Агрохимия, 2023, № 2, стр. 79-86

ВВЕДЕНИЕ

Яблоки – одни из наиболее распространенных фруктов, присутствующих в нашем рационе круглый год. Они содержат минимальный уровень сахара и богаты питательными веществами, включая пектин, витамины, минералы, антиоксиданты, флавоноиды, танины, дубильные вещества, каждый из которых необходим для нормального функционирования организма. Например, пектин помогает улучшить работу желудочно-кишечного тракта, а минералы нужны для метаболизирования избытка соли в организме [1]. Известно, что флавоноиды способны предотвращать развитие раковых клеток. Благодаря наличию антиоксидантов, которые сдерживают процессы окисления, и танинов, обладающих противовоспалительным действием, данный фрукт помогает предотвратить различные хронические заболевания, такие как астма и ишемическая болезнь сердца [2, 3]. Однако даже столь полезный фрукт может нанести вред здоровью человека при наличии в нем остаточных количеств ядохимикатов (инсектицидов, гербицидов, пиретроидов), которые применяют в сельском хозяйстве для защиты большинства культур от вредителей [4].

Пестициды – это вещества или смеси соединений, которые используют для борьбы с вредителями, включая насекомых, сорняки и микроорганизмы [5, 6]. Ежегодно во всем мире для борьбы с вредителями и болезнями многих фруктовых и овощных культур используется огромное количество пестицидов. По этой причине, помимо присутствия в окружающей среде, данные ядохимикаты часто оказываются и в пищевых продуктах [7, 8].

На сегодняшний день выращивание яблок в большинстве случаев не обходится без применения пестицидов, необходимых для обеспечения роста и сохранности урожая. Чрезмерное применение этих соединений может привести к наличию их остаточных количеств в плодах после сбора урожая [9]. Следует учитывать, что в сухих условиях и при низких температурах период полураспада пестицидов увеличивается. Их остаточные количества могут нанести значительный ущерб здоровью потребителей [10].

В связи с этим необходимо проводить контроль содержания остаточных количеств ядохимикатов в окружающей среде и пищевых продуктах. Для идентификации и количественной оценки применяемых пестицидов требуются быстрые и удобные методы определения, среди которых основными на сегодняшний день являются газовая (ГХ) и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) в сочетании с масс-спектрометрией (МС) [11, 12]. Одним из часто применяемых способов пробоподготовки проб при анализе остатков пестицидов является QuEChERS и его модификации, к преимуществам которых относится высокие пропускная способность образца и степень извлечения целевых аналитов, низкое потребление растворителя и короткое время анализа [13, 14]. При этом, несмотря на значительные преимущества, метод требует адаптации для каждого вида матриц, необходимо улучшать условия хроматографического разделения и пробоподготовки целевых аналитов для анализа остаточных количеств пестицидов различных классов.

Исходя из вышеизложенного, цель работы – адаптация способа QuEChERS при определении остаточных количеств пестицидов (в первую очередь хлорорганических (ХОП) и фосфорорганических (ФОП)) в образцах яблок с применением ГХ–МС.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Инструментальная часть. Работу проводили на газовом хроматографе “Хроматэк Кристалл 5000”, снабженном масс-спектрометрическим детектором, кварцевой капиллярной колонкой “Chromatec CR-5ms” 30 м × 0.25 мм × 0.25 мкм, и автоматическим дозатором пробы ДАЖ-2М 3D производства фирмы “Хроматэк” (Россия), с регистрацией масс-спектров электронной ионизации (энергия электронов 70 эВ) в диапазоне соотношений m/z = 35–600, при оптимальных условиях газохроматографического разделения (табл. 1). Обработку данных хромато-масс-спектрометрических анализов осуществляли с помощью программного обеспечения “Хроматэк Аналитик” и электронной библиотеки масс-спектров “NIST 2020” (США).

Реагенты и объекты исследования. Использовали следующие аналитические стандарты: α-ГХЦГ, β-ГХЦГ, γ-ГХЦГ производства “ХромЛаб” (Россия), диметоат, фозалон, хлорпирифос производства НПК “БЛОК-1” (Россия), сульфат магния безводный, ацетат натрия, ацетонитрил марки “х.ч.”, PSA (сорбент, содержащий в качестве привитой группы алкиламин с двумя различными NH₂-группами), Florisil (сорбент, являющийся силикатом магния).

Пробоподготовка. В качестве объектов исследования были отобраны образцы яблок различных сортов и стран происхождения урожая осени 2021 г. Подготовку проб к анализу осуществляли по классической методике QuEChERS (рис. 1). Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета анализа данных Microsoft Exel.

Рис. 1.

Схема пробоподготовки способом QuEChERS для определения пестицидов методом ГХ–МС.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Метод ГХ–МС был выбран для качественного и количественного определения содержания ХОП и ФОП в связи с его высокой чувствительностью, точностью и способностью детектировать низкие концентрации исследуемых пестицидов. При этом были проработаны различные вариации настройки масс-спектрометрического детектора и газового хроматографа с целью подбора оптимальных условий анализа. Предел количественного определения (ПКО) ХОП (ГХЦГ, α-, β- и γ- изомеры) составил 0.5 мкг/кг, ФОП (диметоат, фозалон, хлорпирифос) – 7.5 мкг/кг.

Для достижения поставленной цели исследования рассматривали влияние матричного эффекта на полноту извлечения пестицидов из экстракта яблок. В качестве эталонной матрицы были выбраны экстракты, предварительное исследование которых показало отсутствие остаточных количеств пестицидов класса ХОП и ФОП.

Способ пробоподготовки QuEChERS включает экстракцию ацетонитрилом с добавлением солей и следующую за ней стадию отчистки экстракта. При проведении последней были апробированы различные сочетания сорбентов PSA и Florisil с целью оптимизации процессов удаления сопутствующих веществ из конечного экстракта, оказывающих негативное влияние на уровень фонового шума и способных перекрывать сигналы хроматографических пиков целевых аналитов. В результате проведенных исследований наблюдали значительные матричные помехи при использовании картриджа с PSA + MgSO₄. Добавление сорбента Florisil на стадии очистки привело к снижению фонового шума и уменьшению аналитических помех от матрицы.

Ацетонитрильный экстракт матрицы, согласно полученным масс-спектрам, содержал небольшие количества соединений различных классов, включая производные многоатомных спиртов и жирных кислот (рис. 2).

Рис. 2.

Хроматограмма полного ионного тока ацетонитрильного экстракта из яблок, полученная способом QuEChERS и с применением картриджа Florisil + MgSO₄ (1 – диоксим этандиола, 2, 3 – изомеры октандиола, 4, 5, 9, 11 – фаза капиллярной колонки, 6 – пальмитиновая кислота и ее производные, 7 – стеариновая кислота и ее производные, 8 – олеиновая кислота и ее производные, 10 – бензойной кислоты, 4-[7-(4-гептилфенил)-1,2,3,4-тетрагидро-1,3-диметил-2,4-диоксо-8H-имидазо [2,1-f]пурин-8-ил]-, 12, 13, 14 – неидентифицированные соединения, 15 – фенол, 2,2'‑метилен, бис[6-(1,1-диметилэтил)-4-метил-).

Исследования полноты извлечения проводили методом “введено–найдено” с использованием широко применяемых для защиты плодовых и плодово-ягодных культур хлорорганических (α-ГХЦГ, β-ГХЦГ, γ-ГХЦГ) и фосфорорганических пестицидов (диметоат, фозалон, хлорпирифос) (рис. 3). Образцы для проведения хроматографического исследования готовили в четырехкратной повторности. Идентификацию компонентов проводили по временам удерживания и характеристическим ионам в базе электронной библиотеки масс-спектров “NIST 2020” (рис. 4), количественное определение – методом абсолютной калибровки.

Рис. 3.

Хроматограмма полного ионного тока ацетонитрильного экстракта из яблок, полученная способом QuEChERS и с применением картриджа Florisil + MgSO₄, предварительно контаминированного 6-ю пестицидами (0.1 мкг/мл).

Рис. 4.

Масс-спектры определяемых пестицидов: (а) – диметоат, (б) – хлорпирифос, (в) – фозалон, (г) – α-ГХЦГ, β-ГХЦГ и γ-ГХЦГ.

Установили, что при использовании на стадии очистки экстракта картриджа с PSA + MgSO₄ полнота извлечения каждого из контаминантов была не высокой (табл. 2). Комбинирование сорбентов PSA + Florisil + MgSO₄ позволило получить извлечение искомых аналитов >72%. Наиболее эффективным для фруктовых матриц оказалось применение Florisil + MgSO₄, с помощью которого удалось получить высокие величины исследованного показателя (>81%). Таким образом, полученные результаты показали, что данный метод применим для анализа и количественного определения ХОП и ФОП в семечковых плодах.

В торгово-розничных сетях г. Казани были отобраны образцы яблок разных сортов и стран происхождения для определения содержания в них осточных количеств ХОП и ФОП с применением пробоподготовки QuEChERS и очисткой экстракта с использованием Florisil + MgSO₄.

Как правило, импортные яблоки обрабатывают воском, что увеличивает сроки хранения данного продукта и улучшает товарный вид, придавая им глянцевый блеск. В исследованиях многих авторов отмечено, что яблоки, покрытые воском, в большинстве случаев содержат ядохимикаты. Например, в работе [15] представлены результаты исследования растительной продукции, в частности яблок, на содержание ХОП, в ходе которых были обнаружены остаточные количества α-ГХЦГ (0.08 мг/кг), β-ГХЦГ (0.08 мг/кг), ДДТ (0.007–0.04 мг/кг) и гептахлора (0.008–0.013 мг/кг). Также при исследовании яблочных выжимок [16] было выявлено наличие ГХЦГ (α-, β-, γ-изомеров) в количестве <0.03 мг/кг и ДДТ и его метаболитов в количестве <0.06 мг/кг.

Известно, что кожура яблок способна поглощать пестициды, которые с ее поверхности могут проникнуть внутрь плода. Таким образом, на внешней поверхности яблок, возможно, более высокое содержание пестицидов, что подтверждено исследованиями многих авторов [17–19]. В связи с этим в настоящей работе исследования мякоти и кожуры каждого образца были проведены отдельно. Образцы (мякоть, кожура) для проведения хроматографического анализа готовили в шестикратной повторности для каждого сорта.

В образцах яблок (мякоть и кожура), подвергшихся исследованию, остаточных количеств пестицидов не было выявлено на уровне чувствительности примененного метода (табл. 3). Исходя из полученных результатов можно заключить, что яблоки, подвергшиеся исследованию, были безопасными для здоровья потребителей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, показано, что использование пробоподготовки QuEChERS с последующим ГХ–МС-анализом является эффективным и надежным методом для одновременного определения ряда хлорорганических (ХОП) и фосфорорганических (ФОП) пестицидов в плодах яблони. В результате экспериментальной апробации различных сорбентов при пробоподготовке способом QuEChERS установлено, что использование на стадии очистки экстракта Florisil + MgSO₄ способствовало эффективному удалению матричных помех и получению полноты извлечения в диапазоне от 81 до 91% в зависимости от исследованного аналита. Предлагаемый метод был успешно применен для определения остаточных количеств пестицидов в образцах яблок.