Цитология, 2021, T. 63, № 5, стр. 491-499

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Клетки и их культивирование. Исследовали 3 линии эМСК человека (рабочие названия линий: 1, 2, 3), полученные и охарактеризованные в ИНЦ РАН (Санкт-Петербург). Клетки анализируемых линий имели поверхностные маркеры мезенхимного ряда (СD13, CD29, CD44, CD73, CD90, CD105) и не несли гемопоэтические маркеры (CD11b, CD34, CD45, CD117, CD130, HLA-DR класса 2). Клетки всех 3-х линий были способны к направленной к дифференцировке в адипогенном и остеогенном направлениях (Земелько и др. 2011).

Клетки культивировали в среде DMEM/F12 (Gibco, США), содержащей 10% бычьей эмбриональной сыворотки (HyClone, США), 1% антибиотика-антимикотика и 1% GlutaMAX (Gibco, США). Клетки пересевали 2 раза в неделю в соотношении 1 : 3–1 : 4, используя 0.05%-ный раствор трипсин–ЭДТА (Invitrogen, США).

Кариотипический анализ. Использовали метод дифференциальной окраски хромосом на G-диски. Для приготовления препаратов клетки высевали с плотностью (14–15) × 10³ кл./см². Через 24–25 ч в культуру добавляли 0.02 мг/мл колцемида (Sigma, США) на 1 ч. Затем среду удаляли, клетки открепляли от пластика 0.05%-ным раствором трипсина, клеточную суспензию центрифугировали (1500 об./мин), супернатант удаляли, осадок ресуспензировали и подвергали гипотонической обработке 0.56%-ным раствором KCl (1 ч). Затем суспензию центрифугировали (1300 об./мин), супернатант удаляли, клеточную суспензию фиксировали в течение 1.5 ч холодной смесью метанола с уксусной кислотой (3 : 1), трижды заменяя за это время фиксатор на свежий. Фиксированный материал раскапывали на холодные и влажные предметные стекла. Препараты в течение 1 нед. высушивали при комнатной температуре. Метафазные пластинки окрашивали красителем Гимза на фосфатном буфере после предварительной трипсинизации (Биолот, Россия). Цитогенетичский анализ проводили с использованием светового микроскопа Axio Scop (Carl Zeiss, Германия) при увеличениях объектива 20× и 100×. Хромосомы идентифицировали в соответствии с международной номенклатурой (Mitelman, 1995) и атласом хромосом человека (Мамаева, 2000).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Цитогенетический анализ препаратов метафазных хромосом эМСК показал, что клетки всех 3-х линий уже с ранних пассажей проявляли признаки кариотипической гетерогенности. Профиль кариотипической нестабильности для каждой линии был индивидуален.

Линия 1. В популяции линии 1 на 3-ем пассаже культивирования были обнаружены два варианта клеток: около 50% клеток в популяции имели стандартный набор хромосом, другая часть популяции характеризовалась кариотипическими дефектами. Дефекты были связаны с появлением изохромосом (возникших в результате неполного расхождения в митозе гомологичных копий) и хромосом с нарушенной конденсацией в одной из копий, а также с межхромосомными ассоциациями (эктопической конъюгацией) и возникновением моно- или трисомии по отдельным хромосомам (рис. 1). Выявленные изменения носили случайный характер. Исключение составляли межхромосомные ассоциации с неоднократным вовлечением в них хромосом 13, 14, 15, при этом вторым партнером сцепления могла быть любая хромосома набора. В результате повторного анализа клеток этой линии на 6-ом пассаже были выявлены такие же изменения, как и на 3-ем, однако появился новый тип хромосомных отклонений – хромосомные поломки (рис. 1). Хромосомные поломки затрагивали область центромеры, при этом наблюдались полное или частичное сохранение генетического материала. Частота встречаемости клеток с кариотипическими отклонениями была несколько больше по сравнению с более ранним пассажем. Каждое выявленное изменение само по себе было уникальным, что говорит о случайном характере выявляемых кариотипических отклонений. Кариотипический анализ на 15-ом пассаже выявил, что анализируемая клеточная культура стабилизировалась. Преимущество имели клетки с нормальным кариотипом (рис. 1). Нарушение конденсации в гомологах отсутствовало. Двуплечая изохромосома (15/15) равно как и эктопическая конъюгация (13/14) встретились единожды. В 4-х клетках из 16 наблюдали моносомию случайного характера. Хромосомные поломки отсутствовали.

Рис. 1.

Кариотипы клеток линии 1 на разных этапах культивирования. Пассаж 3: эктопическая конъюгация хромосом 13 и 15. Пассаж 6: моносомия по хромосомам 9, 16 и 21; прицентромерная поломка хромосомы 10 с сохранением материала. Пассаж 15: нормальный кариотип. На рис. 1–3: n – число хромосом в кариотипе.

Линия 2. Клетки линии 2 на 3-ем пассаже так же, как и клетки линии 1 характеризовались наличием 2-х субпопуляций: с нормальным кариотипом и с кариотипическими отклонениями. Однако число клеток с нормальным кариотипом составляло только 25%. Характер выявленных изменений существенно отличался от изменений в клетках линии 1. Основными изменениями, выявленными в клетках линии 2, были хромосомные поломки и моносомия (рис. 2). В клетках проанализированной популяции наблюдали преимущество вовлечения определенных хромосом в изменения. Так, в 3-х метафазных пластинках наблюдали прицентромерные поломки в хромосоме 1. И по этой же хромосоме неоднократно наблюдали трисомию. Изменения в других хромосомах (поломки с сохранением генетического материала, частичной его утратой или транслоцированием безцентромерного локуса на другую хромосому) носили случайный характер. В отдельных клетках выявляли эктопическую конъюгацию между негомологичными хромосомами с участием в качестве одного из партнеров хромосом 12 и 15 (рис. 2).

Рис. 2.

Кариотипы клеток линии 2 на разных этапах культивирования. Пассаж 3: поломка хромосомы 9 с сохранением материала; эктопическая конъюгация хромосом 12 и 15. Пассаж 14: трисомия по хромосоме 2, моносомия хромосом 12, 17, 22 и X; прицентромерная поломка с сохранением материала хромосом 8 и 12; делеция в хромосоме X.

Повторный кариотипический анализ клеток линии 2 на 14-ом пассаже выявил значительное увеличение степени кариотипической дестабилизации популяции. Характер выявляемых кариотипических дефектов остался таким же, как и на раннем этапе культивирования, однако количество хромосом, равно, как и количество клеток, вовлекаемых в отклонения, значительно увеличилось. В процесс дестабилизации были включены все хромосомы набора за исключением хромосомы 16. Клетка могла быть маркирована не одним, а несколькими разнотипными изменениями (рис. 2). Хромосомные поломки в большинстве случаев сопровождались делетированием части хромосомного материала. Такие изменения как наличие изохромосом и межхромосомных ассоциаций были единичными. В некоторых клетках наблюдали отсутствие сразу двух гомологов.

Линия 3. По степени гетерогенности на начальном этапе культивирования (пассаж 5) клетки этой линии были схожи с клетками линии 2, и большая часть популяции имела кариотипические дефекты. Выявляемые отклонения были представлены хромосомными поломками, как с сохранением, так и утратой генетического материала, и анеуплоидией наличием трисомий и моносомий по отдельным хромосомам (рис. 3). Повышенной нестабильностью характеризовались хромосомы 2 и 4. Вовлечение в кариотипические изменения остальных хромосом набора носило случайный характер. Анализ клеток линии 3 на 13‑ом пассаже показал, что характер изменений и доля популяции с кариотипическими дефектами остались такими же, как на 6-ом пассаже. Однако на 13-ом пассаже наблюдали увеличение количества хромосом, вовлекаемых в перестройки, в некоторых клетках в перестройки были вовлечены обе гомологичные хромосомы. Хромосомные поломки в хромосомах 6, 12, 16 и Х были выявлены неоднократно (рис. 3). Число хромосом, вовлеченных в анеуплоидию при этом существенно не изменилось (на 6-ом пассаже число хромосом, вовлеченных в анеуплоидию было 11, на 13-ом пассаже – 12 из кариотипческого набора). Эктопическая конъюгация была найдена только в одной клетке.

Рис. 3.

Кариотипы клеток линии 3 на разных этапах культивирования. Пассаж 5: прицентромерная поломка с сохранением материала в хромосомах 2 и 9. Пассаж 13: трисомия и поломка двух гомологов хромосомы 1 с сохранением материала и делетированием соответственно; делеция в p-плече хромосом 4 и X; делеция p-плеча хромосомы 12; моносомия по хромосоме 18, 22, X.

ОБСУЖДЕНИЕ

Исходя из того, что эМСК рассматриваются как перспективные источники биоматериала для использования в регенеративной и восстановительной терапии, важно знать, насколько они генетически стабильны в условиях культуры. Существуют данные, что в связи с переводом в искусственные условия жизнедеятельности клетки претерпевают разного типа стрессы, связанные со способом пересева, с реактивами, используемыми при культивировании, с плотностью культуры (Jacobs et al., 2016), а также с температурным режимом (Tan et al., 2019), влажностью, насыщением клеток кислородом (Ueyama et al., 2012), продолжительностью культивирования и человеческим фактором (Rajamani et al., 2014). Есть данные, что при культивировании стволовых клеток энзиматический способ пересева клеток способствует дестабилизации клеточного генома (Ruby, Zheng, 2009).

В основе генетических изменений в клетках, связанных с воздействием стрессовых факторов, лежат разные механизмы: сбой в программе клеточного деления, возникновение двухцепочечных разрывы ДНК и изменения метилирования ДНК. Возникающие изменения инициируют неправильную сегрегацию тех или иных хромосом кариотипического набора, возникновение анеу-, полиплоидии, которая сама по себе может стать индуктором последующей нестабильности, разнотипных несбалансированных хромосомных перестроек и конформационных изменений в хромосомах. Важно отметить, что возникающие отклонения на уровне кариотипа могут носить как случайный, так и неслучайный характер. В настоящем исследовании повышенной склонностью к агглютинации характеризовались хромосомы 13, 14 и 15. Интересно, что связь этих хромосом с неслучайной эктопической конъюгацией была описана и ранее на различных типах МСК человека и мыши (Гринчук и др., 2008; Кольцова и др., 2018; Муссорина и др., 2019). Природа этого явления до конца не ясна. Тем не менее, существует предположение, что агглютинация хромосом, равно как и изменения конденсации хроматина связаны с нарушениями метилирования ДНК (Heng et al., 2013).

В настоящей работе мы показали, что анализируемые в настоящей работе эМСК при переводе в условия in vitro претерпели генетические изменения. Однако профиль кариотипической изменчивости и динамика его развития оказались разными.

Наибольший интерес в связи с относительной кариотипической стабильностью вызывают клетки линии 1. Структурные изменения хромосом на раннем 3-ем пассаже определялись только такими генетическими изменениями, как эктопическая конъюгация негомологичных хромосом, неспецифические нарушения конденсации некоторых хромосом набора, сбой в программе клеточного деления, связанные с появлением в кариотипе изохромосом. Усиление кариотипической изменчивости на 6-ом пассаже, связанное с наличием единичных поломок хромосомного материала, нивелировалось при последующем культивировании и не оказывало влияния на изменение генетического статуса клеток. К 15-му пассажу большинство возникших ранее кариотипических изменений исчезали, и линия могла рассматриваться как кариотипически стабильная. Возможность подобной генетической реверсии к норме была описана Сталтзом с соавторами (Stultz et al., 2016) при анализе клеточных линий МСК. Эти авторы установили, что на ранних этапах культивирования (3, 5-й пассажи) клетки характеризовались нестабильным кариотипом, однако к 7-ому пассажу 3 клеточные линии из 6 вернулись к нормальному кариотипу.

Две другие наши линии эМСК (линия 2 и 3), полученные, как и линия 1, в пределах одной лаборатории при использовании одинаковых питательных сред и прочих условий работы с клетками in vitro, уже на ранних этапах культивирования проявляли генетическую нестабильность, связанную с поломками хромосом и значительной степенью анеуплоидизации популяции. Каждая линия в процессе культивирования характеризовались индивидуальным профилем кариотипической изменчивости. В отличии от линии 1 выявленные изменения были связаны с поломками хромосомного материала и анеуплоидией. Зарегистрированная на первых этапах нестабильность прогрессировала во времени, в процесс дестабилизации вовлекались дополнительные хромосомы.

Сравнение полученных в настоящей работе данных с литературными данными по кариотипированию других типов МСК показало, что если изменения в структуре кариотипа эМСК ограничивались преимущественно поломками хромосомного материала, а также моно- и трисомиями, в МСК иного происхождения спектр возникающих аберраций был значительно шире и включал транслокации, дупликации, кольцевые хромосомы, дицентрики, теломерные ассоциации (Гринчук и др., 2008; Попов и др., 2009; Муссорина и др., 2019; Кольцова и др., 2020; Pesserini et al., 2016). Такой широкий спектр хромосомных изменений характерен для раковых опухолей. В этой связи наличие подобных перестроек в популяциях стволовых клеток настораживает, т. к. может рассматриваться как предпосылка к их трансформации, в частности, злокачественной (Гринчук и др., 2008; Попов и др., 2009; Pesserini et al., 2016).

В наших более ранних работах, проведенных на клеточных линиях эМСК методами молекулярного кариотипирования и секвинирования следующего поколения мы установили, что клетки с такими кариотипическими отклонениями как хромосомоные поломки и анеуплоидия не имели онкогенного трансформационного потенциала (Vinogradov et al., 2017; Shilina et al., 2018). Обсуждая генетические дефекты, выявленные нами в прокариотипированных эМСК, можно говорить о том, что скорее всего они носят адаптивный характер, хотя донороспецифическое влияние на структурную нестабильность для линий 2 и 3 не исключается. Согласно полученным нами данным эМСК при переводе из системы in vivo в систему in vitro могут иметь индивидуальную историю адаптивных генетических изменений в связи с чем разный генетический статус.

Полученные в настоящей работе данные говорят в пользу того, что эМСК от линии к линии могут различаться как по начальному уровню кариотипической гетерогенности, так и по ее развитию в процессе пассирования. Наиболее благоприятным для нормализации культуры является наличие на ранних пассажах клеток с редкими неклональными дефектами, не затрагивающими структуру хромосом. Возникновение структурно перестроенных хромосом и выраженной анеуплоидии, как правило, имеет негативные последствия и ведет к последующей прогрессирующей во времени дестабилизации генома, что нежелательно, т. к. может спровоцировать онкогенную трансформацию. Поскольку клетки, не имеющие грубых изменений в структуре хромосом с единичными случайными изменениями, имеют шанс к нивелированию возникших на первых этапах культивирования изменений и возврату к генетической норме, при получении новых клеточных линий стволовых клеток важен их кариотипический анализ на ранних этапах культивирования. Не менее важна цитогенетическая оценка стволовых клеток при непосредственном использовании их в терапевтических целях.

Настоящее исследование представляет собой оригинальные приоритетные данные о генетической стабильности эМСК в культуре.