табл. 1 содер-

чатая фасция, поскольку для них неоднократно

жатся данные по количеству образцов в каждой

показана вовлечённость в процессы обучения и

исследуемой структуре.

памяти [9, 10]. Кроме того, эти структуры мож-

Выделение РНК. РНК выделяли методом

но быстро и надёжно выделить под бинокуляр-

гуанидин-тиоцианатной фенол-хлороформной

ным микроскопом. Рассматриваемые отделы

экстракции, с модификациями [17]. К заморо-

гиппокампа были также разделены на дорсаль-

женным пробам добавляли по 500 мкл реагента

ную и вентральную части, поскольку существу-

Qiazol («Qiagen», США) и измельчали с помо-

ют данные о том, что эти зоны функционально

щью гомогенизатора TissueRaptor («Qiagen»),

различны между собой [11-16].

после чего инкубировали 10-15 мин. Далее

образцы центрифугировали 10 мин (12 000 g)

при 4 °С. Затем переносили супернатант в но-

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

вые пробирки, добавляли 100 мкл хлороформа,

инкубировали 3-5 мин при комнатной тем-

Обучение животных и подготовка материала.

пературе, периодически перемешивая. После

У 54 самцов мышей линии C57Bl/6 возрастом

инкубации образцы центрифугировали 15 мин

Таблица 1. Общее количество образцов, используемых в экспериментальных группах для анализа экспрессии генов

Исследуемая структура

Экспериментальная группа

вентральная

дорсальная

вентральная

дорсальная

зубчатая

область CA1

фасция

Контроль (пассивный контроль)

Новый контекст (активный контроль)

Новый контекст и электрокожная

стимуляция (обучение)

Примечание. Общее количество экспериментальных животных - 54: пассивный контроль (21), активный контроль (17),

обучение (16).

БИОХИМИЯ том 87 вып. 11 2022

КОНТЕКСТ ВЛИЯЕТ НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ

1575

(16 000 g) при 4 °С. Водную фазу переносили

доводили до общего объёма (14 мкл) деионизи-

в новые пробирки и добавляли 250 мкл изо-

рованной водой. Для проведения реакции ис-

пропанола, 1 мкл гликогена («Thermo Fisher

пользовали амплификатор CFX 384 Real Time

Scientific», США) и инкубировали 10 мин при

PCR («BioRad», США). На основе данных по

комнатной температуре, периодически пере-

секвенированию, в качестве референсных ге-

мешивая. Полученную смесь оставляли на ночь

нов, которые продемонстрировали стабильную

при -80 °С. На следующий день смесь размора-

экспрессию в исследуемых областях гиппо-

живали и центрифугировали 30 мин (21 000 g)

кампа, были выбраны ген Hprt (кодирующий

при 4 °С. Полученный осадок дважды промы-

гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфе-

вали 80%-ным этанолом с центрифугировани-

разу-1) и ген Gpm6a (кодирующий нейрональ-

ем в течение 15 мин (16 000 g) при 4 °С. После

ный мембранный гликопротеин М6-а). По-

удаления этанола полученный осадок высуши-

следовательности праймеров для каждого гена

вали на воздухе и добавляли 12 мкл деионизи-

представлены в табл. 2.

рованной воды. Полученный раствор инкуби-

Статистическая обработка данных ПЦР

ровали 5 мин при 55 °С. Концентрацию РНК

в реальном времени. Для каждого гена в кон-

измеряли на спектрофотометре NanoDrop 2000

трольной группе определяли значение медианы

(«Thermo Fisher Scientific»).

порогового цикла, которое служило норми-

Обратная транскрипция. Перед обратной

ровочным значением в остальных группах се-

транскрипцией из полученной РНК удаляли

рии для определения относительной разницы

следовые количества ДНК. На реакцию брали

в циклах (ΔCt). Затем для всех генов интереса

1 мкг РНК, 1 мкл буфера для DNAse I (Mg²⁺)

(Igf2, c-Fos, Arc, Akt1 и Irs2) в каждом отдельном

(«Thermo Fisher Scientific»), 1 мкл DNAse I

образце было определено изменение уровня

(1 ед./мкл) («Thermo Fisher Scientific») и дово-

экспрессии относительно среднего геометри-

дили конечный объём смеси деионизирован-

ческого значения, полученного от референс-

ной водой до 10 мкл. Инкубировали 30 мин

ных генов Hprt и Gpm6a методом Eff^-ΔΔCt. Эф-

при 37 °С. Для остановки реакции добавляли

фективность реакции (Eff) для каждого гена

1 мкл ЭДТА (50 мМ) и инкубировали 10 мин

составляла от 1,8 до 2,1.

при 65 °С. Обратную транскрипцию проводи-

Формула расчёта относительной экспрессии

ли с помощью обратной транскриптазы MMLV

исследуемых генов:

(«Евроген», Россия) по инструкции производи-

Относительная экспрессия =

теля, используя смесь случайных (dN10)-прай-

меров и oligo-dT15-праймеров в присутствии

Eff(целевой ген)-ΔCt

ингибитора РНКаз (RNase Inhibitor Murine,

Геом. среднее(Eff (Hprt)-ΔCt; Eff (Gpm6a)-ΔCt)

«New England BioLabs», Англия). Полученные

пробы разводили в 16 раз для проведения ПЦР

В ходе анализа данные, полученные от групп

в реальном времени.

с предъявлением новой обстановки и с предъ-

ПЦР в реальном времени. Для проведения

явлением нового контекста и электрокожной

ПЦР в реальном времени на одну пробу бра-

стимуляцией были объединены в одну группу.

ли по 4 мкл образца, по 0,56 мкл прямого и

При статистическом анализе экспрессии каж-

обратного праймера (10 мкМ), 2,8 мкл смеси

дого гена сравнивали две группы - контроль-

qPCRmix-HS SYBR + LowROX («Евроген») и

ную группу животных из домашней клетки

Таблица 2. Последовательности праймеров (5′→3′), используемые для ПЦР в реальном времени

Ген

Прямой праймер

Обратный праймер

Hprt

GCA GTC CCA GCG TCG TG

TAA TCC AGC AGG TCA GCA AAG AAC

Gpm6a

GTG CTT CGA GTG CTG CAT TA

GTG TGT CTC CAG CAG TCC TT

Igf2

CCC TCA GCA AGT GCC TAA AG

TTA GGG TGC CTC GAG ATG TT

Fos

CCA GAG CGC CCC ATC CTT A

CTG CAG CCA TCT TAT TCC GTT CC

Arc

TGG GTG GAG TTC AAG AAG GA

AGC GTC CAC ATA CAG TGT CT

Irs2

TGG GGC AGC TGG TGG TAG TCA TA

GGG CTC TTG GGC TCT GTG GGT A

Akt1

TGG ACT ACT TGC ACT CCG AGA A

TCA TAG TGG CAC CGT CCT TGA T

БИОХИМИЯ том 87 вып. 11 2022

1576

ШВАДЧЕНКО и др.

Таблица 3. Количество образцов для полногеномного секвенирования

Левая дорсальная

Левая вентральная

Левая дорсальная

Левая вентральная

Группа

область СА1

зубчатая фасция

Контрольная группа

Экспериментальная группа

Примечание. Контрольная группа - домашняя клетка; экспериментальная группа - предъявление нового контекста с

электрокожной стимуляцией.

и экспериментальную группу животных, по-

Для подсчёта количества выравниваний в

мещаемых в новую обстановку. Выбросы, вы-

пределах генов использовалась программа

явленные после анализа, были исключены из

FeatureCounts c указанием цепь-специфичности.

дальнейших расчётов. Построение графиков

Дальнейший статистический анализ осу-

и предобработка данных проводилась с помо-

ществлялся с помощью библиотек R: DESeq2

щью библиотек Pandas, Matplotlib и Seaborn,

(анализ дифференциальной экспрессии),

языка программирования Python. Попарное

ggplot2. Порог значимости дифференциаль-

сравнение между группами проводили методом

ной экспрессии генов был установлен на уров-

Манна-Уитни.

не 0,1. В качестве дополнительного источника

Секвенирование РНК и биоинформатиче-

данных о генной онтологии использовался ре-

ский анализ. Для секвенирования на платформе

сурс Metascape. Список генов, вовлечённых в

Illumina NovaSeq были подготовлены 24 библио-

IGF-инсулиновый сигнальный путь, получен с

теки кДНК (табл. 3). По завершении секвени-

помощью geneontology.org.

рования полученные данные были очищены

от адаптерных последовательностей и участ-

ков с низким качеством прочтения (программа

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

BBMap, тримминг до Qscore > 20 с 3′-конца)

и далее картированы на геном мыши (версия

Уровень экспрессии гена Igf2 не меняется че-

Gencode) программой STAR. Среднее коли-

рез час после обучения в разных отделах гиппо-

чество прочтений на образец составило около

кампа. Мы сравнили уровень экспрессии гена

15 млн, 2/3 из которых после выравнивания со-

Igf2 в разных отделах гиппокампа у мышей че-

ставили уникальные (достоверные) прочтения.

рез час после обучения и предъявления новой

Рис. 1. Экспрессия гена Igf2 в исследуемых структурах гиппокампа. Относительный уровень экспрессии указан в %, где

значение медианы, полученное в контрольной группе, принято за 100%. Черными точками обозначены выбросы. При

сравнении уровня экспрессии гена Igf2 между экспериментальными и контрольными группами статистически значи-

мых различий обнаружено не было (тест Манна-Уитни)

БИОХИМИЯ том 87 вып. 11 2022

КОНТЕКСТ ВЛИЯЕТ НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ

1577

Рис. 2. Экспрессия гена c-Fos в исследуемых структурах гиппокампа. Относительный уровень экспрессии указан в %,

где значение медианы, полученное в контрольной группе, принято за 100%. Во всех областях между контрольной груп-

пой и объединённой группой наблюдаются достоверные отличия, * p < 0,001; тест Манна-Уитни

обстановки. Уровень экспрессии гена Igf2 до-

Также мы проверили экспрессию другого из-

стоверно не менялся после обучения ни в одной

вестного раннего гена Arc в разных структурах

из изолированных областей СА1 или зубчатой

гиппокампа. Уровень экспрессии этого гена

фасции. Значимых различий в уровне экспрес-

увеличивается во всех исследованных областях

сии этого гена обнаружено не было (рис. 1).

гиппокампа, кроме вентральной зубчатой фас-

Экспрессия немедленного раннего гена с-Fos

ции, через час после предъявления нового кон-

увеличивается во всех исследованных областях

текста, также вне зависимости от сочетания с

гиппокампа через час после предъявления но-

электрокожной стимуляцией (рис. 3).

вого контекста вне зависимости от сочетания с

Анализ экспрессии генов с помощью полно-

электрокожной стимуляцией. Чтобы проверить,

геномного секвенирования РНК в отдельных об-

влияло ли предъявление нового контекста с

ластях гиппокампа показал изменения в уровне

негативным подкреплением или без него на

экспрессии ряда генов IGF-инсулинового пути.

экспрессию генов, мы оценили уровень экс-

Чтобы найти гены, участвующие в IGF-инсу-

прессии хорошо изученного немедленного

линовом сигнальном пути, которые меняют

раннего гена с-Fos в рассматриваемых нами от-

уровень экспрессии во время обучения, мы

делах гиппокампа. В ряде работ для этого гена

провели пилотное секвенирование образцов

показано увеличение экспрессии в разных об-

гиппокампа через час после обучения. Обнару-

ластях мозга после обучения [18].

жено, что изменение уровня экспрессии мно-

Обнаружено, что предъявление новой об-

гих генов наблюдается в первую очередь в дор-

становки вызывает достоверное увеличение

сальной области СА1, в то время как в других

уровня экспрессии гена с-Fos во всех изучае-

областях наблюдается изменение уровня экс-

мых отделах гиппокампа. Стоит отметить, что

прессии только отдельных генов.

сочетание новой обстановки с электрокожной

На рис. 4, а показано, что гены, уровень

стимуляцией не оказало дополнительного эф-

экспрессии которых меняется через час после

фекта по сравнению с предъявлением только

обучения в дорсальной области СА1 гиппокам-

новой обстановки, поэтому статистический

па, относятся к различным сигнальным каска-

анализ проводился между контрольной груп-

дам и биологическим процессам, в том числе к

пой мышей и мышами, которым был предъяв-

mTOR-зависимому сигнальному пути, являю-

лен новый контекст вне зависимости от сочета-

щемуся компонентом других сигнальных путей

ния с электрокожной стимуляцией (рис. 2).

(в том числе IGF-инсулиновой системы). Для

Экспрессия немедленного раннего гена Arc

того чтобы среди всех дифференциально экс-

увеличивается в некоторых областях гиппокампа

прессируемых генов найти те, что относятся к

через час после предъявления нового контекста.

IGF-инсулиновой системе, мы загрузили спи-

БИОХИМИЯ том 87 вып. 11 2022

1578

ШВАДЧЕНКО и др.

Рис. 3. Экспрессия гена Arc в исследуемых структурах гиппокампа. Относительный уровень экспрессии указан в %, где

значение медианы, полученное в контрольной группе, принято за 100%. Во всех областях, кроме вентральной зубчатой

фасции, между контрольной группой и объединённой группой наблюдаются достоверные различия, * p < 0,001; тест

Манна-Уитни. Черными точками обозначены выбросы

Рис. 4. Анализ генной онтологии дифференциально экспрессируемых генов в дорсальной области СА1 гиппокампа

после предъявления нового контекста с электрокожной стимуляцией. а - Анализ вовлечённости дифференциально-

экспрессируемых генов в различные биологические процессы и сигнальные каскады (значение p < 0,1 после поправки

на множественное сравнение ). Данные получены с помощью ресурса Metascape. б - Изменение уровня экспрессии ге-

нов, вовлечённых в IGF-инсулин-зависимые сигнальные каскады (значение p < 0,1 после поправки на множественное

сравнение). Данные получены с помощью ресурса geneontology

сок всех генов (по порогу скорректированного

вотных (табл. 1) были отобраны два гена - Irs2

значения p < 0,1) в базу данных geneontology.org.

и Akt1. Irs2 - ген субстрата инсулинового ре-

Таким образом, были отобраны гены, входя-

цептора 2, является специфичным компонен-

щие в IGF-инсулин-связанные сигнальные

том IGF-инсулинового пути, в то время как

пути. Уровень экспрессии этих генов показан

многие другие компоненты являются общими

на рис. 4, б.

для разных нейротрофических путей. Akt1 -

Для дальнейшего анализа с помощью ПЦР

ген внутриклеточного фермента семейства

в реальном времени на большей выборке жи- протеинкиназ B, вовлечённый в регуляцию

БИОХИМИЯ том 87 вып. 11 2022

КОНТЕКСТ ВЛИЯЕТ НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ

1579

Рис. 5. Экспрессия гена Irs2 в исследуемых структурах гиппокампа. Относительный уровень экспрессии указан в %, где

значение медианы, полученное в контрольной группе, принято за 100%. В дорсальной области СА1 и в вентральной

зубчатой фасции между контрольной и объединённой группами наблюдаются достоверные различия, * p < 0,05; тест

Манна-Уитни. Черными точками указаны выбросы

Рис. 6. Экспрессия гена Akt1 в исследуемых структурах гиппокампа. Относительный уровень экспрессии указан в %, где

значение медианы, полученное в контрольной группе принято за 100%. В дорсальной области СА1 между контрольной

группой и объединённой группой с предъявлением нового контекста наблюдается тенденция к увеличению, # p < 0,1;

тест Манна-Уитни

пролиферации, роста и выживания клеток,

Уровень экспрессии гена Irs2 увеличивается

участвующий также в активации mTOR-зави-

в дорсальной области СА1 и в вентральной зуб-

симого сигнального пути. Данный ген пока-

чатой фасции через час после предъявления но-

зал наибольшее изменение уровня экспрессии

вой обстановки. Мы обнаружили, что уровень

в дорсальной области СА1 гиппокампа среди

экспрессии гена Irs2 достоверно увеличивает-

других генов IGF-инсулиновой системы после

ся при предъявлении нового контекста в дор-

анализа данных секвенирования (рис. 4, б).

сальной области СА1 и в вентральной зубчатой

БИОХИМИЯ том 87 вып. 11 2022

1580

ШВАДЧЕНКО и др.

фасции, но не в других исследуемых областях

страха, так и после предъявления новой обста-

гиппокампа (рис. 5).

новки почти во всех исследуемых отделах гип-

Уровень экспрессии гена Akt1 не меняет-

покампа. В работе Heroux et al. [27] также было

ся достоверно в изолированных областях СА1 и

показано, что предъявление новой обстановки

зубчатых фасциях через час после предъявления

без дополнительной стимуляции изменяло экс-

новой обстановки. Мы не обнаружили досто-

прессию гена c-Fos в дорсальном гиппокампе.

верных изменений экспрессии гена Akt1 в ис-

Интересно, что мы не заметили отличий между

следуемых областях гиппокампа, хотя наблю-

предъявлением новой обстановки и сочетанием

дается тенденция к увеличению экспрессии

новой обстановки с электрокожной стимуляци-

гена Akt1 в дорсальной области СА1 (скоррек-

ей, поэтому обе эти экспериментальные группы

тированное значение p = 0,07; рис. 6).

были объединены в одну в процессе анализа по-

лученных данных. Возможно, отсутствие разли-

чий между описанными выше группами связа-

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

но с особенностями протокола эксперимента, в

частности, слабым уровнем приручения мышей.

Гиппокамп

- это многокомпонентный

Поскольку было показано, что при консо-

отдел мозга, в котором наблюдаются морфо-

лидации памяти и при напоминании происхо-

функциональные различия как вдоль дорсо-

дит активация одних и тех же генов, например

вентральной оси, что обусловлено различными

гена c-Fos, мы решили проверить, будут ли на-

связями дорсальной и вентральной частей гип-

блюдаться подобные изменения во время об-

покампа с другими отделами мозга, так и вдоль

учения и в уровне экспрессии гена Igf2, так как

поперечной оси, что обусловлено хорошо опи-

ранее подобные изменения наблюдались через

санной структурированностью гиппокампа и

час после напоминания [3]. Мы не обнаружи-

делением его на области СА1, СА2, СА3 и зуб-

ли достоверных различий в уровне экспрессии

чатую фасцию [9, 19, 20]. Разные области гип-

этого гена между группами через час после об-

покампа отличаются нейрохимическими изме-

учения или предъявления нового контекста.

нениями при стрессе и нейропатологиях [11].

Анализ экспрессии других генов IGF-инсули-

Однако при исследовании экспрессии ге-

нового пути с помощью исследования тран-

нов функциональные различия между облас-

скриптома показал, что уровень экспрессии

тями гиппокампа часто не учитываются [21],

некоторых генов меняется через час после об-

хотя в некоторых работах авторы наблюдали

учения в модели условно-рефлекторного страха

различия в уровне экспрессии генов в отдель-

в первую очередь в дорсальной области СА1.

ных частях гиппокампа в ходе экспериментов

Дальнейший анализ уровня экспрессии генов

с обучением и модификацией памяти [3, 22,

с помощью ПЦР в реальном времени на выборке

23]. Например, в работе по изучению динами-

из 54 животных продемонстрировал достоверное

ки накопления белков c-Fos и Arc в клетках

повышение уровня экспрессии гена субстрата

мозга мышей после обучения были показаны

инсулинового рецептора 2 в дорсальной области

временные различия в увеличении экспрессии

СА1 и вентральной зубчатой фасции.

этих белков для разных областей гиппокампа

Ряд данных указывает на участие гена Irs2

(области CA1, CA3 и зубчатой фасции) [24].

в процессе формирования памяти и развитии

Подобные различия в количестве c-Fos-поло-

мозговых структур. Мыши с полным нокау-

жительных клеток после обучения (электро-

том Irs2 в мозге демонстрировали улучшение

кожной стимуляции) были показаны и для ряда

пространственной памяти после предъявления

областей гиппокампа у крыс, в частности, для

нового контекста в сочетании с электрокожной

области CA1 и зубчатой фасции [25]. Также в

стимуляцией. В той же работе было показано,

одной из работ с помощью метода гибридиза-

что при полной делеции гена Irs2 в головном

ции in situ было показано различие в накопле-

мозге увеличивалась экспрессия белка-марке-

нии клетками мРНК гена Arc в дорсальной и

ра активных синапсов и плотность дендритных

вентральной частях СА1, СА3 и DG-областях

шипиков в области СА1 гиппокампа, что может

гиппокампа через 30 мин после обучения с

оказывать положительный эффект на форми-

помощью электрокожной стимуляции. Полу-

рование памяти. Из этих данных авторы вы-

ченные в статье данные говорят о достоверном

двигают предположение о негативном влиянии

увеличении экспрессии гена Arc лишь в дор-

Irs2 на процесс обучения [7]. Однако в другой

сальных областях гиппокампа [26].

работе, где рассматривалось влияние нокаута

В настоящей работе мы показали, что экс-

гена Irs2 на эмбриональное развитие мышей,

прессия генов c-Fos и Arc меняется после об-

отмечались морфологические изменения моз-

учения как в модели условно-рефлекторного

га, проявлявшиеся в уменьшении размера не-

БИОХИМИЯ том 87 вып. 11 2022

КОНТЕКСТ ВЛИЯЕТ НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ

1581

которых структур мозга, из чего было выдви-

Полученные результаты требуют дальней-

нуто предположение об уменьшении скорости

шего изучения с увеличением числа исследуемых

пролиферации нейронов в ходе развития мозга

образцов и вовлечением других временных точек

у нокаутных мышей [6].

для более полного понимания процессов, проис-

Интересно, что регуляторные участки

ходящих в отдельных областях гиппокампа при

гена Irs2 содержат области, которые могут ре-

предъявлении новой обстановки и обучения.

гулировать его индуцибельную экспрессию.

В частности, в работе Persaud et al. [28] де-

монстрируется, что каскад активации Ca²⁺/

Вклад авторов. Н.В. Баль, П.М. Бала-

CaMK(IV)/CREB регулирует экспрессию гена

бан

- концепция и руководство работой;

Irs2, но не Irs1 в бета-клетках поджелудочной

А.М. Швадченко, М.В. Волобуева, В.О. Ива-

железы. Таким образом, ген Irs2 может быть

нова, Г.Р. Смирнова, Н.В. Баль - проведение

мишенью для кальций-зависимой регуляции.

экспериментов; А.П. Белецкий, Н.В. Баль

В другой работе было показано, что изменение

статистический анализ; А.М. Швадченко,

уровня экспрессии гена Irs2 после напомина-

М.В. Волобуева, Н.В. Баль, А.П. Белецкий,

ния в модели активного избегания наблюда-

П.М. Балабан - обсуждение результатов ис-

лось лишь в зубчатой фасции гиппокампа, но

следования; Н.В. Баль, А.М. Швадченко - на-

не в поле СА1 [22].

писание текста; П.М. Балабан, Н.В. Баль,

В настоящей работе мы обнаружили, что

А.М. Швадченко - редактирование текста статьи.

несмотря на сходство в активации ряда иссле-

Финансирование. Работа поддержана Ми-

дуемых генов, таких как c-Fos и Arc, экспрессия

нистерством науки и образования РФ (грант

гена Irs2 носит более локальный характер. Это

№ 075-15-2020-801) и Российским научным

можно объяснить как особенностями коннек-

фондом (грант

№ 18-75-10112, исследова-

тома этих областей, так и различиями в физио-

ния гена Irs2).

логии пирамидальных клеток области СА1,

Конфликт интересов. Авторы заявляют об

гранулярных и других клеток зубчатой фасции.

отсутствии конфликта интересов.

Таким образом, нам удалось показать до-

Соблюдение этических норм. Все принятые

стоверные изменения уровня экспрессии гена

международные, национальные и институцио-

Irs2 в отдельных областях гиппокампа в одной

нальные принципы ухода и использования жи-

временной точке.

вотных были соблюдены.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Chen, D. Y., Stern, S. A., Garcia-Osta, A., Saunier-

6. Schubert, M., Brazil, D., Burks, D., Kushner, J., Ye, J.,

Rebori, B., Pollonini, G., et al. (2011) A critical role for

et al.

(2003) Insulin receptor substrate-2 defi-

IGF-II in memory consolidation and enhancement,

ciency impairs brain growth and promotes tau

Nature, 469, 491-497, doi: 10.1038/nature09667.

phosphorylation, J. Neurosci.,

23,

7084-7092,

2. Pascual-Lucas, M., Viana da Silva, S., Di Scala, M.,

doi: 10.1523/JNEUROSCI.23-18-07084.2003.

Garcia-Barroso, C., González-Aseguinolaza, G.,

7. Irvine, E. E., Drinkwater, L., Radwanska, K., Al-

et al. (2014) Insulin-like growth factor 2 reverses

Qassab, H., Smith, M. A., et al. (2011) Insulin

memory and synaptic deficits in APP transgenic

receptor substrate 2 is a negative regulator of memory

mice, EMBO Mol. Med., 6, 1246-1262, doi: 10.15252/

formation, Learn. Mem., 18, 375-383, doi: 10.1101/

emmm.201404228.

lm.2111311.

3. Agis-Balboa, R. C., Arcos-Diaz, D., Wittnam, J.,

8. Khan, S. (2019) IGFBP-2 signaling in the brain: from

Govindarajan, N., Blom, K., et al. (2011) A hippo-

brain development to higher order brain functions,

campal insulin-growth factor 2 pathway regulates the

Front. Endocrinol. (Lausanne), 10, 822, doi: 10.3389/

extinction of fear memories, EMBO J., 30, 4071-4083,

fendo.2019.00822.

doi: 10.1038/emboj.2011.293.

9. Gilbert, P., Kesner, R., and Lee, I. (2001) Dissociating

4. Dou, J. T., Chen, M., Dufour, F., Alkon, D. L., and

hippocampal subregions: a double dissociation

Zhao, W. Q. (2005) Insulin receptor signaling in long-

between dentate gyrus and CA1, Hippocampus, 11,

term memory consolidation following spatial learning,

626-636, doi: 10.1002/hipo.1077.

Learn Mem., 12, 646-655, doi: 10.1101/lm.88005.

10. Hunsaker, M., and Kesner, R. (2008) Evaluating the

5. Zhao, W. Q., Chen, H., Quon, M. J., and Alkon, D. L.

differential roles of the dorsal dentate gyrus, dorsal

(2004) Insulin and the insulin receptor in experimental

CA3, and dorsal CA1 during a temporal ordering for

models of learning and memory, Eur. J. Pharmacol.,

spatial locations task, Hippocampus, 18, 955-964,

490, 71-81, doi: 10.1016/j.ejphar.2004.02.045.

doi: 10.1002/hipo.20455.

БИОХИМИЯ том 87 вып. 11 2022

1582

ШВАДЧЕНКО и др.

11.

Gulyaeva, N. V. (2019) Functional neurochemistry of

hippocampus during memory formation, Science, 350,

the ventral and dorsal hippocampus: stress, depres-

82-87, doi: 10.1126/science.aac7368.

sion, dementia and remote hippocampal damage,

22.

Harris, R. M., Kao, H-Y., Alarcón, J. M., Fenton,

Neurochem. Res.,

44,

1306-1322, doi:

10.1007/

A. A., and Hofmann, H. A. (2020) Transcriptome

S11064-018-2662-0.

analysis of hippocampal subfields identifies gene

12.

Strange, B., Witter, M., Lein, E., and Moser, E.

expression profiles associated with long-term active

(2014) Functional organization of the hippocampal

place avoidance memory, bioRxiv, 2020.02.05.935759,

longitudinal axis, Nat. Rev. Neurosci., 15, 655-669,

doi: 10.1101/2020.02.05.935759.

doi: 10.1038/nrn3785.

23.

Katzman, A., Khodadadi-Jamayran, A., Kapeller-

13.

Bannerman, D., Rawlins, J., McHugh, S., Deacon,

Libermann, D., Ye, X., Tsirigos, A., et al.

(2021)

R., Yee, B. K., et al. (2004) Regional dissociations

Distinct transcriptomic profiles in the

dorsal

within the hippocampus - memory and anxiety,

hippocampus and prelimbic cortex are transiently

Neurosci. Biobehav. Rev., 28, 273-283, doi: 10.1016/

regulated following episodic learning, J. Neurosci., 41,

j.neubiorev.2004.03.004.

2601-2614, doi: 10.1523/JNEUROSCI.1557-20.2021.

14.

Fanselow, M., and Dong, H., (2010) Are the dorsal and

24.

Ivashkina, O., Toropova, K., Ivanov, A., Chekhov, S.,

ventral hippocampus functionally distinct structures?

and Anokhin, K. (2016) Waves of c-Fos and Arc

Neuron, 65, 7-19, doi: 10.1016/j.neuron.2009.11.031.

proteins expression in neuronal populations of the

15.

Moser, M., and Moser, E.

(1998) Functional

hippocampus in response to a single episode of new

differentiation in the hippocampus, Hippocampus,

experience, Bull. Exp. Biol. Med.,

160,

729-732,

8, 608-619, doi: 10.1002/(SICI)1098-1063(1998)8:6

doi: 10.1007/S10517-016-3296-3.

<608::AID-HIPO3>3.0.CO;2-7.

25.

Murawski, N., Klintsova, A., and Stanton, M. (2012)

16.

Kenney, J., Raybuck, J., and Gould, T.

(2012)

Neonatal alcohol exposure and the hippocampus in

Nicotinic receptors in the dorsal and ventral

developing male rats: effects on behaviorally induced

hippocampus differentially modulate contextual

CA1 c-Fos expression, CA1 pyramidal cell number,

fear conditioning, Hippocampus,

22,

1681-1690,

and contextual fear conditioning, Neuroscience, 206,

doi: 10.1002/hipo.22003.

89-99, doi: 10.1016/J.NEUROSCIENCE.2012.01.006.

17.

Chomczynski, P., and Sacchi, N. (1987) Single-

26.

Chawla, M., Sutherland, V., and Olson, K. (2018)

step method of RNA isolation by acid guanidinium

Behavior-driven Arc expression is reduced in all

thiocyanate-phenol-chloroform extraction, Anal.

ventral hippocampal subfields compared to CA1,

Biochem., 162, 156-159, doi: 10.1006/abio.1987.9999.

CA3 and dentate gyrus in rat dorsal hippocampus,

18.

Анохин К. В. (1992) «Ранние гены» в механизмах

Hippocampus, 28, 178-185, doi: 10.1002/hipo.22820.

обучения и памяти, Диcс. докт. биол. наук, МГУ,

27.

Heroux, N., Osborne, B., Miller, L., Kawan, M.,

Москва.

Buban, K., et al. (2018) Differential expression of

19.

Aimone, J., Deng, W., and Gage, F. (2011) Resolving

the immediate early genes c-Fos, Arc, Egr-1, and

new memories: a critical look at the dentate gyrus,

Npas4 during long-term memory formation in the

adult neurogenesis, and pattern separation, Neuron,

context preexposure facilitation effect (CPFE),

70, 589-596, doi: 10.1016/J.NEURON.2011.05.010.

Neurobiol. Learn. Mem., 147, 128-138, doi: 10.1016/

20.

Cembrowski, M., Wang, L., Sugino, K., Shields, B.,

J.NLM.2017.11.016.

and Spruston, N. (2016) Hipposeq: a comprehensive

28.

Persaud, S., Liu, B., Sampaio, H., Jones, P., and

RNA-seq database of gene expression in hippocampal

Muller, D.

(2011) Calcium/calmodulin-dependent

principal neurons, Elife, 5, e14997, doi: 10.7554/

kinase IV controls glucose-induced Irs2 expression

ELIFE.14997.

in mouse beta cells via activation of cAMP response

21.

Cho, J., Yu, N., Choi, J.-H., Sim, S., Kang, S. J.,

element-binding protein, Diabetologia, 54, 1109-1120,

et al. (2015) Multiple repressive mechanisms in the

doi: 10.1007/S00125-011-2050-7.

NEW CONTEXT SIGNIFICANTLY CHANGES EXPRESSION

OF Irs2 GENE IN HIPPOCAMPAL AREAS

A. M. Shvadchenko, M. N. Volobueva, V. O. Ivanova, A. P. Beletskiy,

G. R. Smirnova, N. V. Bal, and P. M. Balaban*

Institute of Higher Nervous Activity and Neurophysiology, Russian Academy of Sciences,

117485 Moscow, Russia; E-mail: pmbalaban@gmail.com

Memory formation is a complex process involving changes in the synaptic activity and gene expression encoding

the insulin-like growth factors. We analyzed changes in the expression of genes encoding the insulin/insulin-

БИОХИМИЯ том 87 вып. 11 2022