Биология моря, 2019, T. 45, № 6, стр. 392-403
Влияние метаболитов бурой водоросли Saccharina cichorioides (Miyabe) на пищевые предпочтения, оплодотворение и развитие эмбрионов морского ежа Strongylocentrotus intermedius A. Agassiz, 1863
М. И. Киселева 1, *, Н. В. Звягинцев 1, С. П. Ермакова 1, Т. Н. Звягинцева 1
1 Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН
690022 Владивосток, Россия
* E-mail: mikiseleva@mail.ru
Поступила в редакцию 23.11.2018
После доработки 06.05.2019
Принята к публикации 30.05.2019
Аннотация
Исследовали действие веществ водно-этанольных и водных экстрактов из образцов свежей и разрушенной бурой водоросли Saccharina cichorioides второго года жизни и из экскрементов морского ежа Strongylocentrotus intermedius, питавшегося этими образцами водоросли, на пищеварительный фермент 1,3-β-D-глюканазу, спермии, яйцеклетки и развивающиеся эмбрионы морского ежа. Анализировали выход, состав и структуру веществ из свежей и разрушенной S. cichorioides и из экскрементов морского ежа. Установлено, что из разрушенных талломов S. cichorioides морские ежи усваивали маннит, белки и практически полностью ламинаран. Обнаружение в водно-этанольных экстрактах разрушенных водорослей активаторов 1,3-β-D-глюканазы морского ежа и ингибиторов процессов оплодотворения в экстрактах свежей водоросли совпадает с натурными наблюдениями. Биохимическое исследование показало, что метаболиты S. cichorioides в значительной мере контролируют процессы пищеварения и размножения S. intermedius.
Морские ежи (тип Echinodermata, класс Echinoidea) широко распространены в Мировом океане. К настоящему времени известно около 900 видов этих беспозвоночных; в России описано 20 видов. Многие морские ежи служат объектом промысла.
Обитающий у побережья Приморского края морской еж Strongylocentrotus intermedius – один из основных потребителей бурых водорослей, предпочтительно семейства Laminariaceae, в местах произрастания которых наблюдаются его массовые скопления. В зал. Петра Великого Японского моря среди представителей семейства ламинариевых наиболее широко представлена Saccharina cichorioides (см.: Белоус и др., 2013). Ранее при натурных наблюдениях на севере Приморского края было отмечено, что морские ежи практически не поедали свежую бурую водоросль Saccharina japonica. Животные, активно поедавшие талломы водоросли, встречались в октябре–ноябре, когда растения заканчивали свой жизненный цикл после спороношения. Морские ежи охотно потребляли проростки и слоевища ламинарии в притопленных выбросах растений, которые, оторвавшись от грунта, побывали на берегу и были вторично смыты волнами в море (Крупнова, Павлючков, 2003). Чтобы объяснить пищевые предпочтения морского ежа, были применены биохимические методы (Агаркова и др., 2007).
Биохимические процессы во взаимодействиях популяций в водных биоценозах играют большую роль благодаря выделяющимся в воду метаболитам, представленным разными типами соединений (Fitton, 2003; Агаркова и др., 2007). Изучение биотических взаимоотношений серого морского ежа и ламинариевых водорослей, обитающих на одних и тех же участках, представляет несомненный научный и практический интерес при создании аквакультуры как морских ежей, так и ламинарии.
Известны работы по влиянию веществ, содержащихся в ламинариевых (S. japonica, S. cichorioides), на эмбрионы морских ежей (Nakamura, Moriya, 1999; Киселёва и др., 2005, 2015; Kiseleva et al., 2008). В определенные моменты жизненного цикла бурых водорослей их метаболиты способны привлекать или отпугивать морских животных, проявляя в последнем случае защитные функции (Крупнова, Павлючков, 2003; Агаркова и др., 2005). Исследовано влияние некоторых низкомолекулярных соединений бурых водорослей (полифенолов, стеринов, галактолипидов, серной кислоты, сульфатированных углеводов) на сосуществование водорослей и морских животных (Steinberg, van Altena, 1992; Duggins, Eckman, 1997; Schnitzler et al., 1998; Pelletreau, Muller-Parker, 2002; Taylor et al., 2002; Deal et al., 2003). Описано влияние метаболитов водорослей на выбор пищи морскими травоядными животными и на процессы их оплодотворения (de Nys et al., 1991; Pawlik, 1992). Данные исследования в подавляющем большинстве были основаны на составлении искусственно приготовленных пищевых композиций, включавших водорослевые метаболиты, и на изучении их отпугивающего или привлекающего действия на морских животных.
Показано, что наземные растения защищаются от травоядных животных, синтезируя ингибиторы их пищеварительных ферментов – амилаз и/или протеиназ (Broadway, 1996; Ono et al., 2001). У морских беспозвоночных пищеварительными ферментами прежде всего являются ламинариназы (1,3-ß-D-глюканазы) (Sova et al., 1970). Известно единственное сообщение о защите макрофитов от морских ежей путем синтеза водорослями эффекторов пищеварительных ферментов морского ежа (Агаркова и др., 2005). Объектом исследования послужила распространенная у северного побережья Приморья S. japonica. Сведения о веществах из морских макрофитов, которые усваиваются морскими ежами, и о механизмах действия выделенных из макрофитов соединений на жизнедеятельность этих иглокожих малочисленны (Усов, Чижов, 1988; Steinberg, van Altena, 1992; Агаркова и др., 2007; Киселёва и др., 2015).
Цель настоящей работы – выяснение механизма влияния веществ из морских макрофитов на биотические взаимоотношения морских ежей и бурых водорослей. Для этого проведено сравнение состава веществ в образцах двухгодичной водоросли S. cichorioides (свежей и разрушенной) и в экскрементах морского ежа S. intermedius, питающегося этими образцами; изучено действие полученных веществ на пищеварительный фермент морского ежа, а также на процессы оплодотворения и развития эмбрионов.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Объектами исследования служили бурая водоросль Saccharina cichorioides и серый морской еж Strongylocentrotus intermedius, собранные в августе–октябре 2009, 2011, 2015, 2016 и 2017 годов в б. Троица зал. Петра Великого Японского моря. Действие веществ из S. cichorioides на 1,3-β-D-глюканазу, спермии, яйцеклетки и развивающиеся эмбрионы морского ежа S. intermedius изучали на морской экспериментальной станции Тихоокеанского института биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН (Хасанский район, Приморский край). В лабораторных условиях получали мужские и женские гаметы S. intermedius и проводили оплодотворение в соответствии с предложенными ранее методиками (Бузников, Подмарёв, 1975; Dinnel et al., 1987; Киселёва и др., 2005).
В работе тестировали вещества водно-этанольных и водных экстрактов, выделенные из свежей или разрушенной после хранения на берегу под брезентом в течение 4 сут при температуре 23–25°С водоросли S. cichorioides второго года жизни, а также из экскрементов морских ежей, питавшихся этими образцами водоросли. Методика разрушения водоросли под брезентом позволяет искусственно создать образцы ламинарии с разрушающимся талломом. Условия разрушения водоросли подобраны ранее (Агаркова и др., 2007).
Основные аналитические методы
Нейтральные сахара определяли фенол-сернокислотным методом (Dubois et al., 1956). Содержание маннита определяли модифицированным методом Нэша (Vaskovsky, Isay, 1969), белка – методом Лоури (Lowry et al., 1951), полифенолов – реакцией Фолина–Чеколте (Parys et al., 2009). Свободные аминокислоты в экстрактах определяли на аминокислотном анализаторе Вiotronik (Швеция) (прибор Alpha Plus LKB 4151, колонка Ultrapac 4.50.5 мкм, 200 × 4.5 мм). Водорастворимые полисахариды (ламинаран и фукоидан) из S. cichorioides выделяли и определяли по методу Звягинцевой с соавторами (Zvyagintseva et al., 1999). Степень сульфатирования исследуемых фракций фукоидана определяли после гидролиза образцов 4N НСl при 100°С (2 ч) с помощью турбодиметрического метода (Dodgson, Price, 1962).
ЯМР-спектроскопия
Спектры 13С ЯМР фракций были получены на Bruker Avance-III 500 HD спектрометре (Bruker, Karlsruhe, Germany) при частоте 500 MHz и температуре 35°C с маннитом как внутренним стандартом.
Изучение биохимических особенностей питания морского ежа S. intermedius сахариной
Для эксперимента отобрали 60 экз. морских ежей, обитавших в зарослях S. cichorioides. После выдерживания животных в аэрируемом аквариуме с морской водой в течение 3–4 сут до полного освобождения пищеварительного тракта от экскрементов их поместили в два 70-литровых аквариума (по 30 экз.) с проточной аэрируемой морской водой. Содержали и кормили морских ежей в соответствии с ранее описанной методикой (Левин и др., 1987). Перед кормлением талломы свежей или разрушенной водоросли разрезали вдоль; одну половину таллома использовали в качестве контроля (К1 или К2 соответственно), другой половиной кормили морских ежей: в одной емкости – свежей водорослью, в другой – разрушенной. Корм морским ежам давали ежесуточно, и также ежесуточно сифоном собирали выделенные ими экскременты (О1 и О2 – экскременты животных, питавшихся соответственно свежей и разрушенной водорослью).
Пищевую привлекательность оценивали как разницу в процентах между сухой массой контрольных образцов водоросли (РК) и соответствующих экскрементов морского ежа (РО) по формуле: (РК – РО)/РК × 100%.
Образцы, полученные из свежей и разрушенной водоросли и из экскрементов морского ежа (оба варианта), последовательно экстрагировали водным этанолом и водой. Экстракты использовали для сравнительной характеристики состава и биологических свойств веществ, содержавшихся в разных образцах.
Получение водно-этанольных экстрактов из S. cichorioides
Образцы S. cichorioides и экскрементов морского ежа экстрагировали этанолом (1 л этанола на 1 кг водоросли) при комнатной температуре в течение 2 нед. Водно-спиртовые экстракты высушивали под вакуумом и использовали в экспериментах в виде водных растворов. Остатки водоросли сушили для выделения полисахаридов.
Получение полисахаридов
Обезжиренный остаток S. cichorioides экстрагировали водой для извлечения полисахаридов, используя ранее описанные методы (Zvyagintseva et al., 1999, 2003). Ламинаран и фукоидан разделяли с помощью хроматографии на гидрофобном носителе Полихром-1 (ПХ-1) – коммерческом препарате производства “Реахим” (Россия).
Получение фермента и определение его активности
Эндо-1,3-β-D-глюканазу (ламинариназу ЛE) выделяли из пищеварительного тракта серого морского ежа S. intermedius по предложенному ранее методу (Сова и др., 2003). Активность 1,3-β-D-глюканазы определяли по увеличению содержания восстанавливающих сахаров методом Нельсона (Nelson, 1944). В качестве субстрата использовали ламинаран из S. cichorioides (1 мг/мл) в 0.05 М сукцинатном буфере, рН 5.2. За единицу активности принимали количество фермента, которое катализирует образование 1 мкмоля глюкозы за 1 мин в условиях определения.
Влияние водно-этанольных экстрактов из S. cichorioides на активность 1,3-β-D-глюканазы S. intermedius
Водно-этанольные экстракты и 1,3-β-D-глюканазу разводили 0.025 М сукцинатным буфером (pH 5.2). Действие экстрактов на активность фермента определяли при концентрации от 0 до 600 мкг/мл. Растворы фермента и экстракта смешивали и инкубировали при температуре 20 ± 0.5°C в течение 10 мин. После добавления ламинарана (1 мг/мл) реакцию проводили в течение 20 мин при 37°C и определяли восстанавливающие сахара (Nelson, 1944). Оптическую плотность измеряли при λ = 750 нм на спектрофотометре BioTek PowerWave XS (США) относительно соответствующих контрольных растворов. Концентрацию восстанавливающих сахаров определяли по калибровочной кривой, используя глюкозу как стандарт.
Выделение половых продуктов и оплодотворение S. intermedius
Самок и самцов отловленных морских ежей содержали в отдельных аквариумах; нерест стимулировали механическим встряхиванием. Яйцеклетки 2–3 раза промывали фильтрованной морской водой и пропускали через мельничный газ (размер ячеи 100 × 100 мкм). Перед началом опытов проводили пробное оплодотворение. В опытах использовали яйцеклетки, степень оплодотворения которых составляла не менее 98%. Время от получения яйцеклеток до их осеменения – не более 1 ч.
Для определения действия водно-этанольных экстрактов и полисахаридов из разных образцов S. cichorioides на оплодотворяющую способность сперматозоидов морского ежа S. intermedius использовали стандартный протокол OCC-биотеста (Диннел, 1995). Сперматозоиды (1.5 × 107 кл/мл) или зрелые яйцеклетки (2.5 × 103 кл/мл) предварительно выдерживали в фильтрованной морской воде в течение 30 мин с разными концентрациями исследуемых веществ (5–1000 мкг/мл). Затем суспензию спермиев (100 мкл) добавляли к 1 мл суспензии яйцеклеток (2.5 × 103 кл/мл) в морской воде. Влияние водно-этанольных экстрактов и полисахаридов на оплодотворение оценивали визуально с помощью инвертированного микроскопа “Motic AE 21” (Китай) по количеству оплодотворенных яйцеклеток и дальнейшему развитию эмбрионов. В камере Горяева определяли степень оплодотворения (%), затем рассчитывали концентрацию веществ, при которой ингибирование оплодотворения составляло 50% (IC50) или 100% (IC100). Оплодотворение и инкубирование эмбрионов проводили при температуре 20 ± 0.5°C.
Влияние экстрактов и полисахаридов из S. cichorioides на развивающиеся эмбрионы S. intermedius
Жизнеспособность (продолжительность жизни) и выживаемость (изменения в стадиях развития, аномалии, гибель) эмбрионов морского ежа определяли после добавления экстрактов и полисахаридов из S. cichorioides в концентрации от 5 до 1000 мкг/мл в инкубационную смесь через 3–5 мин после оплодотворения яйцеклеток (стадия зиготы) (Киселёва и др., 2005). Инкубационная смесь состояла из 0.9 мл суспензии оплодотворенных яйцеклеток (2.5 × 103 кл/мл морской воды) и 0.1 мл раствора испытуемых веществ в морской воде. Эмбрионы с испытуемыми веществами инкубировали в течение 1–2 нед. (Киселёва и др., 2015); через каждые 3 сут инкубации во все пробы добавляли по 0.5 мл фильтрованной морской воды.
Достоверность полученных данных оценивали с помощью t-критерия Стьюдента в условиях заданной доверительной вероятности с использованием программы SigmaPlot 2000, версия 6.0 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс), с уровнями значимости p ≤ 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Результаты изучения пищевой привлекательности образцов свежей и разрушенной водоросли показали, что морские ежи съедали 3–5% свежей водоросли и 50–75% разрушенной.
Выход и состав веществ из свежей и разрушенной S. cichorioides и из экскрементов морских ежей, питавшихся этими водорослями
Содержание сухого вещества в разрушенной водоросли и в экскрементах морских ежей после употребления ими как свежей, так и разрушенной водоросли было в 1.5–3.0 раза меньше, чем в свежей водоросли. Данные о выходе некоторых веществ, экстрагированных водным этанолом (маннит, полифенолы, свободные аминокислоты) и водой (фукоидан, ламинаран, белок) из свежей и разрушенной водоросли и из экскрементов морских ежей, питавшихся образцами водоросли, представлены в табл. 1. Сведения о выходе полисахаридов, а также моносахаридный состав ламинаранов и фукоиданов, полученных из разных образцов водоросли водной экстракцией, приведены в табл. 2.
Таблица 1.
Образец | Выход, % | Вещества, растворимые в водном этаноле, % | Водорастворимые вещества, % | ||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
обезжиренной водоросли1 | веществ, растворимых в водном этаноле1 | ||||||||
маннит2 | полифенолы2 | свободные аминокислоты2 | выход3 | белок4 | ламинаран4 | фукоидан/ сульфаты4 | |||
К1 | 17.2 | 10.0 | 20.1 | 10.3 | 1.3 | 11.5 | 6.5 | 6.5 | 8.2/26 |
О1 | 6.3 | 19.0 | 9.7 | н.о. | 0.1 | 25.6 | 1.5 | 0.4 | 13.8/н.о. |
К2 | 13.0 | 20.6 | 25.3 | 4.1 | н.о. | 16.2 | 3.0 | 25.3 | 10.7/н.о. |
О2 | 6.1 | 19.8 | 5.3 | н.о. | н.о. | 30.5 | 0.8 | 1.3 | 19.3/н.о. |
Примечание. Обозначения образцов здесь и в табл. 2–4: К1 – свежая водоросль; О1 – экскременты морского ежа, питавшегося свежей водорослью; К2 – разрушенная водоросль; О2 – экскременты морского ежа, питавшегося разрушенной водорослью. Процент: 1от массы сырой водоросли; 2от выхода веществ, растворимых в водном этаноле; 3от массы обезжиренной водоросли; 4от выхода водорастворимых веществ; н.о. – не определяли.
Таблица 2.
Образец | Вещества, нанесенные на ПХ-1 | Выход и характеристика веществ, элюированных с ПХ-1 | ||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Элюенты | ||||||||
H2O (фукоидан) | этанол–вода, 15% (ламинаран) | |||||||
масса, мг | углеводы*,% | выход, мг | углеводы*, % | моносахаридный состав, % Fuc/Gal/Xyl/Glc/Man/Rha | выход, мг | углеводы*, % | Glc | |
К1 | 1000 | 73.5 | 422.5 | 82 | 93.8/1.2/2.4/0.5/1.4/0.5 | 281 | 92.5 | 100 |
О1 | 760 | 59 | 490.4 | 47 | 54.7/21.2/5.2/5.3/11.3/2.3 | 24 | 49.3 | 98.2 |
К2 | 1011 | 48.5 | 258 | 64 | 84.6/10.6/2.8/0.0/2.0/0.0 | 403 | 100 | 99.4 |
О2 | 1005 | 39 | 400 | 44 | 51.8/24.1/1.7/4.6/12.1/5.8 | 73 | 27 | 97.3 |
В 13С-ЯМР-спектрах ламинаранов, выделенных из всех образцов, основными были сигналы, характерные для 1,3-β-D-глюканов C1 (104.08 м.д.), C2 (74.9 м.д.), C3 (86.1 м.д.), C4 (69.85 м.д.), C5 (77.3 м.д.) и C6 (62.47 м.д.). В качестве минорных отмечены сигналы, характерные для β-1,6-связанных остатков D-глюкозы и маннита. 13С-ЯМР-спектры ламинаранов, полученные из разных образцов водоросли, оказались подобны друг другу и аналогичны 13С-ЯМР-спектрам ламинаранов, известным из литературы (Zvyagintseva et al., 2003).
13С-ЯМР-спектры фукоиданов, выделенных из свежей (К1) и разрушенной (К2) S. cichorioides, а также из экскрементов S. intermedius (О1 и О2 соответственно), приведены на рис. 1.
Влияние экстрактивных веществ из разных образцов S. cichorioides на активность ламинариназы, оплодотворение и развитие эмбрионов морского ежа S. intermedius
Водно-этанольный экстракт из разрушенного образца водоросли содержал вещества, которые в 3.2 раза активировали ламинариназу морского ежа (рис. 2б). Водно-этанольные экстракты из других образцов водоросли активировали фермент в 1.4–1.8 раза (рис. 2а). При увеличении концентрации экстрактивных веществ активация фермента уменьшалась.
Водно-спиртовый экстракт из свежевыловленной бурой водоросли S. cichorioides (К1) вызывал 50% ингибирование спермиев морского ежа при концентрации экстракта 100 мкг/мл (рис. 3а). Это указывает на присутствие в свежих водорослях веществ, оказывающих ингибирующее действие на процессы оплодотворения S. intermedius. Вещества из разрушенной водоросли вызывали 50% ингибирование спермиев морского ежа при концентрации экстракта 375 мкг/мл (рис. 3а), а яйцеклеток – при концентрации ≥1000 мкг/мл. Вещества, выделенные из водно-спиртовых экстрактов экскрементов морского ежа после кормления животных обоими образцами водоросли, незначительно ингибировали оплодотворение, особенно после обработки ими яйцеклеток (рис. 3). Выделенные из водных экстрактов водоросли и из экскрементов морского ежа полисахариды до концентрации 1000 мкг/мл не оказывали ингибирующего действия на сперматозоиды и яйцеклетки морского ежа.
Вещества, извлеченные из водно-этанольных экстрактов свежей водоросли, обладали сильным токсическим действием при концентрации 100 мкг/мл и более. Экстракт свежей водоросли в концентрации 250 мкг/мл уже через 12 ч инкубации вызывал аномалии и гибель 50% эмбрионов (табл. 3). В концентрации ≥500 мкг/мл экстракт вызывал аномалии и гибель большинства эмбрионов на ранних стадиях. Водно-этанольные экстракты из разрушенной водоросли и экскрементов морского ежа не были токсичны по отношению к эмбрионам. Более того, выделенные из экскрементов морского ежа вещества оказывали положительное действие, увеличивая жизнеспособность эмбрионов до 30% (табл. 3).
Таблица 3.
Образец | Концентрация эстракта, мкг/мл | Время инкубации после оплодотворения, сут | Продолжительность жизни, сут | ||||
---|---|---|---|---|---|---|---|
0.5 | 1.5 | 2.5 | 5 | 10 | |||
Стадии развития** | |||||||
К | 0.0 | 11 < 12 | 22–23 | 23–24 | 25–26, ан. 30% | 25–26, ан. 10%, Г 30% | 10.0 ± 1.5 |
К1 | 10–100* | 11–12 | 23–24 | 23–24 | 23–25, ан. 50% | 26, ан. 50% | 10.0 ± 1.5 |
250 | 10–11, ан. 50%, Г 50% | 21–22, ан. 50%, Г 50% | 22–23, ан. 50%, Г 50% | 23–24, ан. 50%, Г 90% |
Г | 5.5 ± 1.5 | |
500–1000 | 10–11, ан., Г 90% | Г | – | – | – | 1.0 ± 0.5 | |
О1 | 10–1000 | 11–12, ан. 10% | 22–24, ан. 10% | 24–25, ан. 10% | 24–25, ан. 50%, Г 30% | 25–26, ан. 50%, Г 50% | 13.0 ± 1.0 |
К2 | 10–250 | 11–12, ан. 10% | 22–23, ан. 10% | 23–25, ан. 10% | 24–26, ан. 10%, Г 30% | 25–26, ан.10%, Г 50% | 11.5 ± 1.5 |
500–1000 | 10–12, ан. 20% | 21–22, ан. 10%, Г 50% | 21–23, ан. 10%, Г 50% | 24–26. ан., Г 50% |
25–26, ан., Г 70% |
10.0 ± 1.5 | |
О2 | 10–500 | 11 < 12 | 23< 24, ан. 10% | 23–25, ан. 50%, Г 10% | 24–26, ан. 50%, Г 20% |
25–26, ан. 50%, Г 50% |
10.0 ± 0.5 |
750–1000 | 11 < 12, ан. 10% | 23 < 24, ан. 10% | 23–24, ан. 10%, Г 30% | 25–26, ан. 50%, Г 30% |
25–26, ан. 50%, Г 60% |
13.5 ± 0.5 |
Примечание. *Интервал означает, что в пределах обозначенной концентрации результаты действия постоянны. **Стадии развития: 10 и 11 – средняя бластула 1 и 2 соответственно; 12 – поздняя бластула 1; 21 – стадия призмы 2; 22, 23 и 24 – ранний плутеус 1, 2 и 3 соответственно; 25 и 26 – средний плутеус 1 и 2 соответственно (Бузников, Подмарев, 1975); плотность клеток в инкубационной среде 2500/мл. Обозначения: Г – гибель эмбрионов; ан. – аномальное развитие эмбрионов. Действие веществ в концентрации выше 1000 мкг/мл не исследовали. Приведены результаты пяти экспериментов, доверительный интервал p ≤ 0.05.
Водные экстракты из водоросли и из экскрементов морского ежа оказывали положительное действие на жизнеспособность эмбрионов. При обработке оплодотворенных яйцеклеток экстрактами из водоросли в концентрации 500–1000 мкг/мл продолжительность жизни эмбрионов увеличивалась в 1.5–2.5 раза. Экстракты из экскрементов оказывали положительное действие на эмбрионы в концентрации ≥50 мкг/мл (табл. 4). Влияние на развитие морских ежей индивидуальных полисахаридов, полученных из этих экстрактов, различалось. Так, ламинаран из свежей и разрушенной водоросли в низких дозах (10–250 мкг/мл) не влиял на жизнеспособность эмбрионов, однако увеличение концентрации до 500–1000 мкг/мл приводило к аномалиям и ранней гибели эмбрионов (табл. 4). Ламинаран из экскрементов, полученных после кормления морских ежей разрушенной водорослью, не оказывал какого-либо влияния на эмбриональное развитие. Фукоидан из всех образцов водоросли увеличивал жизнеспособность эмбрионов преимущественно в низких дозах (≥10 мкг/мл). Фукоидан из экскрементов, наоборот, заметнее увеличивал их жизнеспособность в более высоких дозах (≥250 мкг/мл). В присутствии фукоиданов продолжительность жизни эмбрионов увеличивалась в 2 раза (табл. 4). Отметим, что более благоприятное влияние на развивающиеся эмбрионы оказывал фукоидан из разрушенной водоросли.
Таблица 4.
Полисахариды | Концентрация экстракта, мкг/мл | Время инкубации после оплодотворения, сут | Продолжительность жизни, сут | ||||
---|---|---|---|---|---|---|---|
0.5 | 1.5 | 3.5 | 5 | ||||
Стадии развития** | |||||||
Контроль | Морская вода | 10–11 | 22–23, Г 5% | 23–25, ан. 30%, Г 70% | 24–25, ан. 30%, Г 70% | 10.0 ± 1.5 | |
К1 | Н2О-экстракт (фукоидан и ламинаран) |
10–250* | 10–11 | 22–23 | 25 | 26 | 12.0 ± 1.5 |
500–1000 | 10–11 | 22–23 | 23–25, ан. 30% | 24–25, ан. 60%, Г 10% | 19.5 ± 2.0 | ||
Н2О-фракция (фукоидан) |
10–250 | 10–11 | 22–23 | 24–25 | 25–26, ан. 10% | 13.0 ± 1.0 | |
500–1000 | 9–10 > 11 | 22–23, ан. 10%, Г 5% | 24–25, ан. 10%, Г 50% | 25–26, ан. 25%, Г 50% | 10.5 ± 1.5 | ||
15% этанол (ламинаран) |
10–250 | 10–11 | 22–24, ан. 5%, Г 10% | 24, ан. 30%, Г 10% | 25–26, ан., Г, Л 50% | 12.0 ± 1.5 | |
500–1000 | 9–10 > 11, ан. 5% | 22–24, ан. 15%, Г 30% | 24, ан., Г 95% | Г | 4.0 ± 1.0 | ||
О1 | Н2О-экстракт | 10–25 | 10–11 | 22–23 | 24–26, ан. 30% | 26, ан. 30%, Г 10% | 10.0 ± 2.0 |
50–1000 | 10–11 | 22–23, ан. 50% | 24–26, ан. 50% | 26, ан. 50%, Г 10% | 15.5 ± 1.5 | ||
Н2О-фракция (фукоидан) |
10–100 | 10–11 | 22–23 | 23–25, ан. 50%, Г 30% | 25–26, ан., Г 40% | 11.5 ± 2.0 | |
250–1000 | 10–11 | 22–23, ан. 10%, Г 20% | 25–26, ан. 10%, Г 20% | 25–26, ан., Г 20% | 19.5 ± 1.5 | ||
К2 | Н2О-экстракт | 10–250 | 11 > 12 | 22–23 | 24–25 | 25–26 | 13.5 ± 1.0 |
500–1000 | 11 | 22–23 | 24–26, ан. 30% | 25–26, ан. 30% | 25.0 ± 3.0 | ||
Н2О-фракция (фукоидан) | 10–100 | 10–12 | 22–24 | 24–25, ан. 30% | 25–26, ан. 30%, Г 5% | 18.0 ± 2.0 | |
250–500 | 9 < 10–11 | 22–24, ан. 5%, Г 10% | 24–25, ан. 5%, Г 30% | 25–26, ан. 50%, Г 40% | 15.5 ± 2.0 | ||
1000 | 8–9 < 10 > 11, ан. | 21–23, ан. 10%, Г, Л 30% | 21–24, ан., Г, Л 40% | 24, ан., Г, Л 50% | 10.5 ± 2.0 | ||
15% этанол (ламинаран) | 10–250 | 10–11 | 22–24 | 24–25 | 25–26, Г 50% | 10.5 ± 1.0 | |
500–1000 | 8–9 < 10 > 11, ан. | 22–24, ан., Г 5% | 24–25, ан., Г 75% | Г | 4.5 ± 0.5 | ||
О2 | Н2О-экстракт | 10–50 | 11 > 12 | 22–23 | 24–26, ан. 20% | 25–26, ан. 40%, Г 10% | 13.0 ± 1.5 |
100–1000 | 11 | 22–24, ан. 10% | 24–26, ан. 40% | 25–26, ан. 50% | 21.5 ± 1.0 | ||
Н2О-фракция (фукоидан) | 10–100 | 10–11 | 22–24, ан. 5% | 24–25, ан. 5%, Г 30% | 24–25, ан. 5%, Г 35% | 13.5 ± 1.5 | |
250–1000 | 10–11 | 22–24 | 25, Г 30% | 25, ан. 50%, Г 40% | 18.0 ± 2.0 | ||
15% этанол (ламинаран) | 10–1000 | 10–11 | 23–24, ан. 10%, Г 15% | 24–25, ан. 10%, Г 30% | 25, ан. 50%, Г 50% | 10.5 ± 0.5 |
Примечание. Вещества добавляли на стадии зиготы. Названия образцов, как в табл. 1 и 2. ** Стадии развития: 8, 9 – ранняя бластула 1 и 2 соответственно. Л – лизис бластомеров. Остальные стадии развития и обозначения, как в табл. 2 и 3.
ОБСУЖДЕНИЕ
Ранее сообщалось, что морские ежи практически не едят свежие водоросли, но активно поедают разрушающиеся в конце жизненного цикла растения (Крупнова, Павлючков, 2003). Сравнительное исследование пищевой привлекательности свежей и разрушенной водоросли S. cichorioides подтвердило эти наблюдения и показало, что морской еж S. intermedius почти не питался свежими растениями, но за сутки съедал более 50% разрушенной S. cichorioides. Для выяснения причин предпочтения морским ежом разрушающихся водорослей исследовали влияние на пищеварительный фермент, оплодотворение и развитие эмбрионов морского ежа водно-этанольных экстрактов из свежей и разрушенной водоросли, а также из экскрементов, полученных после поедания животными этих образцов водоросли. Было выяснено, как изменяются выход и состав ключевых веществ в процессе разрушения и поедания водоросли морским ежом, что позволило определить спектр веществ, усваиваемых этими животными.
Выход и состав веществ из образцов свежей и разрушенной S. cichorioides
Состав веществ водно-этанольных и водных экстрактов различался в зависимости от образца S. cichorioides (табл. 1). Доля водорастворимых веществ значительно возрастала в разрушенной водоросли и в экскрементах животных при обоих вариантах кормления. Показано, что морской еж хорошо усваивал маннит (особенно из разрушенной водоросли), аминокислоты, белок и ламинаран (табл. 1), но не усваивал фукоидан. Более того, в экскрементах животных в 1.5 и в 2 раза увеличивалось относительное количество фукоидана по сравнению с его содержанием в свежей и разрушенной S. cichorioides соответственно. Ранее было показано, что экскременты морского ежа, питавшегося S. japonica, содержали в 3–5 раз больше фукоидана, чем контрольные образцы водоросли (Агаркова, 2007). Это значительно выше количества фукоидана, содержавшегося в экскрементах животных, питавшихся S. cichorioides. Различия касаются и структурных характеристик фукоиданов. В экскрементах морского ежа, питавшегося S. japonica, фукоидан являлся гетерополисахаридом, а в экскрементах животных, питавшихся S. cichorioides, – галактофуканом, обогащенным остатками маннозы (табл. 2).
Характеристика полисахаридов водных экстрактов из разных образцов S. cichorioides
Полисахариды были выделены из всех образцов водоросли. Сравнительное изучение деталей их структуры химическими методами (табл. 2) и ЯМР-спектроскопией показало, что ламинараны из исследуемых образцов являлись 1,3;1,6-β-D-глюканами, имевшими не более 10% β-1,6-связанных остатков D-глюкозы в качестве разветвлений, что типично для основной структурной группы этих полисахаридов (Zvyagintseva et al., 2003). По сравнению с исходными водорослями, в экскрементах морского ежа возрастала доля фукоидана и значительно изменялась его структура (табл. 2, рис. 1). Ранее установлено, что фукоидан свежей S. cichorioides представляет собой сполна сульфатированный 1,3-α-L-фукан (Zvyagintseva et al., 2003). Из свежей S. сichorioides нами выделен высокосульфатированный фукоидан (сигналы при 17 м.д. наиболее интенсивные) (рис. 1), что согласуется с литературными данными. Фукоидан, выделенный из экскрементов, был гетерогенен, и кроме остатков фукозы в его состав в заметных количествах входили остатки маннозы и галактозы (табл. 2, рис. 1). 13С-ЯМР-спектры нативных фукоиданов трудно интерпретируемые, но отчетливо отражают качественные различия между фукоиданами, выделенными из свежей и разрушенной S. cichorioides, а также из экскрементов морского ежа (рис. 1). В 13С-ЯМР-спектрах фукоиданов можно выделить сигналы С6 остатков фукозы (16–17 м.д., см. рис. 1б) и соотнести эти сигналы со степенью сульфатирования. Сигналы при 16 м.д. принадлежат слабосульфатированным, а при 17 м.д. – высокосульфатированным остаткам фукозы. Фукоидан, выделенный из экскрементов морского ежа, низкосульфатирован (наиболее интенсивные сигналы при 16 м.д., см. рис. 1). Таким образом, в процессе переваривания водоросли животными фукоидан не усваивается, но видоизменяется: уменьшается степень его сульфатирования (рис. 1). Выделенные из исходных образцов S. сichorioides фукоиданы содержат примесь маннита (сигналы, соответствующие манниту: 64, 70 и 72 м.д.). В экскрементах морских ежей исчезают сигналы, принадлежащие манниту (рис. 1), что подтверждает его усвоение животными (табл. 1). Таким образом, сравнение химического состава экскрементов с исходными образцами позволило идентифицировать ряд веществ, усваиваемых морскими ежами. Ранее подобные данные были получены для Saccharina japonica, поедая которую морские ежи также усваивали маннит и аминокислоты, но не усваивали фукоидан (Агаркова и др., 2005, 2007).
Влияние водно-этанольных экстрактов из разных образцов водоросли на активность ламинариназы S. intermedius
Привлечение морских животных или защита от животных, поедающих водоросли, могут быть связаны с индукцией водорослями биосинтеза веществ, активирующих или подавляющих ферменты пищеварительного тракта животных. В водоросли при разрушении накапливается активатор пищеварительного фермента морского ежа 1 → 3-β-D-глюканазы. Действие активатора достигает максимума при концентрации 50 мкг/мл и уменьшается с увеличением концентрации (рис. 2). Возможно, это связано с присутствием в экстракте ингибитора ламинариназы морского ежа, действие которого начинает проявляться при высоких концентрациях экстракта. В свежей водоросли и в экскрементах животного содержание активатора намного меньше (рис. 2). Таким образом, при разрушении водоросли накапливаются вещества, активирующие пищеварительный фермент морского ежа, что хорошо согласуется с наблюдаемым в природе предпочтением морскими ежами разрушенных водорослей в качестве пищи (Крупнова, Павлючков, 2003). Ранее было установлено, что маннит, глутаминовая кислота и флоротанины не влияют на активность 1 → 3-β-D-глюканазы S. intermedius (Агаркова и др., 2007). Химическую природу активатора предстоит выяснить.
Влияние водно-этанольных экстрактов из разных образцов водоросли на оплодотворение и развитие эмбрионов морского ежа
Полученные из бурых водорослей вещества, растворимые в водном этаноле, ингибируют процессы оплодотворения морского ежа, причем сперматозоиды более чувствительны к воздействию, чем яйцеклетки (рис. 3), что согласуется с литературными данными (Диннел, 1995; Киселёва и др., 2015). Экстрактивные вещества из свежей водоросли оказывали более сильное ингибирующее действие на оплодотворение, чем вещества из разрушенной водоросли (рис. 3). Таким образом, в зарослях, состоящих из крепких растений, процесс размножения морских ежей под воздействием выделяемых растениями веществ ингибируется более эффективно, чем среди разрушающихся талломов. Наблюдения за морскими ежами в природе подтверждают, что они охотнее заселяют заросли, состоящие из разрушающихся талломов водорослей, которые служат пищей и способствуют процессу размножения этих животных.
Водно-этанольные экстрактивные вещества из разрушенной водоросли и из обоих вариантов экскрементов стимулировали развитие эмбрионов, увеличивая продолжительность их жизни на 15–30% по сравнению с таковой в контроле. Это хорошо согласуется с тем, что в природе морские ежи предпочитают размножаться вдали от растущих водорослей (Крупнова, Павлючков, 2003).
Водные экстракты из образцов водоросли и полученные из них полисахариды оказывали положительное действие на развивающиеся эмбрионы (табл. 4), за исключением ламинарана в высокой дозе (≥500 мкг/мл) как из свежей, так и из разрушенной водоросли.
Таким образом, пищевая привлекательность разрушенных или разрушающихся талломов бурой водоросли S. cichorioides, вероятно, обусловлена наличием в них активатора 1 → 3-β-D-глюканазы – пищеварительного фермента морского ежа, что, возможно, характерно и для других бурых водорослей. Химическая природа веществ, активирующих 1 → 3-β-D-глюканазу морского ежа, может различаться. Кроме этого, среди вторичных метаболитов свежей бурой водоросли S. cichorioides, которые извлекаются водным этанолом, присутствуют вещества, ингибирующие процессы оплодотворения. Обнаружение активаторов пищеварительных ферментов морского ежа в разрушенных или разрушающихся бурых водорослях и ингибиторов процессов оплодотворения в свежих крепких водорослях подтверждено натурными наблюдениями.
Проведенное биохимическое исследование показало, что процессы пищеварения и размножения морского ежа S. intermedius контролируются выделяемыми водорослями веществами, состав и структура которых зависят от вида водоросли. Так, S. cichorioides и S. japonica значительно различаются по содержанию ламинаранов (Elyakova, Zvyagintseva, 1974; Звягинцева и др., 1994), а также по содержанию и структурам фукоиданов (Zvyagintseva et al., 2003; Ozawa et al., 2006; Vishchuk et al., 2013). В S. cichorioides ингибирующее действие на ламинариназы морских беспозвоночных оказывало вещество белковой природы (Ермакова и др., 2001). Из S. japonica в качестве ингибитора ламинариназы морского ежа выделена фракция, состоящая из углеводов и полифенолов (Агаркова и др., 2007). Анализ данных, относящихся к экскрементам и содержащимся в них веществам, показал значительное отличие химического состава экскрементов от такового образца водоросли, из которой они получены, что позволило идентифицировать ряд соединений, усваиваемых морскими ежами. Интересным кажется изменение структуры фукоидана в процессе разрушения S. cichorioides или переваривания ее морским ежом S. intermedius, наглядно показанное с помощью 13С-ЯМР (рис. 1). Предстоит выяснить структуру активаторов пищеварительных ферментов морских ежей в разрушенных или разрушающихся талломах S. cichorioides и ингибиторов процессов оплодотворения. Для дальнейшего изучения деталей сосуществования морских ежей и водорослей необходимо расширять спектр изучаемых макрофитов, чтобы найти реальные корреляции между особенностями поведения морских ежей и биологическими свойствами метаболитов разных видов водорослей.
Список литературы
Агаркова В.В., Крупнова Т.Н., Звягинцева Т.Н. Экстрактивные вещества бурой водоросли Laminaria japonica и их действие на эндо-1 → 3-β-D-глюканазу серого морского ежа Strongylocentrotus intermedius // Сб. статей II Международ. конф. “Морские прибрежные экосистемы: водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки”. М.: ВНИРО. 2005. С. 242–244.
Агаркова В.В., Крупнова Т.Н., Ермакова С.П. и др. Действие экстрактивных веществ Laminaria japonica на 1,3-β-D-глюканазу – пищеварительный фермент морского ежа Strongylocentrotus intermedius // Прикладная биохим. и микробиол. 2007. Т. 43. № 4. С. 511–517.
Агаркова В.В. Биохимические основы биотических взаимоотношений серого морского ежа Strongylocentrotus intermedius и бурой водоросли Laminaria japonica: Автореф. дис. … канд. биол. наук. Владивосток. 2007. 20 с.
Белоус О.С., Титлянова Т.В., Титлянов Э.А. Морские растения бухты Троицы и смежных акваторий // Морские растения бухты Троицы и смежных акваторий (залив Петра Великого, Японское море). Владивосток: Дальнаука. 2013. С. 152–214.
Бузников Г.А., Подмарёв В.К. Морские ежи Strongylocenrotus drobachinensis, S. nudus, S. intermedius // Методы биологии развития. М.: Наука. 1975. С. 188–216.
Диннел П.А. Эволюция и современный статус биотеста, основанного на оценке оплодотворяющей способности сперматозоидов морского ежа (Sea urchin sperm test) // Биол. моря. 1995. Т. 21. № 6. С. 390–397.
Ермакова С.П., Бурцева Ю.В., Сова В.В. и др. Белки бурых водорослей – ингибиторы эндо-1,3-β-D-глюканаз морских беспозвоночных // Биохимия. 2001. Т. 66. № 2. С. 234–241.
Звягинцева Т.Н., Широкова Н.И., Елякова Л.А. Структура ламинаранов из некоторых бурых водорослей // Биоорган. химия. 1994. Т. 20. № 12. С. 1349–1358.
Киселёва М.И., Шевченко Н.М., Крупнова Т.Н., Звягинцева Т.Н. Влияние фукоиданов на развивающиеся эмбрионы морского ежа Strongylocentrotus intermedius // Журн. эвол. биохим. и физиол. 2005. Т. 41. № 1. С. 51–57.
Киселёва М.И., Ермакова С.П., Звягинцева Т.Н. Действие белков и полисахаридов бурых водорослей на оплодотворение яйцеклеток и развитие эмбрионов морского ежа Strongylocentrotus intermedius A. Agassiz, 1863 // Биол. моря. 2015. Т. 41. № 6. С. 437–446.
Крупнова Т.Н., Павлючков В.А. Пищевые потребности морского ежа Strongylocentrotus intermedius в естественных условиях на ламинариевых полях // Изв. ТИНРО. 2003. Т. 134. С. 195–208.
Левин В.С., Найденко В.П., Туркина Н.А. Интенсивность питания морского ежа Strongylocentrotus intermedius в экспериментальных условиях // Сб. науч. тр. “Исследования иглокожих дальневосточных морей” ДВО АН СССР. Владивосток: ИБМ ДВО АН СССР. 1987. С. 56–82.
Сова В.В., Широкова Н.И., Кусайкин М.И. и др. 1 → 3-β-глюканаза из неоплодотворенных яйцеклеток морского ежа Strongilocentrotus intermedius. Сравнение с 1 → 3-β-глюканазами морского и наземного моллюсков // Биохимия. 2003. № 68. Вып. 5. С. 650–655.
Усов А.И., Чижов О.С. Химические исследования водорослей // Новое в жизни, науке, технике. Сер. Химия. М.: Знание. 1988. № 5. С. 48.
Broadway R.M. Resistance of plants to herbivorous insects: Can this resistance fail? // Can. J. Plant Pathol. 1996. V. 18. P. 476–481.
de Nys R., Coll J.C., Price I.R. Chemically mediated interactions between the red alga Plocamium hamatum (Rhodophyta) and the octocoral Sinularia cruciata (Alcyonacea) // Mar. Biol. 1991. V. 108. P. 315–320.
Deal M.S., Hay M.E., Wilson D. et al. Galactolipids rather than phlorotannins as herbivore deterrents in the brown seaweed Fucus vesiculosus // Oecologia. 2003. V. 136. P. 107–114.
Dinnel P.A., Link J.M., Stober O.J. Improved methodology for a sea urchin sperm cell bioassay for marine waters // Arch. Environ. Contam. Toxicol. 1987. V. 16. P. 23–32.
Dodgson K.S., Price R.G. A note on the determination of the ester sulphate content of sulphated polysaccharides // Biochem. J. 1962. V. 84. P. 106–110.
Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K. et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances // Anal. Chem. 1956. V. 28. P. 350–356.
Duggins D.O., Eckman J.E. Is kelp detritus a good food for suspension feeders? Effects of kelp species, age and secondary metabolites // Mar. Biol. 1997. V. 128. P. 489–495.
Elyakova L.A., Zvyagintseva T.N. A study of the laminarins of some far-eastern brown seaweeds // Carbohyd. Res. 1974. V. 34. P. 241–248.
Fitton J.H. Brown marine algae: A survey of therapeutic potentials. Altern. Complementary Ther. 2003. V. 9. № 1. P. 29–33.
Kiseleva M.I., Balabanova L.A., Rasskazov V.A., Zvyagintseva T.N. Effect of 1,3;1,6-β-D-glucans on developing sea urchin embryos // Mar. Biotechnol. 2008. V. 10. № 4. P. 466–470.
Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P. 265–275.
Nakamura N., Moriya M. Purification and partial characterization of a lectin-like protein from the sea algae Laminaria diabolica that induces fertilization envelope formation in sea urchin eggs // Zool. Sci. 1999. V. l. 6. № 2. P. 247–253.
Nelson N. A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of glucose // J. Biol. Chem. 1944. V. 153. P. 375–381.
Ono S., Umezaki M., Tojo N. et al. Cyclic and linear peptides derived from α-amylase inhibitory protein tendamistat // J. Biochem. 2001. V. 129. P. 783–790.
Ozawa T., Yamamoto J., Yamagishi T. et al. Two fucoidans in the holdfast of cultivated Laminaria japonica // J. Nat. Med. 2006. V. 60. № 3. P. 236–239.
Pawlik J.R. Chemical ecology of the settlement of benthic marine invertebrates // Oceanogr. Mar. Biol.: Annu. Rev. 1992. V. 30. P. 273–335.
Parys S., Kehraus S., Pete R. et al. Seasonal variation of polyphenolics in Ascophyllum nodosum (Phaeophyceae) // Eur. J. Phycol. 2009. V. 44. P. 331–338.
Pelletreau K., Muller-Parker G. Sulfuric acid in the phaeophyte alga Desmarestia munda deters feeding by the sea urchin Strongylocentrotus droebachiensis // Mar. Biol. 2002. V. 141. P. 1–9.
Sova V.V., Elyakova L.A., Vaskovsky V.E. The distribution of the laminarinases in marine invertebrates // Comp. Biochem. Physiol. 1970. Vol. 32. No. 3. P. 459–464.
Steinberg P.D., van Altena I. Tolerance of marine invertebrate herbivores to brown algal phlorotannins in temperate Australasia // Ecol. Monogr. 1992. V. 62. P. 189–222.
Schnitzler I., Boland W., Hay M.E. Organic sulfur compounds from Dictyopteris spp. deter feeding by an herbivorous amphipod (Ampithoe longimana) but not by an herbivorous sea urchin (Arbacia punctulata) // J. Chem. Ecol. 1998. V. 24. № 10. P. 1715–1732.
Taylor R.B., Sotka E., Hay M.E. Tissue-specific induction of herbivore resistance: seaweed response to amphipod grazing // Oecologia. 2002. V. 132. P. 68–76.
Vaskovsky V.E., Isay S.V. Quantitative determination of formaldehyde liberated with periodate oxidation // Anal. Biochem. 1969. V. 30. P. 25–31.
Vishchuk O.S., Ermakova S.P., Zvyagintseva T.N. The fucoidans from brown algae of Far-Eastern seas: Anti-tumor activity and structure–function relationship // Food Chem. 2013. V. 141. № 2. P. 1211–1217.
Zvyagintseva T.N., Shevchenko N.M., Popivnich I.B. et al. A new procedure for the separation of water-soluble polysaccharides from brown seaweeds // Carbohydr. Res. 1999. V. 322. P. 32–39.
Zvyagintseva T.N., Shevchenko N.M., Chizhov A.O. et al. Water-soluble polysaccharides of some far-eastern brown seaweeds. Distribution, structure, and their dependence on the developmental conditions // J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 2003. V. 294. № 1. P. 1–13.
Дополнительные материалы отсутствуют.