Биоорганическая химия, 2020, T. 46, № 6, стр. 753-760
Моноклональное антитело HlyIIC-15 против С-концевого домена HlyII B. cereus взаимодействует с сайтом узнавания тромбином
А. В. Замятина 1, 3, Н. В. Руденко 1, *, А. П. Каратовская 1, А. О. Шепеляковская 1, А. В. Сиунов 2, Ж. И. Андреева-Ковалевская 2, А. С. Нагель 2, В. И. Салямов 2, А. С. Колесников 2, Ф. А. Бровко 1, 3, А. С. Солонин 2, 3
1 Филиал Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, РАН
142290 Пущино, просп. Науки, 6, Россия
2 Федеральный исследовательский центр “Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук”, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина, РАН
142290 Пущино, просп. Науки, 5, Россия
3 Пущинский государственный естественно-научный институт
142290 Пущино, просп. Науки, 3, Россия
* E-mail: nrudkova@mail.ru
Поступила в редакцию 29.04.2020
После доработки 08.05.2020
Принята к публикации 11.05.2020
Аннотация
Среди панели моноклональных антител к рекомбинантному белку HlyIICTD Bacillus cereus обнаружено антитело, способное образовывать иммунный комплекс с областью узнавания тромбином, аминокислотная последовательность которой расположена внутри рекомбинантного HlyIICTD. Локализацию эпитопа проводили методами пептидного фагового дисплея, а также иммуноферментным анализом и иммуноблоттингом по взаимодействию с рекомбинантными белками, либо содержащими, либо не содержащими отдельные компоненты HlyIICTD. Выявленный эпитоп расположен в области тромбинового сайта и сохраняет способность взаимодействовать с антителом после протеолиотической атаки белка тромбином.
ВВЕДЕНИЕ
Производство различных рекомбинантных белков, отдельных субъединиц, а также полипептидов обусловливает развитие биотехнологических подходов, обеспечивающих быстрый и дешевый метод их выделения в нативном виде. В рутинных экспериментальных исследованиях часто используют различные аффинные сорбенты для жидкостной хроматографии, которые позволяют быстро и эффективно очищать рекомбинантные белки с последующим удалением необходимых для хроматографии этих белков “тэгов” специфическими протеазами. Одним из широко используемых вариантов является введение участков узнавания тромбином. Тромбин (фактор свертывания II) является компонентом системы свертывания крови млекопитающих и функционирует как сайт специфическая сериновая протеаза, нечувствительная к буферным растворам, содержащим различные детергенты [1]. Этот белок распознает сайт LVPR^GS и вносит разрыв между аргинином и глицином [2]. Для изучения генеза HlyII в бактериальных клетках и взаимодействия токсина с клетками эукариот создана панель МА к С-терминальному домену порообразующего белка HlyII [3]. Данная работа посвящена описанию HlyIIC-15, которое эффективно связывается с тромбиновым сайтом гибридного белка, но не с другими пептидными участками рекомбинантного CTD.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Характеристика аминокислотной последовательности HlyIICTD. Одним из факторов вирулентности условно-патогенного микроорганизма B. cereus является порообразующий токсин гемолизин II (HlyII) [4]. Гемолизин II со структурой типа β‑баррель имеет высокую гомологию с альфа-токсином S. aureus и отличается от него наличием С‑терминальной аминокислотной избыточности из 94 остатков [5]. Этот участок при ЯМР-анализе продемонстрировал не описанную ранее уникальную пространственную структуру [6]. Участок гена клонирован и HlyIICTD очищен как описано в работе Руденко с соавторами [3]. Аминокислотная последовательность HlyIICTD состоит из аминокислотных остатков C-концевой избыточности HlyII, тромбинового сайта, шести остатков гистидина и линкера (рис. 1).
Особенности взаимодействия HlyIICTD c эритроцитами, выявляемые МА HlyIIC-15. В составе панели моноклональных антител против HlyIICTD обнаружено МА номер 15 (HlyIIC-15), которое не способно узнавать антиген в момент его взаимодействия с мембранами как эритроцитов [3], так и липосом [7]. Неспособность взаимодействия HlyIIC-15 со связавшимся с эритроцитами CTD, по-видимому, определяется стерическим расположением эпитопа для этого антитела и его недоступностью относительно точки узнавания мембраны антигеном.
В работе Miles с соавторами [8] было продемонстрировано, что нативный гемолизин II и делеционный вариант, лишенный С-концевого домена, эффективно олигомеризуется как в присутствии эритроцитов, так и липосом. В связи с этим проверена возможность олигомеризации CTD в присутствии эритроцитов и липосом. На рис. 2 показан иммуноблоттинг с использованием МА HlyIIC-15. Как видно из этого рисунка HlyIICTD в присутствии эритроцитов кролика и липосом переходит в тетрамерную форму. До добавления эритроцитов и липосом кроме мономерных форм HlyIICTD видны слабоокрашенные димерные и тетрамерные формы HlyIICTD (рис. 2, дорожка 2). При инкубировании HlyIICTD с эритроцитами МА HlyIIC-15 выявляло тетрамерные формы, в то время как мономерные формы не видны (рис. 2, дорожка 3). Аналогичные результаты были получены при инкубировании HlyIICTD с липосомами (рис. 2, дорожка 4). Таким образом, HlyIIC-15 способно эффективно взаимодействовать с CTD, а эпитоп, узнаваемый этим антителом, расположен на поверхности и доступен MA HlyIIC-15 как у мономерных форм антигена, так и его тетрамерных форм.
Пептидный фаговый дисплей. Особенности взаимодействия HlyIICTD с эритроцитами, выявленные с помощью HlyIIC-15, поставили задачу определения эпитопа, узнаваемого этим антителом. Антигенную детерминанту HlyIICTD, узнаваемую МА HlyIIC-15, определяли методом пептидного фагового дисплея. В этом методе возможные пептидные варианты экспрессируется на поверхности фагового вириона. Отбор фагов, несущих пептидные аминокислотные последовательности, специфически взаимодействующие с МА HlyIIC-15, проводили по способности взаимодействовать друг с другом. Было проведено три раунда селекции. ДНК отобранных индивидуальных фаговых клонов секвенировали. С помощью программы GeneRuner проведен анализ полученных нуклеотидных последовательностей и определены аминокислотные последовательности пептидов, узнаваемых МА HlyIIC‑15 и экспонированных в составе белка pIII бактериофагов.
После трех раундов аффинной селекции из неамплифицированного элюата последнего раунда отобраны 30 фаговых клонов. После анализа их взаимодействия с МА HlyIIC-15 отобрано 12 клонов, в которых определена последовательность экспонируемого фагом пептида. Аминокислотные последовательности всех пептидов были выравнены и обнаружено четыре консенсусных аминокислотных остатка (а.о.) LVPR. Причем в клонах 7 и 9 данная консенсусная последовательность непосредственно примыкает к глициновому линкеру, с помощью которого пептиды соединены с последовательностью структурного белка pIII бактериофага. Следовательно, протяженность участка узнавания МА HlyIIC-15 может включать либо четыре LVPR, либо пять а.о. – LVPRG. Остаток глицина является искусственно привнесенным в рекомбинантный белок пептидным фрагментом и выявленный пептид почти полностью соответствующим участку узнавания тромбина LVPR^GS.
Экспериментальное подтверждение локализации эпитопа, узнаваемого МА HlyIIC-15 методами иммуноферментного анализа и иммуноблоттинга. С помощью иммуноферментного анализа сравнивали взаимодействие МА HlyIIC-15 со следующими препаратами: HlyIICTD, нативным делеционным вариантом HlyIIΔС (без С-терминального участка), содержащим тромбиновый сайт, а также с нативным препаратом HlyII, не содержащим тромбиновый сайт. HlyIIΔС и HlyIICTD, содержали шесть гистидиновых аминокислотных остатков. HlyII содержал интактный район, соответствующий С-концевой избыточности порообразующего токсина HlyII B. cereus. В результате иммуноферментного анализа показано, что при эффективном взаимодействии с HlyIICTD и HlyIIΔС, МА HlyIIC-15 не узнавали нативный HlyII, не содержащий тромбиновый сайт, что подтверждает результаты, полученные фаговым дисплеем о том, что эпитоп, узнаваемый HlyIIC-15 включает в себя сайт, узнаваемый тромбином.
Таблица 1.
Номера клонов | Фрагмент HlyIICTD VGNISNDINKLNIKGPYIEIKQIGTLVPRGSMAISDPNSSSVDKLAAAL |
---|---|
1, 4, 5 2 3 6, 8 7 9 10 11, 12 |
----------------LQVPRAQHHAIT--------- --------------WSGALIPRNSTF----------- --------------NNAPPPPLLFYH----------- -------------IPSFPNLIPRYA------------ ------------IEPDVRGSLIPR-------------- ------------YLSTPSGSLVPR-------------- -------------SVQTLNLIPRQF------------ ----------------HLLVPRFDVHSM---------- |
Для подтверждения эпитопа узнаваемого HlyIIC-15 использовали иммуноблоттинг, в котором проверяли взаимодействие антител наряду с HlyIICTD с рекомбинатными белками PlcR [9], HlyII, делеционным вариантом HlyIIΔС и HlyIIR (репрессор гемолизина II) [10], а также нативным гемолизином II B cereus B771, клонированным в Bacillus subtilus BD170 (табл. 2). На рис. 3 продемонстрировано, что МА HlyIIC-15 способно образовывать иммунный комплекс с образцами, содержащими тромбиновый сайт и дополнительных шесть гистидиновых остатков, но не образует подобных комплексов с полноразмерным HlyII дикого типа, не содержащего ни тромбиновый сайт ни шесть гистидиновых аминокислотных остатков. Итак, для образования иммунного комплекса, исследуемого антитела с С-концевым участком HlyII в рекомбинантном белке, необходимо присутствие дополнительных районов, включающих шесть гистидиновых остатков, пептидный линкер и сайт, узнаваемый тромбином. Это предположение было подтверждено способностью МА HlyIIC-15 узнавать рекомбинантный транскрипционный регулятор PlcR B. cereus, содержащий тромбиновый сайт, линкер и шестигистидиновый участок в N-концевой части этого белка. Дополнительным доказательством узнавания MA HlyIIC-15 района, расположенного за пределами C‑концевого домена HlyII, является способность образовывать иммунный комплекс рекомбинантного белка, лишенного CTD, но содержащего тромбиновый сайт, линкер и шестигистидиновый участок в С-концевой части этого белка. В связи с тем, что HlyIIR, содержащий шесть гистидиновых остатков в N-концевой части, не способен образовывать иммунный комплекс с MA HlyIIC-15 можно заключить, что для узнавания МА своего антигена необходима область тромбинового сайта.
Таблица 2.
Белок | Рекомбинантная плазмида (вектор) | Источник гена | Ссылка/от кого получено |
---|---|---|---|
HlyII | pBD170-EH2 | B. cereus B771 | [19] |
HlyIICTD | pET29b | B. cereus 14579T | [3] |
HlyII 6His | pSWEET-bgaB | B. cereus 14579T | Лаб. молекулярной микробиологии ИБФМ РАН |
HlyIIΔС | pET29b | B. cereus 14579T | Лаб. молекулярной микробиологии ИБФМ РАН |
PlcR | pET33b | B. cereus АТСС 4342T | к.б.н. А.М. Шадрин |
HlyIIR | pHR | B. cereus B771 | [20] |
Рекомбинантные белки, содержащие тромбиновый сайт (HlyIICTD и PlcR) были обработаны тромбином. После чего электрофоретическая подвижность белков изменялась в сторону уменьшения молекулярного веса. Интенсивность окрашивания PlcR МА HlyIIC-15 также уменьшалась, что может свидетельствовать о снижении степени связывания антитела с антигеном при удалении части аминокислотных остатков, входящих в эпитоп. Анализ возможности взаимодействия рекомбинантных белков, содержащих тромбиновый сайт, линкер и шестигистидиновый участок на разных концах рекомбинантных белков после обработки тромбином позволил подтвердить, что район узнавания MA HlyIIC-15 расположен в области тромбинового сайта. Как видно из рисунка PlcR, содержащий тромбиновый сайт с линкером и шестью гистидиновыми остатками на N-конце, после обработки тромбином снижает, но сохраняет способность окрашиваться HlyIIC-15, это позволило заключить, что MA HlyIIC-15 способно узнавать более широкий участок, чем определено фаговым дисплеем. Аналогичный результат получен после обработки тромбином HlyIICTD. По-видимому, ключевыми аминокислотными остатками эпитопа являются составляющие сайта узнавания тромбином и плюс, возможно, часть из района окружения этого сайта (рис. 4). После протеолиза тромбином рекомбинантного HlyIICTD, содержащего тромбиновый сайт с линкером и шестью гистидиновыми остатками на С-конце белок взаимодействовал с МА HlyIIC-15, что может однозначно указывать на узнавание этим антителом как минимум четырех аминокислотных оснований LVPR, входящих в состав тромбинового сайта (данные не приведены).
Таким образом, район расположения экспериментально детектируемого эпитопа подтверждает определение этого эпитопа пептидным фаговым дисплеем. Четырех аминокислот LVPR достаточно для узнавания МА HlyIIC-15.
ОБСУЖДЕНИЕ
В течение долгого времени очистка и получение высокоочищенных белков было довольно затратным как по времени, так и затратам, особенно это касалось белков, взаимодействующих с мембранами. Применение современных генно-инженерных технологий частично решило эту проблему. Для получения рекомбинантных белков созданы многочисленные экспрессионные системы с промоторами, обеспечивающими высокий уровень транскрипции гибридных генов в различных бактериальных и грибных системах. В связи с тем, что вопрос как о потенциальной токсичности химических индукторов экспрессии, так и токсичности конечных искомых продуктов до сих пор остается открытым, широко используются ранее описанные варианты инициации биосинтеза, посредством индуктора или температурного сдвига. В этом случае последовательность целевого гена помещается под контроль эффективных фаговых промоторов [11–13]. Для повышения растворимости, уровня экспрессии, а также эффективной очистки аффинной хроматографией к N- или С-концам рекомбинантных белков присоединяют короткие маркерные аминокислотные последовательности, получившие название “fusion tags” [14]. Получение рекомбинантного белка в растворимой форме иногда удается решить присоединением вспомогательной последовательности – хорошо растворимого белка-партнера [15]. Однако, как в первом, так и во втором случае конечный продукт отягощен дополнительными белковыми участками и не является нативным продуктом. На передний план выходит цель в производстве различных рекомбинантных белков, отдельных субъединиц, а также полипептидов, восстановление конечных продуктов в нативном виде. Эта цель достигается введением дополнительных пептидных районов, узнаваемых высоко специфическими протеазами, которые способны отщеплять используемые тэги и восстанавливать рекомбинантные белки практически до нативного состояния. Создание технологии получения рекомбинантных белков или пептидов с использованием протеолитического расщепления всегда является задачей, требующей индивидуального решения для каждого продукта. Одной из часто используемых высокоспецифичных протеаз является тромбин. После фермент-зависимого протеолиза тромбин может быть легко удален посредством жидкостной хроматографии, предназначенной для очистки или удаления сериновых протеаз. Однако использование тромбина ограничивается лабораторными исследованиями [16]. Наиболее существенным недостатком протеазы является способ ее получения из плазмы крови млекопитающих.
Таким образом, в данной работе описано МА HlyIIC-15, выявляющее тромбиновый сайт за пределами структурной части клонированного белка, содержащего этот сайт. Результаты данной работы предполагают расширение возможностей использования тромбина и сайта его узнавания не только для отсечения дополнительных пептидных участков, но и в качестве маркера для идентификации и отслеживания различных рекомбинантных белков.
Учитывая, что тромбин активирует факторы свертывания крови V, VIII, VII, XI, XIII, протеин С, тромбин-активируемый ингибитор фибринолиза [17], то есть они имеют в своем составе пептидные участки, узнаваемые этим белком, МА HlyIIС-15, связывающееся с участком разрезания тромбином, можно использовать для массового анализа образцов при исследовании различных патологий системы свертывания крови. Медицинская практика последних месяцев показала, что при инфекции COVID-19 у пациентов в тяжелой форме наблюдается образование странных тромбов в крови [18]. У ряда больных отмечались признаки сгущения крови и образования тромбов в разных органах. Нейрохирурги отмечают резкий всплеск инсультов из-за тромбов, а патологоанатомы наблюдали при вскрытии легкие, наполненные сотнями микротромбов. В связи с этим использование МА HlyII-15, может оказаться удачным инструментом в изучении и понимании процессов свертывания крови в ходе инфекции COVID-19.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Штаммы плазмиды и белки. E. coli BL21(DE3) (Novagen, Германия) была использована для трансформации pET29b(+) (Novagen, Германия), E. coli ER2738 для афинной селекции фагов.
Среды и растворы. Среды: 2YT (16 г/л бакто-триптон, 1 г/л дрожжевой экстракт, 5 г/л NaCl, рН 7.0), 1.5% агар и 0.7% агар на основе 2YT. Растворы: 1000× IPTG/X-gal 1.25 г IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) и 1 г X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside) в 25 мл DMF (dimethyl formamide), тетрациклин 20 мг/мл в 50% этаноле, фосфатно-солевой буферный раствор (PBS), PBST–PBS, содержащий 0.1% Tween-20, блокирующий раствор 1% желатин на основе PBS-T, преципитирующий раствор PEG/NaCl (20% (w/v) полиэтиленгликоль-6000, 2.5 M NaCl). Белковые маркеры (Abcam, Англия) и ДНК электрофорезные маркеры (Fermentas, Литва), конъюгат антител козла с пероксидазой хрена (Thermo Scientific, США), конъюгат стрептавидина с пероксидазой хрена (Thermo Scientific, США).
Фаговая пептидная библиотека. В работе для определения эпитопа на молекуле HlyIICTD использовали библиотеку случайных пептидов из 12 аминокислотных остатков (New England Biolabs), отображаемых на фаге M13KE [21]. 12-Мерная фаговая пептидная библиотека имеет репертуар 109, пептиды экспонированы на поверхности бактериофагов в составе минорного белка pIII. Каждый клон в библиотеке представлен ~1000 копий.
Аффинная селекция бактериофагов, специфически взаимодействующих с МА HlyIIC-15, проводилась в соответствии с инструкцией к фаговой библиотеке с некоторыми модификациями. Для проведения всех трех раундов селекции МА HlyIIC-15 сорбировали на планшеты для иммуноферментного анализа (Greiner, high binding, США) из концентрации 10 мкг/мл в объеме 100 мкл в Na-карбонатном буфере рН 9.6, в течение ночи, при 4°С. Для каждого раунда использовали по 8 лунок. Для предотвращения возможной неспецифической сорбции иммунопланшеты инкубировали с блокирующим буфером в течение 1 ч при комнатной температуре. Далее к экспериментальным лункам добавляли по 10 мкл фаговой библиотеки с концентрацией частиц 3.8 × 1012 частиц/мл. Инкубировали в течение ночи при 4°С. После инкубации с фаговыми частицами иммунопланшеты отмывали не менее 10 раз PBST. Элюцию связавшихся фагов проводили добавлением в лунки 100 мкл суспензии клеток E. coli (штамм ER2738), находящихся в экспоненциальной фазе роста (OD600 ~ 0.5) с последующей инкубацией при 37°С в течение 45 минут, на этом этапе происходило инфицирование клеток бактериофагами. Далее E. coli собирали из лунок и переносили в колбы с 20 мл среды 2YТ, содержащей 20 мкг/мл тетрациклина и культивировали в течение ночи на качалке при 200 об./мин и 37°С для амплификации элюированных бактериофагов. Параллельно с этим определяли количество элюированных бактериофагов методом выращивания в полужидком агаре. После третьего раунда элюат не амплифицировали. Для изоляции отдельных фагов его титровали на чувствительной культуре и переносили индивидуальные негативные колонии фаговых клонов в пробирки с 5 мл среды 2YT, содержащей разведенную 1 : 100 ночную культуру ER2738. Проводили раздельную амплификацию фаговых клонов в течение ночи на термошейкере при 37°С.
Фаговые клоны, взаимодействующие с МА HlyIIC-15 наилучшим образом, были выбраны по результатам твердофазного иммуноферментного анализа их взаимодействия с сорбированными МА HlyIIC-15. Взаимодействие выявляли с помощью кроличьих поликлональных антител против М13 и антител козла против иммуноглобулинов кролика, конъюгированных с пероксидазой хрена. Бактериофаги этих клонов были использованы для выделения и секвенирования ДНК.
Выращивание бактериофагов в полужидком агаре. 5 мл среды 2YT с тетрациклином инокулировали 50 мкл ночной культуры E. coli (штамм ER2738) и культивировали при 37°С до плотности суспензии, соответствующей OD600 ~ 0.5. Готовили чашки Петри с агаризованной средой (1.5% агар на основе 2YT) с IPTG/X-gal и тетрациклином. Полужидкий агар расплавляли на водяной бане и разливали по 3 мл в стерильные культуральные пробирки, поддерживая температуру 45°C. К 3 мл полужидкого агара добавляли 20 мкл суспензии E. coli в экспоненциальной фазе роста и 50 мкл препарата, содержащего бактериофаги (на этапе проведения раундов селекции – инфицированные клетки). В случае необходимости предварительно делали серийные разведения препаратов бактериофагов. Полученную смесь быстро выливали и распределяли поверх агаризованной среды. Чашки инкубировали в течение ночи при 37°С, после чего подсчитывали количество негативных колоний фаговых клонов – бляшек.
Выделение ДНК бактериофагов. Ночную культуру E. coli зараженных индивидуальными клонами бактериофагов центрифугировали 10 минут при 5000 × g, 4°C. Бактериофаги выделяли из супернатанта путем осаждения полиэтиленгликолем MW 6000 в присутствии высокой концентрации NaCl [21]. Концентрацию фаговых частиц в супернатанте определяли спектрофотометрически при длине волны 269 нм и рассчитывали по формуле [ф.ч.] = (2 × 1014 × А269)/30. Одноцепочечную ДНК индивидуальных клонов выделяли методом фенольной экстракции с последующим осаждением этиловым спиртом [22].
Секвенирование ДНК. Анализ последовательностей ДНК потомков фаговых клонов для определения последовательностей встроек проводили в компании Евроген. Обработка результатов секвенирования производилась в программах Gene Runner, ClustalW.
Наработка липосом. Липосомы готовили из раствора лецитина в концентрации 1 мг/мл в смеси хлороформа и метанола (молярное отношение, 2 : 1). После сушки под вакуумом, липидную пленку ресуспендировали в буфере (10 мМ Трис-HCl, рН 7.2, 100 мМ КСl) до общей концентрации липидов 1 мг/мл. Липосомы получали обработкой ультразвуком в течение 30 мин на льду [4]. Олигомерные формы HlyIICTD выявляли после электрофоретического разделения смеси HlyIICTD (9 мкМ) с липосомами, предварительно инкубированными в течение 1 часа, при 37°С, и переноса на нитроцеллюлозную мембрану с последующим окрашиванием МА HlyIIC-15.
Иммуноблоттинг. Электрофоретическое разделение белков в исследуемых препаратах проводили в присутствии β-меркаптоэтанола как в работе [23]. Перенос на нитроцеллюлозную мембрану проводили в течение 15 ч при силе тока 20 мА в буфере, содержащем 25 мМ Трис-HCl, 0.25 М глицин, 0.1% додецилсульфат натрия, 20% метанол, pH 8.3. Центры неспецифической сорбции блокировали добавлением 1% (w/v) раствора желатина в PBST в течение 30 мин. Далее мембраны инкубировали в течение 2 ч с МА HlyIIC‑15 (10 мкг/мл). После инкубации с антителами мембраны обрабатывали 1 ч конъюгатом пероксидазы хрена с кроличьими антителами к иммуноглобулинам мыши в разведении согласно рекомендации производителя (Thermo Scientific, США) в PBST. На каждой стадии нитроцеллюлозные мембраны тщательно отмывали PBST. Мембрану окрашивали раствором, содержащим 3 мМ диаминобензидина-3,3 тетрагидрохлорида (Sigma-Aldrich, США) и 0.03% перекиси водорода.
Список литературы
Andrew M., Paes B., Milner R., Johnston M., Mitchell L., Tollefsen D.M., Powers P. // Blood. 1987. V. 70. P. 165–172.
Vergis J.M., Wiener M.C. // Protein Expr Purif. 2011. V. 78. P. 139–142. https://doi.org/10.1016/j.pep.2011.04.011
Руденко Н.В., Каратовская А.П., Замятина А.В., Сиунов А.В., Андреева-Ковалевская Ж.И., Нагель А.С., Бровко Ф.А., Солонин А.С. // Биоорган. химия. 2020. Т. 46. С. 280–285. [Rudenko N.V., Karatovskaya A.P., Zamyatina A.V., Siunov A.V., Andreeva-Kovalevskaya Zh.I., Nagel A.S., Brovko F.A., Solonin A.S. // Rus. J. Bioorg. Chem. 2020. V. 46. P. 321–326.] https://doi.org/10.1134/S1068162020030188
Andreeva Z.I., Nesterenko V.F., Fomkina M.G., Ternovsky V.I., Suzina N.E., Bakulina A.Y., Solonin A.S., Sineva E.V. // Biochim. Biophys. Acta. 2007. V. 1768. P. 253–263. https://doi.org/10.1016/j.bbamem.2006.11.004
Baida G., Budarina Z. I., Kuzmin N.P., Solonin A.S. // FEMS Microbiol. Lett. 1999. V. 180. P. 7–14.
Kaplan A.R., Kaus K., De S., Olson R., Alexandrescu A.T. // Sci. Rep. 2017. V. 7. P. 3277. https://doi.org/10.1038/s41598-017-02917-4
Замятина А.В., Руденко Н.В., Каратовская А.П., Нагель А.С., Андреева‑Ковалевская Ж.И., Сиунов А.В., Бровко Ф.А., Солонин А.С. // Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов. 2019. С. 95–97.
Miles G., Bayley H., Cheley S. // Protein Sci. 2002. V. 11. P. 1813–1824.
Huillet E., Bridoux L., Barboza I., Lemy C., André-Leroux G., Lereclus D. // Microbiology. 2020. V. 166. P. 398–410. https://doi.org/10.1099/mic.0.000883
Kovalevskiy O.V., Lebedev A.A., Surin A.K., Solonin A.S., Antson A.A. // J. Mol. Biol. 2007. V. 365. P. 825–834.
Солонин А.С., Таняшин В.И., Баев А.С. Новые плазмидные вектора, содержащие регуляторный район фага лямбда // Докл. Акад. наук. СССР. 1979. Т. 245. С. 722–725.
Kosykh V.G., Solonin A.S., Buryanov Ya.I., Bayev A.A. // Biochim. Biophys. Acta. 1981. V. 655. P. 102–106.
Soriano E., Borth N., Katinger H., Mattanovich D. // Biotechnol. Bioeng. 2002. V. 80. P. 93–99.
Terpe K. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. V. 60. P. 523–533.
Baubichon-Cortay H., Baggetto L.G., Dayan G., Di Pietro A. // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 22 983–22 989.
Hemker H.C., Al Dieri R., De Smedt E., Béguin S. // Thromb Haemost. 2006. V. 96. P. 553–561.
Tang N., Li D., Wang X., Sun Z.J. // Thromb Haemost. 2020. V. 18. P. 844–847. https://doi.org/10.1111/jth.1476832073213
Han H., Yang L., Liu R., Liu F., Wu K.L., Li J., Liu X.H., Zhu C.L. // Clin. Chem. Lab. Med. 2020. pii: /j/cclm.ahead-of-print/cclm-2020-0188/cclm-2020-0188.xml. https://doi.org/10.1515/cclm-2020-0188
Sineva E.V., Andreeva-Kovalevskaya Z.I., Shadrin A.M., Gerasimov Y.L., Ternovsky V.I., Teplova V.V., Yurkova T.V., Solonin A.S. // FEMS Microbiol. Lett. 2009. V. 299. P. 110–119. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2009.01742.x
Budarina Z.I., Nikitin D.V., Zenkin N., Zakharova M., Semenova E., Shlyapnikov M.G., Rodikova E.A., Masyukova S., Ogarkov O., Baida G.E., Solonin A.S., Severinov K.A. // Microbiology. 2004. V. 150 (Pt 11). P. 3691–3701.
Reddy P., McKenney K. // Biotechniques. 1996. V. 20. P. 854–860.
Ph.D.™ Phage Display Libraries. Instruction Manual. Version 3.0 11/18. New England Biolabs, Inc.
Laemmli U.K. // Nature. 1970. V. 227. P. 680–685.
Дополнительные материалы отсутствуют.
Инструменты
Биоорганическая химия