Цитология, 2020, T. 62, № 9, стр. 611-622

ИСТОРИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ Ca²⁺-СИГНАЛИЗАЦИИ

Важность ионов Ca²⁺ в проведении сигнала от поверхностных рецепторов внутрь клетки впервые была обнаружена Сиднеем Рингером с коллегами (Ringer, Buxton, 1887). В их работе довольно систематически была изучена роль Ca²⁺ в функционировании тканей и органов живых организмов. Проведенные исследования показали, что Ca²⁺ имеет решающее значение для сокращения сердца (Ringer, 1883) и скелетной мышцы лягушки (Ringer, Buxton, 1887), для оплодотворения яиц и развития головастиков (Ringer, Sainsbury, 1894). Много позднее появилась серия открытий, подтвердивших необходимость свободного Ca²⁺ для сокращения скелетных мышц (Ebashi, Ebashi, 1964). Было обнаружено, что вызванное Ca²⁺ сокращение клеток связано с сократительным белком тропонином С. Кроме того, было показано, что свободный Ca²⁺ может быть быстро секвестирован саркоплазматическим ретикулумом (СР). Эти исследования привели к пониманию того, что величина Ca²⁺-сигнала внутри клеток может меняться. Значение [Ca²⁺]i может увеличиваться, приводя к активации конкретного эффектора, а затем уменьшаться, давая возможность системе реагировать на следующий стимул.

Позднее, когда появился метода патч-кламп и чувствительные к ионам Ca²⁺ флуоресцентные индикаторы, произошел настоящий прорыв в области исследования Ca²⁺-сигнализации. Так, техника патч-клампа, изобретенная Нейером и Сакманом (Neher, Sakmann, 1976; Neher et al., 1978), увенчала почти 20-летний поиск методов детектирования ионных токов, протекающих по одиночным каналам. За короткое время метод распространился по всему миру и стал основным инструментом современной клеточной физиологии.

Примерно в то же время, когда появился метод патч-кламп, физиологические исследования были существенно усилены появлением флуоресцентных индикаторов ионов Ca²⁺. Открытие Ca²⁺-чувствительного люминесцентного белка экворина (aequorin) (Shimomura et al., 1962) сыграло важную роль в первых реальных записях цитозольного Ca²⁺, выполненных на гигантских мышечных волокнах усоногих раков Balanus nubilus (Ridgway, Ashley, 1967). Однако высокая травматичность клеток, связанная с условиями введения белкового зонда, и низкая интенсивность флуоресценции не позволили методу получить широкое распространение.

Эти проблемы были решены, когда был разработан первый флуоресцентный Ca²⁺-зонд квин-2 (quin-2). Особенно важно, что этот новый зонд имел проницаемую для мембраны, ацетометилэфирную форму (Tsien, 1981). С этого времени появилась возможность легко загружать в клетку флуоресцентный краситель и избегать разрушения водорастворимого флуоресцентного компонента. Однако реальный прорыв пришелся на второе поколение флуоресцентных Ca²⁺-индикаторов, таких как Fura-2 и Indo-1, которые имели гораздо лучшие характеристики, чем quin-2 и могли использоваться в более низких концентрациях (Grynkiewicz et al., 1985; Tsien, 1988).

И, наконец, в последние годы появился концептуально новый класс клеточных индикаторов Ca²⁺, основанных на вариантах флуоресцентных белков с различными спектральными свойствами (Zhang et al., 2002). Эти зонды появились в результате принципиально нового подхода к изучению проблемы, суть которого состоит в том, что зонды могут быть экспрессированы в живых клетках, как in vitro, так и in vivo, и их экспрессия может контролироваться индуцируемыми промоторами. Эти новые флуоресцентные индикаторы могут быть также использованы для измерения Са²⁺ во внутриклеточных органеллах (Pozzan et al., 2003; Tsien, 2003).

В целом, появление метода патч-клампа и универсальных внутриклеточных индикаторов Ca²⁺ позволили проводить измерения [Ca²⁺]i и трансмембранных потоков Ca²⁺ с большой точностью и высоким разрешением. Эти методы привели к новому пониманию сложных механизмов Ca²⁺-сигнализации в клетках живых организмов.

ЛОКАЛЬНЫЕ КАЛЬЦИЕВЫЕ СИГНАЛЫ

Известно, что свободный Ca²⁺ воспринимается клеткой, как сигнал, когда его концентрация в цитозоле (обычно очень низкая в покое – около 100 нМ) повышается. Как правило, стимуляция клеток приводит к резкому росту [Ca²⁺]i вокруг мест расположения активированных Ca²⁺-каналов. Области высокой концентрации Ca²⁺ вокруг таких каналов имеют различные сигнальные функции (Barak, Parekh, 2019). Их часто называют “сигнальные Ca²⁺-микродомены”, иногда в литературе используют термины “горячие Ca²⁺-точки”, “локальные Ca²⁺-сигналы” или “Ca²⁺-вспышки”. Высокая способность цитоплазмы связывать ионы Ca²⁺ и очень низкая скорость диффузии Ca²⁺ (10–50 мкМ²/с) в пределах клетки (Allbritton, 1992), с одной стороны, и способность субклеточных структур поглощать и высвобождать Ca²⁺, с другой стороны, а также кластеризация Ca²⁺-каналов в дискретных мембранных доменах, по-видимому, обеспечивают условия для генерации локальных Са²⁺-сигналов.

Локальные Са²⁺-сигналы, как установлено, возникают при открывании пространственно-ограниченной группы Са²⁺-каналов (Parker, Ivorra, 1990). Низко аффинный мутант экворина помог установить, что в синапсе гигантских аксонов кальмара во время разряда потенциала действия [Ca²⁺]i на пике в горячих точках достигает значений порядка 200–300 мкМ (Llinas et al., 1992). Кроме того, было установлено, что значения [Ca²⁺]i вблизи каналов в синаптических терминалах биполярных клеток сетчатки достигают 100–200 мкМ (Heidelberger et al., 1994). Генерирование локальных горячих точек в устье Ca²⁺-каналов критически контролирует ряд различных клеточных функций, среди них наиболее исследованной является секреция нейромедиаторов в синаптическую щель (Felmy et al., 2003).

Однако экзоцитоз не единственное физиологическое событие, которое зависит от амплитуды горячих Са²⁺-точек, возникающих вблизи Са²⁺-каналов. Модуляция самих Са²⁺-каналов также зависит от амплитуды локального Ca²⁺-сигнала в устье самого канала (Findlay, 2004). Кроме того, локальные Ca²⁺-сигналы могут активировать Ca²⁺-чувствительные K⁺-каналы плазматической мембраны в клетках гладких мышц, приводя к их гиперполяризации и расслаблению – эффекту, противоположному тому, который вызывается глобальным повышением [Ca²⁺]i и выражается в сокращении миофиламентов (Petkov et al., 2001).

По мере увеличения расстояния от активного канала [Ca²⁺]i резко падает из-за рассеяния в результате диффузии и связывания со специфическими белками (Thul, Falcke, 2004). Поэтому некоторые Ca²⁺-чувствительные эффекторы локализуются очень близко к Ca²⁺-каналам, обеспечивая возможность для реализации быстрых и специфических клеточных ответов. Другие эффекторы, в зависимости от их чувствительности к Ca²⁺, могут располагаться дальше (Berridge, 2006). Специфическая архитектура клетки обеспечивает условия для того, чтобы необходимый Ca²⁺-сигнал попадал в определенное время в нужное место. Однако для индукции физиологического ответа клетке требуется слияние элементарных Са²⁺-событий в глобальный Са²⁺-сигнал.

ГЛОБАЛЬНЫЕ КАЛЬЦИЕВЫЕ СИГНАЛЫ

Устойчивое увеличение [Ca²⁺]i является энергетически невыгодным для клетки, поскольку для этого необходим постоянный энергозависимый транспорт Ca²⁺. Кроме того, продолжительное повышение Ca²⁺ может привести к негативным для клетки эффектам. Поэтому клетки часто используют энергетически более выгодные колебательные (осциллирующие) Ca²⁺-сигналы, с широким частотным спектром для передачи информации. Считается, что в системах, использующих сигнализацию с частотным кодированием точность воспроизведения выше, чем там, где сигнал передается в виде градиентных изменений амплитуды (Berridge, 1997). Кроме того, клетки имеют механизмы для декодирования и реагирования на кратковременное увеличение Ca²⁺, предпочитая их устойчивым Ca²⁺-сигналам (Hajnóczky et al., 1995).

Характер Ca²⁺-колебаний может варьировать между клетками различных типов или даже между клетками в пределах одного типа в зависимости от стимула. Но в большинстве случаев Ca²⁺-колебания представляют собой кратковременное увеличение [Ca²⁺]i, которое длится несколько секунд, достигая максимальных значений, а затем возвращается к исходной [Ca²⁺]i в покое.

Алгоритм клеточного генерирования колебаний Ca²⁺ до сих пор не вполне ясен. Особенно это касается ситуаций, когда интервалы времени между последовательными увеличениями [Ca²⁺]i составляют несколько десятков секунд или даже минут (Skupin et al., 2008). В стимулированных гормонами клетках Ca²⁺-осцилляции чаще всего связывают с работой кластеров рецепторов инозитол 1,4,5-трифосфата (InsP₃R), активация которых критически зависит от уровня [Ca²⁺]i (Prole, Taylor, 2019). Фактически, инициирование и распространение глобального Са²⁺-сигнала зависит от совокупного накопления Са²⁺-сигналов, поскольку рост [Ca²⁺]i в клетке сенсибилизирует соседние рецепторы, увеличивая тем самым вероятность возникновения Са²⁺-сигналов и их последующее слияние в распространяющиеся Са²⁺-волны (Marchant et al., 1999).

Ранее было продемонстрировано, что частота колебаний [Ca²⁺]i в клетке (Rooney et al., 1989) и последующие клеточные ответы (Dolmetsch et al., 1998) пропорциональны концентрации применяемого стимула. Соответственно, передача Ca²⁺-сигналов может рассматриваться как информация, представленная в частотно-кодированном виде, когда последовательные импульсы цитозольного Ca²⁺ вызывают кумулятивный клеточный ответ (Roy, Cyert, 2019).

В основе огромной изменчивости характеристик Са²⁺-сигналов, необходимых для обеспечения конкретных функций в клетках разных типов лежит большое разнообразие белков, транспортирующих Са²⁺. Ни один из двух разных типов клеток не экспрессирует одинаковый набор проводников Са²⁺, в результате чего клетки разных типов имеют уникальную Са²⁺-сигнализацию, соответствующую их физиологии (Berridge et al., 2003). Например, сердечным миоцитам человека необходим быстрый подъем [Ca²⁺]i в клетке, чтобы каждую секунду поддерживать сердечно-мышечное сокращение (Bers, 2002). Эти быстрые Са²⁺-сигналы возникают в результате входа Са²⁺ через потенциал-управляемые Са²⁺-каналы плазматической мембраны и выхода Са²⁺ из СР через рианодиновые рецепторы (Fearnley et al., 2011). Напротив, в электрически невозбудимых клетках возникают достаточно медленные Са²⁺-колебания, которые зависят от выброса Са²⁺ из эндоплазматического ретикулума (ЭР) в результате активации In-sP₃R и входа Са²⁺ через каналы TRP или CRAC, расположенные в плазматической мембране клеток. Такие медленные осцилляции Са²⁺ необходимы для контроля экспрессии генов или обеспечения клеточного метаболизма (Dupont et al., 2011).

Даже незначительных изменений в передаче Ca²⁺-сигналов достаточно, чтобы вызвать драматические или патологические эффекты в клетке. Так, при чрезмерном усилении Ca²⁺-сигнализации в миоцитах нарушается транскрипция генов, приводящая к патологической гипертрофии сердца (Higazi et al., 2009). Превышение физиологических потребностей в Ca²⁺ также становится патологическим фактором для нейронов при развитии эксайтотоксичности мозга в результате гиперактивации NMDA-рецепторов (Arundine, Tymianski, 2003). Кроме того, Ca²⁺ также может играть ключевую роль в развитии рака, хотя его реальная роль пока недостаточна изучена. Существует точка зрения, что больные клетки могут ремоделировать Ca²⁺-сигналы для достижения неконтролируемого клеточного роста. Это может быть достигнуто, например, с помощью активации Ca²⁺-входа, стимулирующего транскрипцию генов, связанных с клеточным циклом (Lipskaia et al., 2009). Или, напротив, клетки могут уменьшать Ca²⁺-сигналы, предотвращая Ca²⁺-зависимый апоптоз (Bergner, Huber, 2008).

КАЛЬЦИЕВЫЕ ТРАНСПОРТЕРЫ

Известно, что на плазматической мембране всех клеток эукариот существует крутой (10⁴) градиент концентрации Ca²⁺. Как сообщалось выше, значения [Ca²⁺]i поддерживается примерно на уровне 100 нМ, в то время, как концентрация Ca²⁺ во внеклеточной среде обычно больше 1 мМ. Такой градиент поддерживается согласованным действием транспортных Ca²⁺-АТФаз плазматической мембраны (PMCA), Ca²⁺-АТФаз внутриклеточных мембран (SERCA), ионных Na⁺/Ca²⁺-обменников (Na⁺/Ca²⁺ exchanger, NCX ) и K⁺-зависимых Na⁺/Ca²⁺-обменников (K⁺-dependent Na⁺/Ca²⁺-exchangers, NCKX).

PMCA млекопитающих, которые присутствуют практически во всех клетках, кодируются 4 генами. Еще существует примерно 30 сплайс-вариантов РНК первичных транскриптов гена (Strehler, Treiman, 2004). NCX, которые преимущественно экспрессируются в возбудимых тканях, кодируются тремя разными генами. Для них также известны несколько сплайс-вариантов (Philipson et al., 2002). Энергия для переноса Ca²⁺ против его электрохимического градиента имеет различное происхождение. В случае PMCA – это гидролиз АТФ, причем на один откаченный ион Ca²⁺ приходится одна потребленная молекула ATP. В случае NCX – это электрохимический градиент ионов Na⁺ с выкачиванием одного иона Ca²⁺ за счет трех ионов Na⁺ (и четырех Na⁺ в случае NCKX) (Philipson et al., 2002; Strehler, Treiman, 2004).

Семейство АТФаз SERCA включает продукты трех генов: SERCA1 (ATP2A1), SERCA2 (ATP2A2) и SERCA3 (ATP2A3). Каждый из них подвергается альтернативному сплайсингу, что приводит к появлению новых мРНК и белковых изоформ (Gélébart et al., 2003). В мышечных клетках SERCA (в отличие от PMCA) гидролизует одну молекулу АТФ, чтобы транспортировать два иона Ca²⁺ против градиента их электрохимического потенциала из цитоплазмы в просвет (эндо)саркоплазматического ретикулума (ЭР/СР) (Inesi, Tadini-Buoninsegni, 2014). SERCA и равновесная утечка Ca²⁺ регулируют уровень Ca²⁺ во внутриклеточных Ca²⁺-депо (ЭР/СР), митохондриях, везикулярных органеллах, аппарате Гольджи, эндосомах (лизосомах) и секреторных везикулах.

КАЛЬЦИЕВЫЕ КАНАЛЫ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН

Активный перенос ионов Ca²⁺ с помощью SE-RCA способствует накоплению Ca²⁺ в люмене ЭР/СР и внутриклеточных органелл, а Ca²⁺-каналы внутриклеточных хранилищ возвращают Ca²⁺ обратно в цитоплазму. К каналам, освобождающим Ca²⁺ из ЭР/СР и внутриклеточных везикул, относятся следующие белки: инозитол 1,4,5-трифосфатные рецепторы (InsP₃R), рианодиновые рецепторы (RyR), рецепторы NAADP и некоторые члены суперсемейства TRP (рис. 1).

Рис. 1.

Механизмы формирования Са²⁺-сигнала в живых клетках. Внешние стимулы активируют вход Са²⁺ через потенциал-активируемые Са²⁺-каналы VOC (voltage-operated Ca²⁺ channels), рецептор-активируемые каналы ROC (receptor-operated Ca²⁺ channels), каналы переходного рецепторного потенциала TRP (transient receptor potential) и каналы, активируемые опустошением Са²⁺-депо CRAC (Ca²⁺-release activated Ca²⁺ channels,). Связывание гормонов с G-белок-сопряженными рецепторами (GPCR) приводит к генерации инозитол-1,4,5-трифосфата (InsP₃), который, связываясь с рецептором InsP₃R, высвобождает Са²⁺ из Са²⁺-депо эндоплазматической сети (ЭР). Опустошение Са²⁺-депо активирует каналы CRAC (Orai1 и STIM) и запускает вход Са²⁺ в клетку. Вход Са²⁺ через каналы VOC стимулирует выброс Са²⁺ через рианодиновые рецепторы (RyR) саркоплазматического ретикулума (СР). Кроме того, Са²⁺ выходит из ЭР через двухпоровые каналы (ТРС) и через некоторые каналы суперсемейства TRP (TRPML, TRPP, TRPM). Действуя на различные эффекторы (тропонин, кальциневрин, кальмодулин и др.) Са²⁺ осуществляет регуляцию многочисленных клеточных функций. Уровень внутриклеточного Са²⁺ поддерживается согласованной работой Са²⁺-АТФаз (РМСА и SERCA) и Na⁺/Ca²⁺-обменников (по: Bootman, 2012 c изменениями).

Рецептор InsP₃R. При стимуляции поверхностных рецепторов клетки и активации фосфолипазы C (PLCβ или PLCγ) происходит гидролиз фосфатидилинозитол-4,5-дифосфата (PIP₂) на два вторичных медиатора: 1,4,5-инозитолтрифосфат (InsP₃) и диацилглицерин (DAG). На мембране эндоплазматического ретикулума InsP₃ связывается с достаточно массивным рецепторным комплексом InsP₃R (мол. масса ~1200 кДа), который состоит из четырех субъединиц. Как только медиатор InsP₃ занимает все четыре мономера, происходит конформационное изменение InsP₃R, которое сенсибилизирует сайт связывания с Ca²⁺. При связывании Ca²⁺ с этим сайтом канал открывается и Ca²⁺ высвобождается в цитоплазму. Активация InsP₃R имеет колоколообразную зависимость от [Ca²⁺]i. Относительно низкие значения [Ca²⁺]i (250–500 нМ) способствуют высвобождению ионов Ca²⁺, тогда как более высокие значения [Ca²⁺]i (~1 мкМ) ингибируют высвобождение ионов Ca²⁺ (Prole, Taylor, 2019). Двойное регулирование In-sP₃R с помощью InsP₃ и ионов Ca²⁺ необходимо для многочисленных функций клеточной сигнализации. Например, зависимость активности InsP₃R от [Ca²⁺]i имеет решающее значение для генерации сложных осциллирующих Ca²⁺-сигналов, наблюдаемых во многих клетках.

Несмотря на то, что для активации InsP₃R требуется связывание с InsP₃, на самом деле они открываются и закрываются при связывании Са²⁺ с дискретными сайтами активации и ингибирования рецептора. При низкой клеточной стимуляции и, следовательно, низких уровнях InsP₃ возникают локальные Ca²⁺-сигналы. Однако при более значительной стимуляции клетки ионы Ca²⁺ могут диффундировать к соседнему, оккупированному InsP₃, кластеру InsP₃R и запускать следующий Ca²⁺-сигнал, захватывая новые кластеры InsP₃R и распространяя далее Ca²⁺-волны. Кальциевые волны, отражающие эту схему распространения Ca²⁺-сигналов (Thul et al., 2008), были визуализированы в цитозоле ряда клеток, включая невозбудимые клетки (Bootman et al., 1997; Callamaras et al., 1998), миоциты сердца (Kockskämper et al., 2001), а также нанотоннели, соединяющие цитоплазму соседних клеток (Smith et al., 2011). Кроме того, Ca²⁺-волны могут проникать в нуклеоплазму путем диффузии через ядерные поры (Bootman et al., 2009) и модулировать в ядре транскрипцию генов (Hagenston et al., 2019).

Рецепторы RyRs. RyR представляет собой массивный, проницаемый для Ca²⁺ тетрамерный канал, который расположен в мембране ЭР или СР. Белки RyR кодируются тремя независимыми генами и экспрессируются в трех различных изоформах (Sorrentino, 1995). Первичным природным агонистом RyR является ион Ca²⁺. А свое название RyR получили из-за высокой аффинности к растительному алкалоиду рианодину. Низкий уровень Ca²⁺ в цитоплазме открывает канал, позволяя Ca²⁺ вытекать из ЭР/СР. Более высокий Ca²⁺ вблизи устья канала инактивирует каналы, предотвращая перегрузку клеток свободным Ca²⁺. При низких концентрациях рианодина (100 нМ) связывание с рецептором запирает канал RyR в долгоживущем субпроводящем состоянии, тогда как более высокие концентрации (>10 мкМ) препятствуют открыванию канала. RyR также активируются миллимолярными концентрациями кофеина. Механизм этой модуляции заключается в повышении чувствительности рецепторов к Ca²⁺ в присутствии кофеина таким образом, что даже базальные концентрации Ca²⁺ становятся активирующими.

Структурно и функционально RyR похожи на In-sP₃R, хотя имеют примерно в два раза большие мол. массу и проводимость, чем InsP₃R. RyR обнаруживаются, главным образом, в возбудимых типах клеток, таких как мышцы и нейроны. В клетках сердечной мышцы потенциал действия вызывает кратковременную деполяризацию сарколеммы, что приводит к активации потенциал-управляемых Ca²⁺-каналов L-типа и входу Ca²⁺ в клетку извне в специфическую мембранно-ограниченную область – диадическую щель (dyadic cleft) (Eisner et al., 2017). В этой области сарколемма Т-трубочек и мембрана СР находятся в пределах 10–15 нм друг от друга, что способствует быстрой диффузии монов Ca²⁺ через каналы L-типа к RyR (Fearnley et al., 2011). Активация RyRs приводит к запуску Ca²⁺-индуцированного высвобождения Ca²⁺ и быстрому росту [Ca²⁺]i в диадической щели. Далее Ca²⁺-сигнал диффундирует в цитоплазму, где взаимодействует с тропонином C, участвующем в ассоциации актина с миозином и сердечно-мышечном сокращении. При некоторых сердечных заболеваниях сарколемма и мембраны СР разобщаются, теряется связь между потенциал-зависимыми Ca²⁺-каналами и RyRs, что приводит к серьезному нарушению сокращения миоцитов (Louch et al., 2004; Heinzel et al., 2011). Важнейшую функцию сопряжения потенциала действия с мышечным сокращением RyR выполняет также и в других типах мышечных клеток (Suntulli, Marks, 2015).

Рецепторы NAADP. Этот рецептор адениндинуклеотидфосфат никотиновой кислоты может мобилизовать Ca²⁺ из внутриклеточных хранилищ, активируя семейство белков, известных как двухпоровые каналы (two-pore channels, TPC) (Galione, 2019). TPC появились недавно как новый класс неселективных катионных каналов в (эндо)лизосомной системе. В геноме человека существует два гена, кодирующие каналы TPC1 и TPC2 (Grimm et al., 2017). Субъединицы TPC состоят из 12 трансмембранных доменов (TMD) с предполагаемыми петлями пор между доменами TMD5/6 и TMD11/12.

Двухпоровые каналы активируются NAADP в наномолярных концентрациях, тогда как NAADP в микромолярных концентрациях фактически ингибируют работу канала (Galione et al., 2009). Открытие TPC регулируется, по-видимому, как величиной люминального рН, так и величиной свободного Ca²⁺ в (эндо)лизосомах. Важным отличительным свойством NAADP-чувствительных Ca²⁺-хранилищ является их нечувствительность к ингибитору Ca²⁺-АТФазы тапсигаргину (Galione, 2019).

Показано, что TPC участвуют в регуляции нейронального возбуждения, сокращении гладкомышечных клеток, оплодотворении и высвобождении инсулина из бета-клеток поджелудочной железы. Недавнее исследование продемонстрировало, что активность TPC необходима для высвобождения вируса Эбола из эндосомы (лизосомы) в цитозоль клетки-хозяина. Было обнаружено, что нокдаун TPC1 или TPC2 предотвращал инфицирование Эболой in vitro, что делает TPC потенциальными мишенями для лечения этой инфекции (Sakurai et al., 2015).

Каналы TRP в мембранах внутриклеточных органелл. Изначально TRP считали каналами, обеспечивающими вход Ca²⁺ исключительно через плазматическую мембрану клеток. Позднее было обнаружено, что некоторые члены суперсемейства могут формировать каналы выхода Ca²⁺ из внутриклеточных хранилищ (см. обзоры: Gees et al., 2010; Семенова, 2017). Классическим представителем (эндо)лизосомных каналов является подсемейство муколипиновых рецепторов, в состав которого входят каналы TRPML1, TRPML2 и TRPML3. Название подсемейство получило от первого члена подсемейства муколипинового канала тип 1 (TRPML1), который был клонирован при поиске генетических детерминант заболевания муколипидоза IV типа.

Молекулярная структура каналов TRPML, как и всех TRP, имеет сходства с потенциал-управляемыми калиевыми каналами. Канал образуется в результате объединения четырех молекул TRP в гомо- или гетеротетрамеры. Пороформирующий участок находится между 5 и 6 трансмембранными доменами. Аминокислотные последовательности самой поры у членов подсемейства TRPML1–TRPML3 почти идентичны, поэтому разница биофизических характеристик и механизмов регуляции определяется структурными особенностями, находящимися вне поры канала.

Доказано, что каналы TRPML распределены, главным образом, по эндосомным путям, где они участвуют в сортировке различных липидов и белков. Несмотря на то, что каналы TRPML1 не обладают селективностью к ионам Са²⁺, считается, что основная их функция заключается в обеспечении выхода Са²⁺ из эндосом (лизосом) в цитоплазму клеток. Например, выходящий через каналы TRP-ML1 люминальный Сa²⁺ является основным ресурсом Сa²⁺, необходимого для формирования лизосом из (эндо)лизосомных гибридов (Luzio et al., 2007).

В настоящее время представлены доказательства того, что и другие каналы суперсемейства TRP также функционируют во внутриклеточных органеллах. Например, меластатиновые рецепторы TRPM2 идентифицированы в поздних эндоцитозных компартментах, как каналы, высвобождающие Ca²⁺ из эндосом в ответ на действие цитозольной ADP-рибозы (Lange et al., 2009). В терминалях симпатических нейронов в комплексе с транспортными белками, такими, как снапин, синаптотагмин и синапсин были обнаружены другие меластатиновые рецепторы-каналы TRPM7 (Krapivinsky et al., 2006). Проведенные исследования выявили корреляцию между экспрессией TRPM7 в нейронах и высвобождением нейромедиатора в синаптическую щель (Krapivinsky et al., 2006).

КАЛЬЦИЕВЫЕ КАНАЛЫ ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ

Фаза высвобождения ионов Са²⁺ из внутриклеточных депо довольно короткая и, как правило, полностью инактивируется в течение нескольких десятков секунд, что обусловлено кальций- и лиганд-зависимой инактивацией Са²⁺-каналов внутриклеточных мембран, а также работой SERCA, PMCA и Na/Са²⁺-обменника. Однако для многих ключевых клеточных процессов требуется устойчивое увеличение [Ca²⁺]i, что достигается путем входа ионов Са²⁺ в клетку через Са²⁺-каналы плазматической мембраны.

Создание удобной классификации каналов является пока ещe не решeнной проблемой. Мембранные белки трудно классифицировать по их структуре. Поэтому часто каналы подразделяют по типу их активации. Активация каналов может зависеть от изменения мембранного потенциала (в случае VOC – voltage-operated Ca²⁺ channels) (Catterall, 2000), от связывания с лигандом (в случае ROC – receptor-operated Ca²⁺ channels) (Meldolesi, Pozzan , 1987) и от опустошения внутриклеточных Ca²⁺-депо (в случае CRAC – Ca²⁺-release activated Ca²⁺ channels). Кроме того, группа каналов, относящаяся к суперсемейству TRP, может быть активирована множеством факторов, включая механическое растяжение, изменение осмолярности или температуры, вторичные мессенджеры, G-белки и т.д. (см. обзор: Montell et al., 2002).

Потенциал-управляемые Ca²⁺-каналы. Одними из наиболее исследованных являются каналы VOC, которые впервые были обнаружены в мембране клеток, обладающих электрической возбудимостью (сердечная мышца, гладкомышечные клетки, нейроны, эндокринные клетки). Каналы VOC условно делятся на три основных семейства: Ca_V1, Ca_V2 и Ca_V3. Каждое семейство включает несколько типов Са²⁺-каналов, отличающихся друг от друга уровнями активации и инактивации, временем нахождения в открытом состоянии, величиной проводимости и фармакологическими свойствами (Catterall et al., 2005). Если в клетке сохраняется потенциал покоя, то VOC находятся в неактивном состоянии, но при деполяризации мембраны каналы активируются, обеспечивая быстрый вход ионов Ca²⁺ в клетку.

В структуру VOC входит большая α₁-субъединица, формирующая собственно проводящую часть канала, а также вспомогательные субъединицы – α₂δ, β и иногда γ. Субъединицы α₂δ и β имеют регуляторные функции и могут влиять на свойства α₁-субъединицы. В настоящее время выделяют несколько типов кальциевых каналов (L, T, N, P, Q, R), обладающих разными свойствами и имеющих разную тканевую локализацию. Субъединица α₁ является ключевым определителем подтипа кальциевого канала (Weber et al., 2010).

Так, семейство каналов Ca_V1 (Ca_V1.2, Ca_V1.3, Ca_V1.4 и изоформа Ca_V1.1) включает в себя Ca²⁺-каналы L-типа (long-lаsting – долгоживущие) (Bech-Hansen et al., 1998). Семейство каналов Ca_V2, состоящее из трeх подсемейств (Ca_V2.1, Ca_V2.2 и Ca_V2.3) объединяет каналы P- Q- N- и R-типа (Richards et al., 2007). В семейство каналов Cav3 (Cav3.1, Cav3.2 и Cav3.3) входят кальциевые каналы T-типа (transient – кратковременные) (Cribbs et al., 1998).

Представительство тех или иных типов кальциевых каналов в различных клетках определяется, по всей видимости, соответствующими функциями. Так, Ca²⁺-каналы L-типа участвуют в электромеханическом сопряжении в скелетных, гладких и сердечных мышцах. Члены семейства Ca_V2 локализуются в зернистых нейронах мозжечка, пирамидных клетках гиппокампа, клетках эндокринной системы и пр. Основной их функцией является освобождение нейротрансмиттера (Hillman, 1991). Ca²⁺-каналы Т‑типа участвуют в генерации коротких пачек импульсов в клетках сердца, нейронах, и различных секреторных клетках (см. обзор: Мельников, 2007).

Депо-управляемые Са²⁺-каналы. Концепция депо-управляемых Са²⁺-каналов была предложена в 1986 году Патни с соавторами (Putney, 1986). Согласно этой концепции, вход Са²⁺ в невозбудимые клетки регулируется степенью опустошения внутриклеточных Са²⁺-депо. В клетках, в основном гемопоэтического ряда, был зарегистрирован исключительно селективный для Са²⁺ ток, характеризующийся входящим выпрямлением, который получил название I_CRAC (calcium release activated Са²⁺ current) (Hoth, Penner, 1992). Сейчас очевидно, что депо-управляемый вход в различных типах клеток реализуется при участии не только каналов CRAC, а также семейства Са²⁺-проницаемых каналов SOCЕ (store-operated calcium entry), с различными биофизическими и фармакологическими свойствами (Soboloff, Romanin, 2019).

Депо-управляемые Ca²⁺-каналы включают в себя комплекс белков Orai и STIM (stromal interaction molecule). Каналы Orai локализуются в плазматической мембране и представляют собой порообразующую структуру канала CRAC. Они формируются путем сборки из четырех субъединиц (Hogan et al., 2010). Селективный фильтр Orai состоит из четверки глутаматных остатков, которые образуют высоко аффинный сайт связывания с Ca²⁺, формируя каналы с высокой Ca²⁺-селективностью (Prakriya et al., 2006). Анализ выстилающих пору остатков в трансмембранных доменах указывает на то, что поры канала Orai очень узкие (Zhou et al., 2010), что потенциально объясняет его низкую проводимость и является лимитирующим фактором роста [Ca²⁺]i при открывании канала. Цитоплазматический С-конец Orai имеет специфический спиральный домен (CC), который содержит сайт связывания с белком STIM.

Белки STIM1 и STIM2 были идентифицированы как сенсоры концентрации Ca²⁺ в люмене хранилищ ЭР. Нокдаун, с помощью siRNA, более чем 2300 генов человека в клеточных линиях HeLa и Jurkat помог установить, что STIM1 и STIM2 участвуют в работе SOCE (Liou et al., 2005). N-конец белков STIM, содержащий Ca²⁺-связывающий домен EF-hand, располагается в просвете ЭР. Когда концентрация Ca²⁺ в люмене ЭР падает ниже порогового уровня, Ca²⁺ диссоциирует от STIM, что приводит к конформационным изменениям сенсора, в результате которого С-концевой домен STIM разворачивается и взаимодействует с каналом Orai в областях, где мембрана ЭР наиболее близко подходит к плазматической мембране (в пределах 15 нм) (Zhou et al., 2017). Далее происходит активация депо-управляемых Ca²⁺-каналов, которая сопровождается входом ионов Ca²⁺ в клетку (Kawasaki et al., 2009).

Каналы суперсемейства TRP. Каналы, относящиеся к этому суперсемейству, делятся на несколько подсемейств: канонические (TRPC), ванилоидные (TRPV), меластатиновые (TRPM), анкириновые (TRPA), полицистиновые (TRPP) и муколипиновые (TRPML) (см. обзор: Nilius, Owsianik, 2011). Все члены суперсемейства состоят из шести трансмембранных доменов (S1–S6) с обращенными в цитоплазму N- и C –концами и порообразующей петлей между доменами S5 и S6. Длина цитозольных концов, на которых находятся регуляторные сайты, сильно варьирует между членами суперсемейства TRP (см. обзор: Owsianik et al., 2006).

Накопленные данные указывают на то, что каналы TRP играют заметную роль в регуляции Са²⁺, как в возбудимых, так и невозбудимых клетках. Большинство каналов TRP пропускают ионы Ca²⁺ непосредственно через плазматическую мембрану, а другие члены суперсемейства создают движущую силу, облегчая вход ионов Ca²⁺ снаружи внутрь клетки через Са²⁺-проводящие каналы. Например, в эндотелиальных клетках (Bollimuntha et al., 2005), тромбоцитах (Adebiyi et al., 2011) и клетках гладких мышц (Lussier et al., 2008) вход Са²⁺ может обеспечиваться каналами TRPC1. Каналы TRPC1 тесно взаимодействуют с Са²⁺-каналом Orai1 и Са²⁺-сенсором STIM (Cheng et al., 2011). Истощение Са²⁺-депо и образование комплексов STIM1/Orai приводит к встраиванию TRPC в плазматическую мембрану и продлению активности каналов SOCЕ в клетках (Desai et al., 2015).

Каналы суперсемейства TRP демонстрируют разную степень проницаемости для Ca²⁺ – от умеренно проницаемых до полностью непроницаемых. Но два члена этого подсемейства (каналы TRPV5 и TRPV6) признаны самыми высокоселективными кальциевыми каналами (Р_Са/Р_Na > 100) среди всего суперсемейства TRP (Owsianik et al., 2006). Высокая Ca²⁺-селективность каналов, строгое входящее выпрямление и Ca²⁺/кальмодулин-зависимая инактивация (Owsianik et al., 2006; Derler et al., 2012) была причиной, по которой TRPV6 ранее относили к белкам, формирующим пору CRAC (Yue et al., 2001). Позднее проведенный анализ показал, что TRPV6 имеют более высокую проводимость, чем CRAC, они не активируются истощением Ca²⁺-депо и потенциал-зависимым образом блокируются ионами Mg²⁺, что не характерно для каналов CRAC (Voets et al., 2001). Последующее открытие белков Orai и STIM окончательно сформировало мнение, что именно они, а не каналы TRPV6/5 обеспечивают депо-управляемый вход Ca²⁺.

Каналы TRPV5 и TRPV6 имеют схожие функциональные характеристики, они конститутивно активны и обеспечивают вход Са²⁺ в клетку при потенциале покоя, не требуя активации внеклеточными лигандами. Каналы могут обеспечивать строго дозированное поступление Са²⁺ и участвовать в активной (ре)абсорбции ионов Са²⁺ в эпителиальных клетках почек, тонкого кишечника и плаценты (Nijenhuis et al., 2003). Показано, что TRPV6 является важным элементом в транспорте кальция между матерью и плодом, и его функционирование необходимо для поддержания нормального протекания беременности (Choi et al., 2009). Кроме того, каналы TRPV5 и TRPV6, по-видимому, участвуют в обеспечение Са²⁺-зависимых функций в лимфоцитах человека (Vassilieva et al., 2013).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Активация входа Ca²⁺ в клетку в результате открывания Ca²⁺-каналов приводит к локальному всплеску [Ca²⁺]i. Из этих локальных точек Ca²⁺-сигналы могут диффузно рассеиваться, быть секвестированы или могут объединяться в глобальные Ca²⁺ сигналы. По существу, глобальные Ca²⁺-сигналы возникают в результате скоординированного действия кластера Ca²⁺-каналов, обеспечивающих вход и (или) выброс Ca²⁺ из внутриклеточных хранилищ. Глобальные Ca²⁺-сигналы далее распространяются между скоплениями клеток для координации взаимодействия тканей и органов. Система Ca²⁺-сигналов организована таким образом, что позволяет клеткам использовать Ca²⁺ в качестве средства одновременного управления различными процессами. Особенно важно, что Ca²⁺-сигнализация тесно интегрируется с другими путями передачи внутриклеточного сигнала. Поэтому сигнализация в клетке может кардинально меняться в зависимости от изменений Ca²⁺-сигналов или Ca²⁺-гомеостаза.

Формирования Ca²⁺-сигналов обеспечивается слаженной работой внутренних систем регулирования Ca²⁺ с участием Ca²⁺-каналов, Ca²⁺-насосов и обменников. Эти системы тончайшим образом модулируют амплитуду и временно-пространственное распределение Ca²⁺-сигналов, которые в свою очередь влияют на множество Ca²⁺-чувствительных процессов внутри клетки. Нарушение этих механизмов и сбой в регуляции Ca²⁺-сигналов может приводит к их ремоделированию и вызывать патологические процессы, которые ведут к нарушениям функций и гибели клеток. Понимание того, как изменение Ca²⁺-сигнала влияет на развитие определенного заболевания и, напротив, как патологии ремоделируют Ca²⁺-сигнал, необходимо для совершенствования современных терапевтических стратегий.

Настоящий обзор включает лишь некоторые ключевые аспекты клеточной Ca²⁺-сигнализации. В него не вошли данные из литературы, касающиеся огромной роли митохондрий и кальций-связывающих белков в формировании и проведении Ca²⁺-сигнала. К сожалению, несмотря на то, что многие вопросы, связанные с Са²⁺-сигнализацией до сих пор не раскрыты, в последнее время наблюдалось неоправданное снижение интереса к этой области исследования. Стоит надеяться, что современные, стремительно развивающиеся технологии в области молекулярной биологии и флуоресцентной микроскопии дадут новый импульс изучению процессов, связанных с формированием Ca²⁺-сигнала и его влиянием на важнейшие функции клетки.