Журнал аналитической химии, 2022, T. 77, № 8, стр. 742-747

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объекты исследования. Применяли антибиотики β-лактамного ряда цефалексин и амоксициллин (Sigma Aldrich, США). Исходные растворы антибиотиков с концентрацией 8 и 16 мг/мл готовили растворением навески препарата в фосфатном буферном растворе (рН 7.4). Рабочие растворы готовили в день проведения эксперимента разбавлением исходного раствора.

Определяли содержание антибиотиков в лекарственных препаратах амоксициллина (форма выпуска – таблетки “АВВА Рус”, Россия, 250 мг) и цефалексина (форма выпуска – капсулы “Hemofarm”, Сербия, 500 мг). Для приготовления раствора с концентрацией 1 мг/мл навеску препарата растворяли в 25 мл дистиллированной воды, отделяли от нерастворимых компонентов фильтрованием.

Реактивы и материалы. Спиртовый 0.05 М раствор нингидрина (Реахим, Россия) готовили растворением навески препарата в этаноле.

В качестве матрицы для создания тест-средств применяли целлюлозную бумагу (фильтры обеззоленные “синяя лента”, ТУ 2642-001-13927158-2003). Для получения индикаторных бумаг фильтр размером 5 × 5 см погружали на 3 мин в свежеприготовленный спиртовый раствор нингидрина, высушивали на воздухе. Полученная индикаторная бумага имела белый цвет.

Оборудование и методы исследования. Спектры диффузного отражения регистрировали на двулучевом сканирующем спектрофотометре Shimadzu UV-1800 (Япония), диапазон измерения 200−800 нм, прибор укомплектован приставкой зеркального отражения. Измеренные значения диффузного отражения (R) пересчитывали в функцию Гуревича–Кубелки–Мунка (F) по формуле: F = (1 – R)²/(2R).

Спектры поглощения регистрировали на двулучевом сканирующем спектрофотометре Shimadzu UV-1800 (Япония), диапазон измерения 200−800 нм, интервал измерения 1 нм. Использовали pН-метр pH-150МА (Россия).

Методики. Для определения оптимальной температуры проведения тест-реакции готовили серию индикаторных бумаг, на которые наносили определяемый антибиотик с концентрацией 7 мг/мл, помещали на 10 мин в сушильный шкаф (SNOL 58/350, Литва) при температуре от 60 до 110°С. Далее тест-средство помещали в бокс размером 22 × 23 × 24 см c двумя полосками светодиодного освещения (5 V, 1 A), фотографировали 13-мегапиксельной камерой смартфона Redmi 6A.

Цветометрическую обработку изображений тест-средств осуществляли в программе Adobe Photoshop^®. Для этого часть изображения усредняли с помощью фильтра “Аverage” и определяли интенсивность цветовых каналов.

Интервал ненадежности и предел обнаружения определяли по методике [8]: готовили три тест-шкалы с концентрациями антибиотика от 0.1 до 1.4 мг/мл с шагом Δс = 0.1 мг/мл. Присутствие аналита визуально оценивали 15 наблюдателей (n = 45). Определяли вероятность обнаружения антибиотика по формуле: P(c_i) = n_i/N_i, где P(c_i) – вероятность обнаружения антибиотика, n_i – число положительных ответов наблюдателей о появлении фиолетовой окраски тест-средства, N_i – общее число ответов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Взаимодействие амоксициллина и цефалексина с нингидрином на поверхности бумаги. Выбор оптимальных условий экспресс-определения. Для качественной реакции на амоксициллин и цефалексин при создании тест-средств выбрали взаимодействие антибиотиков с нингидрином (Схема 1 ). Нингидрин (трикетогидринденгидрат) широко применяют при определении аминов, аминокислот и тиофена [9]. Маккалдин предположил [10], что реакции нингидрина с аминами, аминокислотами и иминокислотами протекают по одному и тому же механизму с образованием дикетогидриндилиден−дикетогидриндамина или пурпура Руэманна. Схема 1 иллюстрирует предполагаемый ход реакции амоксициллина и цефалексина с нингидрином, включающий окислительное дезаминирование первичной аминогруппы с последующей конденсацией восстановленного нингидрина с образованием окрашенного продукта реакции пурпурного цвета с λ_max 560−570 нм.

Для исследования реакции на поверхности твердой матрицы применяли метод спектроскопии диффузного отражения. На рис. 1 представлены спектры диффузного отражения в виде функции Гуревича–Кубелки–Мунка (F) для систем амоксициллин/цефалексин–иммобилизованный нингидрин. Как видно, в спектрах изучаемых систем появляется полоса при 410–420 нм и широкая полоса с максимумом при 560–570 нм, что согласуется с данными [11, 12] для аналогичных систем.

Схема 1 . Схема взаимодействия антибиотиков с нингидрином.

Рис. 1.

Спектры диффузного отражения в виде функции Гуревича–Кубелки–Мунка для систем цефалексин–иммобилизованный нингидрин (1), амоксициллин–иммобилизованный нингидрин (2), иммобилизованный нингидрин (3) (с_Amox = с_Ceph =  8 мг/мл, 90°C, 20 мин).

При подборе оптимальных условий экспресс-определения на поверхности целлюлозной матрицы исследовали влияние температуры и времени проведения реакции (рис. 2а, 2б). Для выбора оптимальной температуры проведения тест-реакции строили зависимость изменения интенсивностей цветового канала Green (ΔGreen) от температуры нагревания индикаторных бумаг по сравнению с контрольным образцом (рис. 2а). Как видно, с увеличением температуры нагревания от 60 до 100°С значения ΔGreen увеличиваются и при 100−110°С принимают максимальные значения. Зависимость изменения интенсивностей канала Green от времени нагревания тест-средств (рис. 2б) показала, что через 15–20 мин их значения достигают максимума, и окраска при этом максимальна.

Рис. 2.

Зависимости изменения интенсивностей цветового канала Green от температуры (а) и от времени нагревания (б) тест-средств: 1 – цефалексин, 2 – амоксициллин (с_Amox = с_Ceph = 7 мг/мл, рН 7.4).

Визуально-колориметрическое определение. При тест-определении анализируемый раствор антибиотика наносили на индикаторную бумагу с иммобилизованным нингидрином, высушивали при 100 ± 2°С в течение 15 мин. Наблюдали появление фиолетового окрашивания, интенсивность которого увеличивалась с увеличением концентрации антибиотика. Концентрации антибиотиков для приготовления цветовой шкалы подбирали таким образом, чтобы ширина шага шкалы позволяла визуально распознавать изменение окраски двух ближайших концентраций и не приводила к бόльшей погрешности определения. В результате выбрали оптимальный шаг, при котором каждая последующая концентрация отличается от предыдущей в два раза.

Предел обнаружения (ПО) определяли как правую границу интервала ненадежности (ИН) при вероятности обнаружения 99%. При определении интервала ненадежности строили зависимости вероятностей обнаружения (Рс) антибиотика от его концентрации (рис. 3). Для проверки гипотезы о законе распределения экспериментальных данных проанализировали зависимости функций нормального, логнормального, экспоненциального распределений и распределения экстремального значения первого рода (Вейбулла) от концентрации антибиотиков. Полученные значения коэффициентов корреляции уравнений прямых составляли ≥0.93, что подтверждает согласованность экспериментальных данных с функциями распределения и правильность выбранного диапазона ИН. Некоторые метрологические характеристики (диапазон определяемых содержаний (ДОС), ИН, ПО) разработанной методики визуальной оценки представлены в табл. 1.

Рис. 3.

Вероятности обнаружения цефалексина (1) и амоксициллина (2).

Цветометрическое определение. Цветометрическую обработку изображений тест-средств осуществляли в программе Adobe Photoshop^®, для этого часть изображения усредняли с помощью фильтра “Аverage” и определяли интенсивность каналов модели RGB (Red-Green-Blue). Получили линейные зависимости интенсивностей каналов Red, Green и Blue от lgc и c (рис. 4).

Рис. 4.

Зависимости изменения интенсивности (ΔI) цветовых каналов Red (♦) Green (■), Blue (▲) от lgc цефалексина (а) и амоксициллина (б); от c (мг/мл) цефалексина (в) и амоксициллина (г).

Для цефалексина зависимости интенсивностей цветовых каналов от lgс линейны в области 0.5–8 мг/мл и 0.125–1 мг/мл для зависимостей ΔI–с (рис. 4а, 4в). Для амоксициллина зависимости ΔI – lg с линейны в области 1–16 мг/мл (0.5–16 мг/мл для канала Green) и 0.125–2 мг/мл для зависимостей ΔI–с (рис. 4б, 4г). В качестве оптимального (по чувствительности и коэффициенту регрессии) выбрали канал Green при определении Сeph и Аmox. Предел обнаружения цефалексина составил 0.08 мг/мл, амоксициллина – 0.09 мг/мл.

По полученным цветовым шкалам строили профили лепестковых диаграмм (ЛД) в координатах цветовых каналов моделей RGB, CMYK, HSV (рис. 5а, 5б). Рассчитывали периметр (Р) и площадь (S) профилей ЛД в MS Excel по формулам: Р = √(а² + b² – 2аb cos(ab), S = a + b sin(ab), где a, b – стороны треугольника, cos(ab) – косинус угла между сторонами а, b, sin(ab) – синус угла между сторонами а, b.

Рис. 5.

Профили лепестковых диаграмм в координатах цветовых каналов R, G, B, C, M, K, V систем цефалексин (а), амоксициллин (б) – иммобилизованный нингидрин (с, мг/мл).

Получили линейные зависимости периметра (y = –292x + 748, r² = 0.98 и y = –291x + 837, r² = = 0.98) и площади (y = –39496x + 56166, r² = 0.98 и y = –39849x + 67814, r² = 0.98) от lgс(Сeph) и lgс(Аmox) соответственно. Данные могут быть применены при полуколичественном определении антибиотиков с пониженным пределом обнаружения 0.04 и 0.09 (0.10) мг/мл для зависимостей периметра и площади ЛД и с погрешностью определения, не превышающей 20%.

Определение антибиотиков в лекарственных препаратах. Разработанные варианты экспресс-определения антибиотиков апробированы для оценки их содержания в лекарственных препаратах (“Амоксициллин” таблетки, “Цефалексин” капсулы). Согласно фармакопейной статье (ФС “Цефалексин, капсулы”) содержание антибиотика должно находиться в пределах не менее 90.0% и не более 110.0% от заявленного количества цефалексина, т.е. 500 ± 50 мг; и не менее 90.0% и не более 110.0% амоксициллина, т.е. 250 ± 25 мг (ФС “Амоксициллин, таблетки”). При тест-определении содержания антибиотика каплю анализируемого раствора наносили на индикаторную бумагу, нагревают до 100°С и оценивали содержание антибиотика с помощью разработанных методик визуального и цветометрического определения, а также независимого спектрофотометрическим методом (СФМ) (табл. 3). При спектрофотометрическом определении применяли градуировочную зависимость оптической плотности при 262 нм от концентрации цефалексина и при 275 нм для амоксициллина.

Найденные в препаратах содержания амоксициллина и цефалексина согласуются с заявленными интервалами содержаний определяемых компонентов. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что разработанные экспресс-методики можно применять для полуколичественного определения цефалексина и амоксициллина.

Финансовая поддержка работы осуществлялась в рамках гранта РФФИ (научный проект № 20-33-90020).