Биоорганическая химия, 2021, T. 47, № 6, стр. 762-767

ВВЕДЕНИЕ

B7 – важная корегуляторная молекула, которая экспрессируется на поверхности антиген-презентирующих клеток (АПК) человека, представлена двумя формами: B7-1 и B7-2. Рецепторы лигандов B7 на поверхности Т-клеток – молекулы CD28/CTLA-4. Взаимодействие B7-1 или В7-2 с CD28 способствует активации Т-клеток, пролиферации и секреции цитокинов. Взаимодействие B7-1 или В7-2 с CTLA-4 снижает активацию и пролиферацию Т-лимфоцитов [1]. Блокада костимуляторных путей регуляции иммунного ответа может обеспечить эффективную терапию аутоиммунных заболеваний и предотвратить отторжение трансплантатов. Роль блокаторов могут выполнять пептиды, характеризующиеся высокой специфичностью взаимодействия с мишенью и низкой молекулярной массой, что может снижать количество побочных эффектов [2].

Фаговые пептидные библиотеки – один из источников поиска пептидов, способных избирательно взаимодействовать с белками, липидами и углеводами [3]. Для получения пептидов, специфически взаимодействующих с молекулярной мишенью, проводится несколько циклов аффинной селекции бактериофагов из фаговых пептидных библиотек с последующим секвенированием участка ДНК, кодирующего чужеродный пептид.

Цель работы – поиск и изучение пептидов, специфически взаимодействующих с корегуляторной молекулой В7-2, с использованием фаговых пептидных библиотек.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Отбор бактериофагов, взаимодействующих с корегуляторной молекулой В7-2. Аффинная селекция подразумевает отбор из фаговой пептидной библиотеки бактериофагов, несущих на своей поверхности чужеродные пептиды, специфически взаимодействующие с мишенью – корегуляторной молекулой В7-2, содержащей Fc-участок IgG1 человека. Селекция осуществляется за счет образования комплекса бактериофага, белка В7-2 и магнитной частицы, на поверхности которой находится белок G, специфически взаимодействующий с Fc-участком IgG1 человека. Элюированную гетерогенную смесь бактериофагов амплифицируют в бактериальной культуре и используют для следующего цикла селекции.

В работе использовали фаговую пептидную библиотеку GerLab на основе нитчатого бактериофага fd. Для отбора бактериофагов, взаимодействующих с рекомбинантным белком В7-2 человека (SinoBiological, КНР), были проведены три цикла аффинной селекции. Для отслеживания обогащения популяции фагов после каждого цикла определяли биологический титр бактериофагов, элюированных с магнитных частиц, и после их амплификации в бактериальной культуре по методу Грациа [4]. После 2-го цикла наблюдалось увеличение титра бактериофагов в элюате. После 3-го цикла увеличения титра не происходило, что, возможно, свидетельствует о достижении предела насыщения популяции фагов. Изменение титра бактериофагов на протяжении трех циклов аффинной селекции, в результате которых были получены бактериофаги, обладающие наибольшим сродством к мишени В7-2, отражено в табл. 1.

С чашек Петри, содержащих единичные бляшки фагового элюата 3-го цикла, отобрали девять клонов для выделения ДНК и последующего секвенирования участка ДНК, кодирующего чужеродный пептид.

Идентификация аминокислотных последовательностей пептидов. Секвенированные участки ДНК, кодирующие чужеродные пептиды девяти клонов, анализировали с помощью программы BioEdit 7.2 и далее переводили их в аминокислотные последовательности. Аминокислотная последовательность CLAACLGAC представлена в 66.7% анализированных фаговых клонов, в то время как последовательности CPSASSGLTC, QMPALMQQ и AHIGVVSP – в 11.1% клонов (табл. 2).

В дальнейшей работе использовали клоны фагов № 1, 2, 6 и 8, которые несут на своей поверхности четыре уникальных чужеродных пептида, взаимодействующих с белком В7-2.

Иммунохимические свойства отобранных пептидов. Иммунохимические свойства пептидов четырех фаговых клонов анализировали методами иммуноблоттинга и иммуноферментного анализа.

Результаты иммуноблоттинга представлены на рис. 1. Наибольшее значение оптической плотности, равное 50, наблюдалось у клона № 1 (пептид CLARCLGRC). У клонов № 6 (пептид AHIEVVSP) и № 8 (пептид QMPALMQQ) оптическая плотность была ниже и составила 44 и 23 соответственно, что свидетельствует о меньшей аффинности этих пептидов к рекомбинантному белку B7-2. У клона № 2 (пептид CPSASSQLTC) оптическая плотность составила –10, следовательно, данный пептид не связывается с рекомбинантным белком B7-2. Значения оптической плотности у положительного и отрицательного контролей составили 173 и 0 соответственно.

Рис. 1.

Иммуноблот-гибридизация исследуемых фаговых клонов № 1, 2, 6 и 8 с рекомбинантным белком B7-2. (а) – Мембрана дот-блота; (б) – гистограмма значений оптической плотности. Положительный контроль (К+) – рекомбинантный белок В7-2, отрицательный контроль (К–) – бактериофаг fd, не содержащий чужеродную вставку.

Результаты ИФА представлены на рис. 2. Наибольшие значения оптической плотности наблюдались у клонов № 1 (пептид CLARCLGRC) и № 6 (пептид AHIEVVSP): 0.83 ± 0.02 и 0.86 ± 0.03 соответственно, что подтверждает высокое сродство данных пептидов к рекомбинантному белку В7-2. ИФА с клонами № 2 и 4 показал низкое специфическое взаимодействие с мишенью B7-2 (0.06 ± 0.00 и 0.09 ± 0.01 соответственно).

Рис. 2.

Иммуноферментный анализ фаговых клонов № 1, 2, 6 и 8 с рекомбинантным белком B7-2. Положительный контроль (К+) – рекомбинантный белок В7-2, отрицательный контроль (К–) – бактериофаг fd, не содержащий чужеродную вставку.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Рекомбинантный белок B7-2. В работе использовали коммерческий рекомбинантный белок, состоящий из внеклеточного домена (Met1-His239) белка B7-2 человека и Fc-участка IgG1 человека (Pro100-Lys330) с 6His-меткой на C-конце (Sino Biological, КНР).

Фаговая пептидная библиотека. Использованная в данной работе фаговая пептидная библиотека GerLab на основе нитчатого бактериофага fd была получена из лаборатории профессора Дж.М. Гершони [5]. Она состояла из смеси восьми фаговых пептидных библиотек, изготовленных на основе фагмидного вектора типа p88 и экспонирующих в составе главного поверхностного белка pVIII чужеродные рандомизированые пептиды длиной 6, 8, 10, 12 а.о., а также пептиды, замкнутые в петлю.

Аффинная селекция пептидов из фаговой пептидной библиотеки. Аффинную селекцию фаговой библиотеки против рекомбинантного белка B7-2, включающую три цикла, проводили с помощью магнитных частиц (МЧ) Dynabeads^TM Protein G (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, США), представляющих собой однородные суперпарамагнитные шарики размером 2.8 мкм.

Селекцию начинали с промывки МЧ промывочным раствором (0.1%-ный полисорбат 20 в Трис-буферном растворе). Затем добавляли 1 мл блокирующего раствора (5%-ный бычий сывороточный альбумин (БСА) в Трис-буферном растворе) и оставляли на 1 ч при 4°С. В это время смешивали фаговую библиотеку и рекомбинантный белок B7-2 в промывочном растворе и инкубировали 20 мин при комнатной температуре. Полученную смесь добавляли к промытым МЧ, инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре. Образованный комплекс МЧ–фаг–мишень отмывали от несвязавшихся бактериофагов, связавшиеся же фаги элюировали. Далее удаляли МЧ и добавляли нейтрализующий раствор (1 М Трис-HCl). Полученный элюат (50 мкл) инокулировали в 5 мл культуры, измеряли оптическую плотность на спектрофотометре NanoPhotometer N50 (Implen, Германия) при длине волны 600 нм (она составляла 0.6) и инкубировали в течение ночи при 37°С.

Титрование бактериофагов, амплификацию элюата и наработку индивидуальных фаговых клонов проводили в соответствии с руководством производителя (Ph.D.™ Phage Display Libraries Instruction Manual; NEB, США) [6] с использованием штамма E. coli DH5αF'+ (NEB, США).

Выделение одноцепочечной ДНК бактериофагов библиотеки. В 500 мкл суспензии бактериофага добавляли 100 мкл иодидного буферного раствора и 250 мкл 96%-ного этилового спирта, ресуспендировали осадок, инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Далее осаждали оцДНК центрифугированием в течение 10 мин при 13 000 g и 4°С. Супернатант удаляли, осадок промывали 500 мкл 70%-ного этилового спирта. Cнова осаждали оцДНК центрифугированием в течение 10 мин при 13000 g и 4°С. Далее высушивали осадок оцДНК в вакууме и растворяли в 30 мкл дистиллированной воды [7].

Контроль выделения оцДНК проводили разделением нуклеиновых кислот в 1%-ном агарозном геле.

Секвенирование. Секвенирование нуклеотидных последовательностей, кодирующих чужеродные пептиды, специфически взаимодействующие с B7-2, проводили в ЦКП “Геномика” (Новосибирский Академгородок) на капиллярном секвенаторе ABI 3130XL (Genetic Analyser, Applied Biosystems, США) с помощью секвенирующего праймера -96gIII (5'-HO-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3') в концентрации 1 пM.

Иммуноблоттинг (дот-блот). На нитроцеллюлозную мембрану однократно наносили фаговые клоны (1 мкл, 10⁸ вирионов) и высушивали на воздухе. В качестве отрицательного контроля (К–) использовали бактериофаг fd (1 мкл, 10⁸ вирионов), не содержащий чужеродной вставки; в качестве положительного контроля (К+) – рекомбинантный белок B7-2 (Sino Biological, КНР; 1 мкл, 2.5 мкг/мл). Целлюлозу инкубировали с блокирующим Трис-буферным раствором (15 мл), содержащим 1% БСА и 0.1% полисорбата 20, для предотвращения неспецифического взаимодействия [8].

После трехкратной промывки Трис-буферным раствором с 0.1% полисорбата 20 наносили 1.5 мл рекомбинантного белка В7-2 (2.5 мкг/мл) в блокирующем растворе и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин.

После трехкратной промывки промывочным раствором наносили 15 мл раствора антител козы против Fc-участка IgG человека, конъюгированных с щелочной фосфатазой (Invitrogen, США), в рабочем разведении 1 : 5000 в блокирующем растворе и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин.

После трехкратной промывки Трис-буферным раствором с 0.1% полисорбата 20 наносили смесь 5-бром-4-хлор-3-индолил-фосфата (BCIP, 0.21 мг/мл) и нитросинего тетразолия (NBT, 0.42 мг/мл в воде) объемом 15 мл, инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин в темноте.

После трехкратной промывки водой нитроцеллюлозную мембрану высушивали на воздухе в недоступном для света месте. Сигналы на мембране переводили в компьютерное изображение с помощью приложения ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).

Иммуноферментный анализ (ИФА). Для ИФА использовали среднесорбционные 96-луночные планшеты (Jet Biofil, КНР). В лунки вносили по 100 мкл раствора рекомбинантного белка B7-2 (Sino Biological, КНР) в концентрации 2.5 мкг/мл в Трис-буферном растворе (pH 8.6) и сорбировали при 4°C в течение ночи. Затем блокировали сайты неспецифического связывания добавлением 200 мкл Трис-буферного раствора (pH 7.0), содержащего 5% БСА, инкубировали в термошейкере для планшетов PST-60HL (BioSan, Латвия) при 37°C и 200 об./мин в течение 2 ч. После удаления блокирующего раствора в лунки вносили бактериофаги (100 мкл в блокирующем растворе, 10⁸ вирионов) и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. В качестве отрицательного контроля (К–) использовали бактериофаг fd (100 мкл в блокирующем растворе, 10⁸ вирионов), не содержащий чужеродной вставки; в качестве положительного контроля (К+) – рекомбинантный белок B7-2 (Sino Biological, КНР; 100 мкл, 2.5 мкг/мл). После трехкратной промывки промывочным раствором, содержащим Трис-буферный раствор с 0.5% полисорбата 20, добавляли 100 мкл конъюгата моноклонального антитела против нитчатого бактериофага M13 (GE Healthcare Life Sciences, США), меченого пероксидазой хрена, в выбранном рабочем разведении 1 : 5000 и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. После шестикратной промывки промывочным раствором в лунки добавляли субстрат на основе 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМВ; Sigma-Aldrich, США). Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 1 М серной кислоты в каждую лунку.

Детекцию результатов проводили на планшетном фотометре iMark (Bio-Rad, США) при длине волны 450 нм. Вычисляли средние значения оптической плотности и ошибки средних значений (M ± S.E.), по полученным данным строили диаграммы с указанием величин стандартного отклонения [9].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведения трех циклов аффинной селекции с использованием фаговой пептидной библиотеки GerLab и коммерческого рекомбинантного белка В7-2 были отобраны четыре уникальные последовательности пептидов, взаимодействующих с корегуляторным белком В7-2 человека. С использованием методов иммуноблоттинга и ИФА показано, что фаговые клоны № 1 (пептид CLARCLGRC) и № 6 (пептид AHIEVVSP) обладают наибольшим сродством к рекомбинантному белку В7-2, в то время как у фаговых клонов № 2 (пептид CPSASSQLTC) и № 8 (пептид QMPALMQQ) отсутствует специфическое взаимодействие с мишенью.

Выявленные пептиды с высоким сродством к корегуляторному белку В7-2 человека могут послужить основой для расчета и конструирования искусственных иммуногенов с целью их последующего использования при разработке иммунотерапевтических средств для лечения онкологических заболеваний.