Биология внутренних вод, 2020, № 3, стр. 299-305

ВВЕДЕНИЕ

Морские двустворчатые моллюски-фильтраторы – организмы наиболее устойчивые к действию широкого ряда стрессирующих факторов водной среды (Фокина и др., 2011; Gostyukhina, Andreenko, 2019; Livingstone, 2001; Manduzio et al., 2005; Trevisan et al., 2016). К ним относят колебания температуры воды, уровня кислорода, солености, состава и доступности пищи в связи с сезонами года, приливно-отливными явлениями, а также воздействие хищников, загрязняющих веществ и другие (Livingstone, 2001; Manduzio et al., 2005; Morozov et al., 2017; Welker et al., 2013).

Известно, что влияние стресс-факторов реализуется преимущественно через развитие в клетке окислительного стресса, способного нарушать структуру и функции белков, липидов, нуклеиновых кислот, углеводов (Окислительный…, 2006; Gostyukhina, Golovina, 2013; Lushchak, 2011; Welker et al., 2013). Двустворчатые моллюски выработали ряд адаптаций, позволяющих им в условиях ОС сохранять полноценный метаболизм. Среди них особое место занимают системы АО защиты, участвующие в поддержании необходимого баланса между про- и антиоксидантными процессами, в том числе АГС (Livingstone, 2001; Lushchak, 2011; Manduzio et al., 2005; Regoli, Giuliani, 2014; Regoli, Principato, 1995; Welker et al., 2013).

У двустворчатых моллюсков выделяют виды c разной устойчивостью к ОС. К одним из наиболее устойчивых организмов Черного моря относят представителей массовых видов моллюсков – сердцевидку Cerastoderma glaucum (Bruguière, 1789), мидию Mytilus galloprovincialis (Lamarck, 1819), анадару Anadara kagoshimensis (Tokunaga, 1906) и др. Однако резистентность этих моллюсков к ОС может быть обусловлена разными, специфическими для каждого вида, особенностями АО системы, связанными с их экологическим и физиолого-биохимическим статусом. В частности, большое значение в работе АО системы моллюсков имеют тканевые особенности, физиологическое состояние моллюсков, соотношение вклада ферментного и низкомолекулярного звена (Истомина и др., 2011; Климова, Чуйко, 2015; Gostyukhina, Andreenko, 2019; Gostyukhina, Golovina, 2013; Livingstone, 2001; Lushchak, 2011), а также соотношение ключевых показателей АО защиты и ОС (Edge et al., 2012). Показаны различия в функционировании АО комплекса и для особей близких видов (дрейссен) (Климова, Чуйко, 2015) или одного вида (на примере мидии) с учетом цветовой морфы или степени пигментации тканей моллюсков (Gostyukhina, 2013).

Основная масса исследований связана с определением ответных реакций АО комплекса двустворчатых моллюсков на действие тех или иных природных и антропогенных факторов, что, безусловно, имеет практическую ценность для экодиагностики (Livingstone, 2001; Macías-Mayorga et al., 2015; Manduzio et al., 2005; Nardi et al., 2018; Regoli, Principato, 1995). Гораздо меньше доля сравнительных исследований с целью выявления конститутивных черт АО системы, специфических у разных видов моллюсков, что во многом определяет соответствующую устойчивость этих видов к ОС. Так, в АО защите мидии отмечено преобладание ферментного звена, в то время как у анадары – совместная работа низкомолекулярного и ферментного звеньев АО комплекса (Gostyukhina, Andreenko, 2019). Установлены три типа реагирования на гипоксию у пяти видов моллюсков, обитающих при разном кислородном режиме, – увеличение, падение и неизменный уровень АО активности (Истомина и др., 2011), что связывают с колебанием уровня кислорода при приливно-отливных явлениях. Обнаружены различия у других моллюсков с разной устойчивостью к ОС – эврибионтной мидии Грэя Crenomytilus grayanus (Dunker, 1853) и стеноксифильного гребешка Mizuhopecten yessoensis (Jay, 1857) (Belcheva et al., 2016). Зарегистрированы различия в уровне АО параметров у близких видов – дрейссен Dreissena polymorpha (Pallas, 1771) и D. bugensis (Andrusov, 1897) из Рыбинского водохранилища (Климова, Чуйко, 2015), а также гребешков Adamussium colbecki (Smith, 1902) и Pecten jacobaeus (L., 1758) из разных биотопов (Viarengo et al., 1995).

Цель работы – определить особенности антиоксидантной глутатионовой системы и ПОЛ у сердцевидки Cerastoderma glaucum, моллюска с высокой устойчивостью к окислительному стрессу.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования были взрослые особи сердцевидки C. glaucum с длиной раковины 25–28 мм. Моллюсков собирали одновременно в начале мая 2018 г. в условно чистой акватории – прибрежной зоне бухты Казачья Черного моря около г. Севастополь (44°34′30′′ с.ш., 33°24′45′′в.д.) на глубине 0.5–0.7 м, количество особей в выборке – 15–17.

Моллюсков выдерживали в аквариумах с проточной морской водой в течение 2–3 сут для снятия стресса после транспортировки. Ткани гепатопанкреаса, жабр и ноги гомогенизировали при температуре 0–4°С стеклянным гомогенизатором Поттера-Эльвейема (стекло-тефлон). Гомогенаты центрифугировали при 3200 g в течение 15 мин с помощью рефрижераторной центрифуги К-23D (Германия). В полученных супернатантах активность ГП определяли по накоплению GSSG и выражали в мкмоль GSSG/(мин · мг белка), активность ГР – по уменьшению уровня НАДФН в нмоль НАДФН/(мин · мг белка) (Переслегина, 1989). Содержание GSH оценивали по образованию комплекса с аллоксановым реактивом в гомогенатах, приготовленных на основе 5%-ного раствора метафосфорной кислоты. Уровень GSH выражали в мкг/г ткани (Путилина, 1982). Интенсивность ПОЛ оценивали по образованию ТБК-активных продуктов и выражали в мкмоль МДА/г ткани (Ohkawa et al., 1979). Оптическую плотность растворов определяли на спектрофотометре СФ-2000. Активность ферментов измеряли при температуре 25°С. Достоверность полученных различий оценивали с помощью U-критерия Манна–Уитни. Различия считали статистически значимыми при р ≤ 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Содержание ПОЛ во всех исследованных тканях сердцевидки было близким по значению (табл. 1). Показатели АГС, напротив, имели выраженную тканевую специфику. Наименьший уровень GSH зарегистрирован в жабрах сердцевидки, в гепатопанкреасе и ноге моллюска значения были выше в 2.1–2.3 раза (р ≤ 0.05) (табл. 1). В гепатопанкреасе выявлена наибольшая активность ГП, что в 1.7–4.2 раза выше (р ≤ 0.01), чем в жабрах и ноге моллюска (табл. 1). Наиболее высокая активность ГР обнаружена в жабрах сердцевидки, различия с гепатопанкреасом и ногой были 3.1–5.8 раза (р ≤ 0.001) (табл. 1). Известно, что интенсивность ПОЛ и АО активность в клетке находятся в состоянии постоянного динамического равновесия (Edge et al., 2012; Livingstone, 2001; Lushchak, 2011). Одним из показателей такого равновесия считают отношение уровня GSH и ПОЛ (содержание МДА) – GSH/MДA (Edge et al., 2012), отражающее интенсивность АО процессов и ПОЛ. Высокие значения коэффициента GSH/ MДA (>5) зарегистрированы в тканях гепатопанкреаса и ноги, в жабрах он был в >2 раза ниже (табл. 1).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Для более полного представления об особенностях АГС сердцевидки нами проведен сравнительный анализ полученных у этого вида данных с таковыми у других черноморских двустворчатых моллюсков – анадары Anadara kagoshimensis (Tokunaga, 1906) и мидии Mytilus galloprovincialis (Lamarck, 1819), имеющих, как и сердцевидка, высокую устойчивость к ОС (Gostyukhina, 2013; Gostyukhina, Andreenko, 2019; Gostyukhina, Golovina, 2013).

У анадары и мидии наблюдались выраженная тканевая специфика ПОЛ и снижение этого показателя в ряду тканей гепатопанкреас‒жабры–нога. По абсолютным величинам сердцевидка существенно уступала анадаре и мидии как по уровню ПОЛ – в 3.2–16.3 раза (р ≤ 0.01–0.001) (рис. 1а), так и по уровню GSH. Здесь наиболее выраженные различия обнаружены между сердцевидкой и анадарой – в 3.5–5.5 раза (р ≤ 0.01–0.001) в жабрах и ноге, а между сердцевидкой и мидией – только в ноге, в 1.6 раза (р ≤ 0.05) (рис. 1б). В активности ГП наибольшие различия между моллюсками выявлены в гепатопанкреасе – у сердцевидки активность фермента в 3.4–6.7 раза превышала (р ≤ 0.05–0.001) таковую у анадары и мидии (рис. 1в). Обнаружены существенные межвидовые различия и в активности ГР – у сердцевидки она была больше в 12.5–12.7 раза (р ≤ 0.001) в жабрах и в 2.3–5.6 раза (р ≤ 0.01) – в ноге и гепатопанкреасе, чем у двух других видов (рис. 1г).

Рис. 1.

Содержание продуктов ПОЛ (a), глутатиона (б) и активность ГП (в), ГР (г) в тканях сердцевидки (1), анадары (2) и мидии (3): Г – гепатопанкреас, Ж – жабры, Н – нога. * Значимые различия между видами (p ≤ 0.05–0.001, n = 15–17).

Для оценки уровня АО-активности и ПОЛ у разных видов моллюсков рассчитан коэффициент GSH/MДA в тканях сердцевидки, анадары и мидии (табл. 2). Наиболее высокие значения коэффициента GSH/MДA получены для тканей сердцевидки. В гепатопанкреасе и жабрах C. glaucum коэффициент был в 3.0–8.4 и в 1.4–7.9 раза выше, чем у анадары и мидии. В тканях ноги подобные различия наблюдали только между сердцевидкой и мидией – в 5.1 раза, исключение – нога анадары, где этот коэффициент был самым высоким и равен 9.9.

Об особенностях функционирования АГС в тканях сердцевидки позволяет судить соотношение содержания GSH и активности глутатион-зависимых ферментов, их соотношение с интенсивностью ПОЛ в тканях, а также сопоставление полученных величин с таковыми в тканях других видов. На фоне одинаково низкого уровня ПОЛ во всех исследованных тканях сердцевидки наблюдали разное состояние АГС, отличающееся от такового у мидии и анадары. Наиболее выраженные различия обнаружены в жабрах.

В жабрах сердцевидки на фоне наименьшего уровня GSH наблюдали наиболее высокую из всех ее тканей активность ГР и сравнительно высокую активность ГП. Известно, что активность ГП и скорость инактивации перекиси водорода напрямую зависят от содержания в клетке GSH (Кулинский, Колесниченко, 2009). Очевидно, глутатион активно используется в качестве кофактора ГП в реакциях инактивации пероксида водорода и гидроперекисей, а высокоактивная ГР наращивает ресурс этого метаболита (Окислительный…, 2006). Несмотря на высокую активность ГР, содержание GSH остается минимальным среди всех исследованных тканей сердцевидки. Предположительно, это связано с частичной инактивацией глутатиона вследствие ряда причин, среди которых можно выделить следующие.

Возможны высокие и отчасти невосполнимые затраты глутатиона при замещении им функции ГП. Филогенетическое сравнение показало, что роль ГП в АО защите двустворчатых моллюсков не столь велика, как у млекопитающих. По-видимому, в случае недостаточной активности ГП ее функции могут быть замещены другими антиоксидантами, в том числе глутатионом (Livingstone, 2001; Regoli, Principato, 1995).

Кроме того, низкое содержание GSH в жабрах сердцевидки, очевидно, сопровождается повышением уровня окисленного глутатиона, который в условиях ОС может реагировать с сульфгидрильными группами белков, образуя с ними смешанные дисульфиды (Кулинский, Колесниченко, 2009). В этом случае GSSG выводится из цикла восстановления GSH, что может служить одной из причин низкого уровня GSH в жабрах, несмотря на высокоактивную ГР.

Высокую величину соотношения восстановленного и окисленного глутатиона (GSH/GSSG) считают критически важной для эффективной работы АО системы в клетке (Кулинский, Колесниченко, 2009; Regoli, Giuliani, 2014). Следовательно, более низкий, чем у анадары, уровень GSH, выявленный нами в жабрах сердцевидки, и, вероятно, более низкое отношение GSH/GSSG могут быть связаны с высоким уровнем окислительных процессов у C. glaucum, несмотря на низкий уровень ПОЛ. В дальнейшем это может привести к росту чувствительности и снижению устойчивости жабр моллюска к ОС, что подтверждается и более низким значением коэффициента GSH/МДА в жабрах сердцевидки, чем в других тканях.

Нельзя исключить, что в жабрах сердцевидки АО функция глутатиона дополняется другими антиоксидантами – например, СОД, которая способна инактивировать ряд тех же субстратов, что и глутатион, а не только супероксидный анион-радикал. Это согласуется и с представлением о взаимозаменяющих свойствах элементов АО комплекса (Окислительный…, 2006).

Известно, что гипоксия стимулирует генерацию АФК (Фокина и др., 2011; Lushchak, 2011; Welker et al., 2013), истощает пул GSH и усиливает окислительное повреждение (Кулинский, Колесниченко, 2009). Так как особи исследованных видов – бентосные организмы, то они могут периодически испытывать дополнительные риски дефицита кислорода. В отличие от мидии, прикрепляющейся к субстратам, анадара и сердцевидка способны неглубоко зарываться в грунт (Borzykh, Zvereva, 2015; Velez et al., 2016), что создает дополнительную гипоксическую нагрузку на их организм. В таких условиях устойчивость особей этих видов к ОС обусловлена рядом специфических черт их метаболизма. Известно, что устойчивость анадары, во многом определяется наличием гемоглобина (Borzykh, Zvereva, 2015), особой организацией энергетического метаболизма (Golovina et al., 2016), а также активным участием в АО защите как ферментного, так и низкомолекулярного звена (Gostyukhina, Andreenko, 2019). У сердцевидки, вероятно, велика роль АГС и специфики соотношения ее параметров с уровнем ПОЛ – на фоне более низкого, чем у анадары и мидии, уровня ПОЛ выше активность ГП (гепатопанкреас, жабры) и ГР (все ткани), что свидетельствует о конститутивно более высокой, чем у анадары и мидии, активности АГС. По-видимому, это служит адаптацией тканей сердцевидки к обитанию в среде с периодическим дефицитом кислорода. Наличие конститутивно более активной АО системы считают одной из стратегий устойчивости водных животных к ОС (Welker et al., 2013).

Состояние АГС сердцевидки, возможно, связано и с действием загрязнения при накоплении поллютантов в донных осадках. Известно, что жабры наиболее чувствительны к ОС при действии поллютантов в силу их структуры и функции фильтрации (Regoli, Principato, 1995; Trevisan et al., 2016). Кроме того, высокий уровень ПОЛ – широко распространенный маркер ОС у гидробионтов, в том числе двустворчатых моллюсков (Livingstone, 2001; Lushchak, 2011; Morozov et al., 2017; Regoli, Giuliani, 2014). Однако имеются сведения, что уровень ПОЛ может оставаться неизменным при загрязнении (Edge et al., 2012). В связи с этим, низкий уровень ПОЛ во всех тканях сердцевидки позволяет рассматривать особенности АГС моллюска как маркер ОС при действии поллютантов. Ответные реакции АГС у моллюсков при загрязнении могут быть разнонаправленными. Так, под действием тяжелых металлов отмечено снижение уровня GSH (Cossu et al., 2000; Regoli, Principato, 1995), однако, активность ферментов не менялась (Regoli, Principato, 1995). Органические загрязнители также ведут к снижению уровня GSH и активности АО ферментов у моллюсков (Cossu et al., 2000). Уменьшение ресурса GSH при загрязнении нередко сочетается как с усилением интенсивности ПОЛ (Cossu et al., 2000), так и с понижением активности ГП и ГР (Cossu et al., 2000; Kidd, 1997). Изменения в состоянии АГС моллюсков при загрязнении показаны и в других работах (Macías-Mayorga et al., 2015; Nardi et al., 2018). Авторы связывают это с формированием адаптаций со стороны АГС моллюсков в условиях ОС или в начале его развития.

Межвидовое сравнение выявило существенно более низкое, чем у анадары, но близкое к мидии, содержание GSH в жабрах сердцевидки. Эти различия могут быть связаны с наличием у анадары гемоглобина, в защите которого важна роль глутатиона (Golovina et al., 2016). Отличия в уровне GSH в жабрах у сердцевидки и мидии, с одной стороны, и анадары – с другой, дополнительно подтверждают выводы о большой роли глутатиона в АО защите гемоглобинсодержащего моллюска, сделанные ранее как нами (Gostyukhina, 2013; Gostyukhina, Andreenko, 2019; Gostiukhina, Golovina, 2013), так и другими авторами. Так, в жабрах анадары Броутона уровень GSH был выше, чем у моллюсков, не имеющих гемоглобина, – мидии, устрицы, гребешка (Истомина и др., 2011).

С одной стороны, в жабрах сердцевидки состояние АГС более напряженное по сравнению с мидией и анадарой, т.к. на фоне активных ГР и ГП ресурс GSH – самый низкий. Вместе с тем, подобное состояние АГС жабр сердцевидки может указывать и на высокую устойчивость этого моллюска к ОС, так как уровень продуктов ПОЛ одинаков во всех исследованных тканях и существенно ниже, чем у анадары и мидии. Этот вывод согласуется с результатами, показавшими, что жабры двустворок осуществляют важную барьерную функцию между организмом и внешней средой, и в их защите от ОС ведущую роль играет глутатион и АГС в целом (Trevisan et al., 2016).

В гепатопанкреасе сердцевидки наблюдаем сравнительно высокое содержание GSH и активность ГР, а также максимально активную из всех тканей моллюска ГП. Такое соотношение показателей АГС свидетельствует об активном участии GSH в работе ГП, а также об активном ресинтезе этого метаболита, что способствует поддержанию его ресурса на относительно высоком уровне. Подобный АО профиль в гепатопанкреасе моллюсков отмечают и в ряде исследований (Gostyukhina, Andreenko, 2019; Livingstone, 2001; Regoli, Principato, 1995). Такое состояние АГС типично для гепатопанкреаса – основного органа метаболизма, где высок уровень генерации АФК из-за накопления ксенобиотиков и при их детоксикации в процессе работы ферментов биотрансформации, а также в связи с высоким уровнем обмена веществ в целом. Следовательно, функции гепатопанкреаса предполагают конститутивно повышенный уровень ПОЛ (Livingstone, 2001; Regoli, Principato, 1995), что, очевидно, способствует и активной работе АГС.

Сравнение соотношения компонентов АГС в гепатопанкреасе трех видов обнаружило сходную картину. У сердцевидки и мидии высокий ресурс GSH отмечен на фоне высокой или средней активности ГП и ГР, а у анадары все три показателя в гепатопанкреасе имели средние величины по сравнению с другими тканями. Это отражает достаточно сбалансированное соотношение между скоростью окисления и восстановления глутатиона.

Сопоставление соотношения показателей АГС в тканях ноги у трех видов моллюсков выявило его сходный характер у сердцевидки и мидии, что выражалось в высоком содержании GSH при низкой активности обоих ферментов – ГП и ГР (по сравнению с остальными тканями у каждого из видов). Это указывает на невысокую интенсивность инактивации АФК с помощью ГП и означает, что глутатион не столь активно окисляется и, как следствие, нет необходимости в его интенсивном ресинтезе. Такой АО профиль согласуется с особенностями структуры и функции мышечной ткани: более низкой интенсивностью метаболизма, и в том числе окислительных процессов, чем в жабрах и гепатопанкреасе. Нога анадары, напротив, выделялась наибольшим уровнем GSH при высоко активной ГП, но низкой активности ГР. Как отмечено, это может быть обусловлено наличием у анадары гемоглобина, в АО защите которого участвует глутатион (Borzykh, Zvereva, 2015; Golovina et al., 2016). Поддержанию высокого ресурса GSH может способствовать и большое содержание в тканях ноги анадары каротиноидов, инактивирующих ряд АФК наряду с АО системой (Gostyukhina et al., 2013).

Известно, что между интенсивностью ПОЛ и АО активностью в клетке существует динамическое равновесие, что определяется особенностями экологии, физиологии и биохимии вида (Истомина и др., 2011; Климова, Чуйко, 2015; Edge et al., 2012; Lushchak, 2011). Один из критериев такого равновесия – соотношение уровня GSH и ПОЛ (содержание МДА), отражающее интенсивность АО процессов и ПОЛ (Edge et al., 2012). Полученные нами коэффициенты GSH/MДA свидетельствуют о более высоком АО потенциале во всех исследованных тканях сердцевидки по сравнению с мидией и анадарой и сдвиге баланса между ПОЛ и АО системой в сторону АО защиты. Исключение составила нога анадары, отличавшаяся чрезвычайно высоким ресурсом глутатиона и, как следствие, самым высоким значением коэффициента.

Выводы. Показатели антиоксидантной глутатионовой системы у сердцевидки имеют выраженную тканевую специфику. В гепатопанкреасе моллюска сравнительно высокие содержание глутатиона и активность ГР сочетаются с наибольшей из исследованных тканей активностью ГП. В жабрах сердцевидки при минимальном содержании глутатиона наблюдалась максимальная активность ГР и сравнительно высокая активность ГП. В ноге моллюска, напротив, высокий ресурс глутатиона выявлен на фоне относительно низкой активности ферментов ГП и ГР. Межвидовое сравнение показало, что во всех исследованных тканях сердцевидки уровень ПОЛ существенно ниже, чем у мидии и анадары. Состояние АГС в тканях Cerastoderma glaucum в целом отражает преобладание АО активности над интенсивностью ПОЛ по сравнению с таковыми у мидии и анадары. Это указывает на высокую адаптированность сердцевидки к окислительному стрессу при обитании в донных биотопах.