Цитология, 2020, T. 62, № 9, стр. 662-671

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Животные. В качестве объектов исследования были использованы самки мышей линии CBA массой 18–20 г, полученные из питомника Рапполово (Ленинградская обл.), в количестве 80 шт. Животных содержали в стандартных условиях по температуре и освещенности (12/12 ч) при неограниченном доступе к воде и пище.

Лектины. В работе исследовали 22 лектина растительного происхождения и 1 лектин животного происхождения (табл. 1). Все меченные флуоресцеинизотиоцианатом лектины были приобретены у НПК “Лектинотест” (Украина).

Реагенты. В работе использовали: потенциал-зависимый липофильный митохондриальный краситель метиловый эфир тетраметилродамина (TMRM) (Invitrogen, США) для выявления ранних стадий апоптоза; ДНК-связывающий краситель 7-аминоактиномицин D (7AAD) (BioLegend, США) для выявления поздних стадий апоптоза; забуференный физиологический раствор (ФР), представляющий собой 0.14 М раствор NaCl, 1 л которого содержал 0.2 г KCl, 1.44 г Na₂HPO₄, 0.24 г KH₂PO₄, pH 7.4, (Биолот, Санкт-Петербург) и к которому добавляли 2% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС; Биолот, Санкт-Петербург) для уменьшения неспецифических взаимодействий; суспензию гидрокортизона для инъекций, 25 мг/мл (Gedeon Richter, Венгрия).

Выделение тимоцитов. Животных умерщвляли путем цервикальной дислокации и сразу же извлекали тимус. Тимоциты получали с помощью гомогенизатора Поттера, клеточную суспензию каждого тимуса фильтровали через нейлоновый фильтр и дважды отмывали избытком ФР путем центрифугирования при 330 g в течение 8 мин при охлаждении до 15°С. Клеточный осадок ресуспендировали и переводили в 3 мл ФР, получая рабочую суспензию тимоцитов (Серебрякова и др., 2019а).

Индукция апоптоза тимоцитов мышей. У части животных индуцировали апоптоз тимоцитов путем внутрибрюшинного введения 2.5 мг гидрокортизона в объеме 0.5 мл ФР за 3 или 6 ч до эксперимента.

Оценка уровня апоптоза при помощи проточной цитометрии. Использовали методику, основанную на применении метилового эфира тетраметилродамина (TMRM). Этот краситель относится к категории так называемых митохондриальных зондов – веществ, спонтанно проникающих через плазматическую мембрану и специфически накапливающихся в митохондриях живых клеток. В таких клетках краситель обладает высоким уровнем флуоресценции. При запуске апоптоза мембранный потенциал митохондрий снижается, в результате чего зонд выходит в цитоплазму, что приводит к снижению флуоресценции. Таким образом, общий пул клеток может быть разделен на живые, обладающие яркой флуоресценцией (TMRM⁺), и клетки в апоптозе, начиная с его ранних стадий (TMRM^–) (Lee et al., 2001). Для разделения ранних и поздних стадий апоптоза производили окраску ДНК-связывающим красителем 7AAD, проникающим только в клетки с поврежденной мембраной (Lesley et al., 1988). Нарушение целостности плазмалеммы является одним из характерных признаков гибели клетки, в равной степени позднего апоптоза и некроза. Проникновение 7AAD в ядро и связывание с ДНК позволяет на основании параметров флуоресценции выделить фракцию клеток в позднем апоптозе из общего апоптозного пула, определяемого по TMRM-свечению.

Окрашивание проводили по методике, описанной ранее (Серебрякова и др., 2019а). Кратко: к 100 мкл рабочей суспензии тимоцитов добавляли раствор меченого лектина и красителя TMRM в конечной концентрации 5 и 0.075 мкг/мл соответственно. После внесения реагентов клетки инкубировали 20 мин в темноте при 37°С. Далее образцы отмывали избытком ФР, содержащего 2% ЭТС, путем центрифугирования (330 g, 8 мин, 15°С). Полученный осадок ресуспендировали в 100 мкл ФР. К суспензии добавляли 10 мкл красителя 7AAD, создавая конечную концентрацию 1 мкг/мл, и инкубировали пробы в темноте еще 5 мин. Затем образцы разводили ФР до объема 250 мкл и анализировали на проточном цитометре Navios™ (Beckman Coulter, США). Для каждого образца собирали не менее 30 000 одиночных клеток. Клеточные агрегаты исключали путем учета данных по времени нахождения частицы в точке детекции на осях прямого или бокового светорассеяния.

По результатам цитометрического анализа путем логического гейтирования выделяли три популяции тимоцитов: живые (TMRM⁺7AAD^–), клетки на стадии раннего апоптоза (TMRM^–7AAD^–) и клетки на стадии позднего апоптоза (TMRM^–7AAD⁺) (рис. 1). У этих популяций оценивали (и выражали в %) уровень позитивных по каждому лектину клеток у интактных (контрольных) животных (столбцы А на рис. 2–6), а также у животных через 3 и 6 ч после введения гидрокортизона (соответственно столбцы В и С на рис. 2–6). Негативным контролем по каждому животному считали клетки, прошедшие все этапы пробоподготовки, но без внесения растворов лектинов.

Рис. 1.

Гейтирование тимоцитов при окрашивании красителями TMRM и 7AAD. Проточная цитометрия. По горизонтали – уровень флуоресценции при окрашивании TM-RM, усл. ед.; по вертикали – уровень флуоресценции при окрашивании 7AAD, усл. ед. Квадранты: 1 – живые клетки (TMRM⁺7AAD^–); 2 – ранний апоптоз (TMRM^–7AAD^–); 3 – поздний апоптоз (TMRM^–7AAD⁺).

Рис. 2.

Связывание Man-специфичных лектинов с тимоцитами. Лектины: 1 – подснежника (GNA), 2 – амариллиса (HHA), 3 – нарцисса (NPA), 4 – купены (PMRA), 5 – белоцветника (LVA), 6 – крокуса (CVA), 7 – банана (MBA). На рис. 2–6: по горизонтали – живые клетки (A), клетки в раннем апоптозе через 3 ч после введения гидрокортизона (B) и клетки в позднем апоптозе через 6 ч после введения гидрокортизона (C); по вертикали – доля меченных лектином клеток, %; n ≥ 4 для каждой точки; *различия с живыми клетками достоверны при P < 0.05.

Рис. 3.

Связывание Man/Glc-специфичных лектинов с тимоцитами. Лектины: 1 – Конканавалин А (ConA), 2 – гороха (PSA), 3 – чечевицы (LCA).

Рис. 4.

Связывание GlcNAc-специфичных лектинов с тимоцитами. Лектины: 1 – семян фасоли (PHA), 2 – картофеля (STA), 3 – крапивы (UDA), 4 – зародышей пшеницы (WGA).

Рис. 5.

Связывание GalNAc-специфичных лектинов с тимоцитами. Лектины: 1 – виноградной улитки (НРА), 2 – желтой акации (САВА), 3 – лимской фасоли (LBA), 4 – клещевины (RCA).

Рис. 6.

Связывание лектинов других специфичностей с тимоцитами. Лектины: 1 – арахиса (PNA), 2 – омелы белой (VAA); 3 – бузины черной (SNA), 4 – бузины красной (SRA); 5 – бобовника анагиролистного (LABA).

Статистический метод. Вычисляли среднее арифметическое и ошибку среднего. Сравнение выборок производили с помощью t-критерия Стьюдента. Обработку данных вели при помощи пакета программ и приложений Microsoft Office Excel (Microsoft, США). Во всех экспериментах различия между контролем и экспериментом считали статистически достоверными при P < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Полученные данные свидетельствуют, что связывание лектинов различной лигандной специфичности с тимоцитами зависит от их жизнеспособности и стадии апоптоза, что может быть использовано для оценки изменений состава полисахаридов гликокаликса тимоцитов в ходе апоптотического процесса (рис. 2–6).

Man-специфичные лектины. В работе использовали 7 растительных Man-специфичных лектинов: подснежника, амариллиса, белоцветника весеннего, нарцисса, купены многоцветной, крокуса и банана (рис. 2). Лектины подснежника и амариллиса, специфичные к α(1-3)Man в терминальном положении и имеющие сходную структуру, показывают одинаковое, почти 100%-ное связывание со всеми тимоцитами, вне зависимости от популяции и жизнеспособности клеток (рис. 2, столбцы 1 и 2). Способность к связыванию с тимоцитами остальных лектинов этой группы, напротив, зависит от жизнеспособности клеток. Если в популяции живых клеток всего около 1% тимоцитов окрашивается Man-специфичными лектинами, то при развитии раннего апоптоза их доля возрастает до 2–4%, а при позднем апоптозе – до 15–23% клеток способны к взаимодействию с лектинами этой специфичности. Примером такой динамики связывания являются лектины нарцисса и купены (рис. 2, столбцы 3 и 4 соответственно).

Man/Glc-специфичные лектины. На рис. 3 приведены результаты оценки связывания с тимоцитами тетрамерных лектинов бобовых, специфичных к маннозе и глюкозе: конканавалина А, лектинов гороха и чечевицы. Для этих лектинов характерен низкий уровень связывания с живыми клетками и его повышение по мере развития апоптоза. При этом, если в случае конканавалина А и лектина гороха происходит дальнейшее усиление связывания с тимоцитами при переходе клеток из раннего в поздний апоптоз (от 6 до 34% позитивных по лектину клеток в случае конканавалина А (рис. 3, столбец 1) и от 7 до 21% в случае лектина гороха (рис. 3, столбец 2)), то для лектина чечевицы сразу после появления у клетки ранних признаков апоптоза связывание повышается (от 1% для живых клеток до 8% в раннем апоптозе (рис. 3, столбец 3)) и в дальнейшем меняется незначительно при вхождении тимоцитов в поздний апоптоз.

Специфичные к N-ацетил-D-глюкозамину лектины. Также рост доли меченых клеток наблюдается и при связывании лектинов этой группы с тимоцитами в позднем апоптозе. Если в случае лектина картофеля этот прирост по сравнению с живыми клетками оказывается как минимум 13-кратным (рис. 4, столбец 2), то для фитогемагглютинина – одного из классических митогенов лимфоидных клеток млекопитающих – он уже 25-кратный (рис. 4, столбец 1). Два других лектина этой группы – крапивы и зародышей пшеницы – показывают сходную 9-кратную амплитуду прироста доли меченых тимоцитов в позднем апоптозе (рис. 4, столбцы 3 и 4 соответственно). Стоит отметить, что в случае лектина зародышей пшеницы достоверный прирост числа связавшихся с ним тимоцитов (до 70%) достигается только в этой точке, в отличие от остальных лектинов этой группы.

Специфичные к N-ацетил-D-галактозамину лектины. На рис. 5 приведены результаты оценки взаимодействия тимоцитов со специфичными к GalNAc лектинами из виноградной улитки, желтой акации, лимской фасоли и клещевины. Связывание лектина улитки с клетками тимуса мало зависит от их жизнеспособности и оказывается высоким, хотя и снижается для клеток в раннем апоптозе (рис. 5, столбец 1). Три остальных лектина этой специфичности демонстрируют почти идентичный уровень связывания с тимоцитами: до 1% в случае живых клеток, 2–6% клеток, находящихся в раннем апоптозе и 19–23% тимоцитов в позднем апоптозе (рис. 5, столбцы 2–4). Достоверным оказывается только прирост в последнем случае, а максимальную амплитуду (от следового связывания в случае живых клеток до 23% тимоцитов в позднем апоптозе) демонстрирует лектин клещевины рицин (рис. 5, столбец 4).

Gal-cпецифичные лектины. Динамика связывания лектинов этой специфичности оказывается несхожей (рис.6, столбцы 1 и 2). Лектин арахиса является одним из немногих, чьe связывание с тимоцитами снижается при развитии раннего апоптоза и повышается при развитии позднего апоптоза (от 81% в случае живых клеток до 56% в раннем апоптозе (P < 0.05) и вновь повышается до 90% в позднем апоптозе через 6 ч после введения гидрокортизона). Напротив, лектин омелы одинаково связывается с живыми тимоцитами и клетками в раннем апоптозе (по 3% популяции), сильнее окрашивая клетки в позднем апоптозе (18%, P < 0.05).

NANA-cпецифичные лектины. Лектины черной и красной бузины показывают сходную динамику окрашивания тимоцитов разной жизнеспособности: слабо связываясь с живыми клетками (до 1% популяции), они активнее взаимодействуют с тимоцитами в раннем апоптозе (2% в случае бузины красной и 15% в случае бузины черной), а максимально – при переходе тимоцитов в поздний апоптоз (15 и 55% соответственно), проявляя очевидную тропность к нежизнеспособным клеткам (рис.6, столбцы 3 и 4 соответственно).

Fuc-cпецифичный лектин из коры бобовника анагиролистного (рис.6, столбец 5) обладает минимальной во всей панели исследованных лектинов способностью к связыванию с тимоцитами (менее 0.1% для живых клеток и до 4% клеток в позднем апоптозе).

ОБСУЖДЕНИЕ

В предшествующих публикациях мы анализировали возможность использования лектинов растительного и животного происхождения для оценки уровня апоптоза тимоцитов (Серебрякова и др., 2019а) и типирования субпопуляций тимоцитов мыши (Серебрякова и др., 2019б). Приведенные выше данные могут дать важную информацию о структуре и характере изменений олигосахаридных компонентов гликокаликса тимоцитов мыши на разных стадиях апоптотического процесса.

Изучение изменений состава гликокаликса при апоптозе не является магистральным направлением исследований этого процесса. Гораздо чаще изучаются и оцениваются изменения объема и формы клетки (включая утрату микроворсинок, ресничек и других структур), конденсацию хроматина в ядре и диссоциацию ядрышек, фрагментацию ядра и формирование апоптотических телец, уровень активности каспаз, про- и антиапоптотических белков, митохондриальный потенциал, степень разрушения внутриклеточных мембран и уровень активности сериновых протеаз и трансглютаминазы цитоплазмы, разрушение цитоскелета и изменение состава липидов плазмалеммы и, наконец, изменения в структуре ДНК, степень ее фрагментации (Кудрявцев и др., 2012).

Тем не менее, изменение гликозилирования плазматической мембраны сопровождает различные процессы, протекающие в клетке, в том числе и запуск апоптоза. В литературе имеются данные об изменении связывания различных лектинов с тимоцитами разной степени зрелости, а также клетками, находящимися на разных стадиях апоптоза (London et al., 1978; Raedler et al., 1982; Bilyy et al., 2004). При анализе полученных результатов также следует принять во внимание, что сами лектины в большинстве своем также являются гликопротеинами (Лахтин, 1987), поэтому окрашивание ими клеток может быть связано как с распознаванием лектином структур гликокаликса, так и, наоборот, со связыванием рецепторов мембраны тимоцита с гликозилированным лектинами (Полевщиков, 1996).

Приведенные на рис. 2–6 результаты доказывают, что связывание практически всех лектинов с тимоцитами усиливается по мере перехода клеток в поздний апоптоз и дает основания предполагать, что в ходе апоптоза на поверхности клеток проявляются разные углеводные структуры, не выявляемые на жизнеспособных клетках из-за их маскировки структурами гликокаликса. Так, многие углеводные детерминанты замаскированы сиаловыми кислотами (Alvarez et al., 1999). Сиализация является последним этапом модификации гликопротеинов, и многие осуществляющие его сиалотрансферазы локализованы в транс-цистернах аппарата Гольджи (Roth et al., 1985; Bast et al., 1992). Нарушение работы аппарата Гольджи в результате запуска апоптоза может являться одной из причин появления на поверхности тимоцитов гликопротеинов и гликолипидов, не прошедших последний этап гликозилирования (Wyllie, 1980; Morris et al., 1984).

Низкий уровень связывания ряда лектинов с тимоцитами в позднем апоптозе (лектины крокуса, банана и бобовника анагиролистного, рис. 2, 6) свидетельствует о том, что усиление окрашивания другими лектинами носит специфический характер и связано с открытием новых детерминант. Однако есть бóльшие основания предполагать неспецифический характер связывания в случае лектинов подснежника и амариллиса, уровень окрашивания которыми (90% клеток и более) не зависит от жизнеспособности тимоцитов (рис. 2).

Результаты исследования согласуются с классическими данными. Так, в течение многих лет в работе с Т-лимфоцитами человека и животных в качестве митогенов используются конканавалин А и фитогемагглютинин, которые вызывают перекрестную сшивку мембранных рецепторов с последующими кэппингообразованием, активацией и (по меньшей мере, однократным) прохождением клеточного цикла. Полученные в работе результаты указывают на низкий уровень связывания специфичного к Man/Glc конканавалина А (около 1%) и специфичного к N-ацетил-D-глюкозамину фитогемагглютинина (около 5% клеток) с живыми клетками, однако этот уровень возрастает до 5–6% после вхождения тимоцитов в обратимую стадию раннего апоптоза (рис. 3 и 4). Последний результат полностью согласуется с морфологическим анализом их связывания с Т-клетками человека, проведенным с помощью меченых лектинов и последующей авторадиографией (Stobo, 1972), либо с использованием современного иммунопероксидазного способа идентификации помеченных клеток (Balcan, 2016).

Результаты также позволяют уточнить роль сиаловых кислот как одного из главных компонентов гликокаликса живых клеток, маскирующих лежащие ниже олигосахариды (Alvarez et al., 1999). Вопреки укоренившимся представлениям о сиаловых кислотах как главных компонентах гликокаликса, лектины черной и красной бузины связываются всего с 1% живых тимоцитов, однако по мере развития апоптоза доля окрашенных клеток быстро и неуклонно возрастает (рис. 6, столбцы 3, 4). Принимая во внимание, что термин “N-ацетилнейраминовая кислота” в действительности охватывает семейство 9-членных карбоксилированных сахаров, включающее свыше 30 разных молекул (Pilatte et al., 1993), можно предположить, что лигандами обоих использованных в работе лектинов бузины были олигосахариды, не характерные для наружных структур гликокаликса живых тимоцитов. Одновременно это не отменяет смены профиля олигосахаридов семейства NANA по ходу созревания и дифференцировки тимоцитов (Gillespie et al., 1993; Krishna, Varki, 1997; Wu et al., 1997), равно как и появления новых лигандов при обнажении базальных структур гликокаликса в позднем апоптозе.

На основании полученных данных можно утверждать, что внешние структуры гликокаликса живых тимоцитов содержат ограниченный набор олигосахаридов, содержащих N-ацетил-D-галактозамин и D-галактозу в концевом положении, которые утрачиваются уже в раннем апоптозе. На это указывает окрашивание лектинами виноградной улитки и арахиса (рис. 5 и 6). Вероятно, по этой причине эти лектины на протяжении многих лет использовались в лектиногистохимии для выявления созревающих тимоцитов (Hellström et al., 1976; London et al., 1978). Специфичные к N-ацетил-D-галактозамину структуры тимоцитов играют важную роль в созревании этих клеток, поскольку через них опосредуется заякоревание тимоцитов к клеткам-нянькам, что подтверждается изменением активности цитоплазматических гликозилтрансфераз GalNAc-T1 и GalNAc-T2 (Alvarez et al., 2006).