Журнал физической химии, 2022, T. 96, № 8, стр. 1201-1210

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В качестве объекта исследования использовали личинки GM, выращенные в питомнике Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН [18]. Антибактериальные пептиды, приведенные в табл. 1, индуцировались в гемолимфе личинок GM после их иммунизации бактериями B.сereus, Escherichia coli или токсичным несимметричным диметилгидразином [7–9].

Способы получения гемолимфы личинок, подготовки образцов к биохимическим и физико-химическим исследованиям подробно описаны в [7, 8].

Анализ и разделение антибактериальных пептидов методом ОФ ВЭЖХ проводили на колонках: Zorbax Eclipse XDB-С18, заполненной SiO₂–С18 (AgilentTechnologies, США), размером 150 × × 4.6 мм (размер зерна 5 мкм, диаметр пор 80 Å), и Hypercarb (ThermoScientific, США) размером 100 × 2.1 мм (размер зерна 5 мкм, диаметр пор 250 Å), упакованных в жидкостной хроматограф Agilent 1200 с диодно-матричным детектором и программным обеспечением ChemStation А.10.02. Свободный объем колонки определяли, используя нитрит натрия. Мертвое время колонки, измеренное в установленных условиях градиента ацетонитрила, составило 1.8 ± 0.2 мин. В качестве стандартов выбраны пептиды Nisin и Galleria defensin 1. Разделение пептидов осуществляли в условиях градиентного элюирования при переменном во времени составе бинарного растворителя. Режимы градиентного элюирования приведены в табл. 2.

Масс-спектрометрическое исследование фракций гемолимфы GM-методом МАЛДИ проводили на масс-спектрометре UltraFlex II TOF (Bruker Daltoniks, Германия), оснащенном азотным лазером (λ = 337 нм, энергия лазерного излучения 110 кДж, частота импульса до 20 Гц), времяпролетным масс-анализатором с рефлектоном и программным обеспечением для сбора и обработки масс-спектров FlexControl 3.4 и FlexAnalysis 3.4. Ускоряющее напряжение 25 кВ. Масс-спектры получали в режиме регистрации положительных ионов. Масс-спектрометр UltraFlex II TOF-TOF (Bruker Daltoniks), оснащенный неодимовым лазером (λ = 355 нм, энергия лазерного излучения 105 кДж, частота импульса до 20 Гц) и времяпролетным масс-анализатором с рефлектоном, использовали для изучения фрагментации исходных метастабильных протонированных молекул пептидов в режиме распада за пределами ионного источника. Масс-спектры ионов-продуктов регистрировали методом LIFТ (Bruker Daltonics). Начальное напряжение и ускоряющая разность потенциалов составляли 7 и 28 кВ соответственно. Точность измеренных моноизотопных масс [M + H]⁺ в режиме рефлектрона составляла 0.007%, точность измеренных усредненных масс в линейном режиме 0.05–0.1%, точность измеренных масс фрагментов 1–2 Да (0.02–0.1%). Образцы для МАЛДИ готовили на мишенях AnchorChip с матрицей HCCA (α-циано-4-гидроксикоричная кислота) от Bruker Daltoniks.

Использовали систему Mascot [10] для определения первичной структуры пептидов на основании информации, получаемой при их диссоциации. Поиск проводился по массам метастабильных протонированных молекул пептидов [M + H]⁺, присутствующим в базе данных NCBI [11] и полученным в работах [7–9]. Определение первичной структуры неизвестных пептидов проводили на основании результатов процедуры секвенирования de novo [19].

Использовали АсСN (HPLC-gradient grad, Aldrich, США), 99% ТФУ (Alfa Aesar, Германия) и тридистиллированную воду, очищенную на фильтрах Millipore (Milli-P QG, Waters, США).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Хроматографическое разделение пептидных продуктов гемолимфы GM происходит за счет взаимодействий растворенных веществ с гидрофобной неподвижной фазой и водно-органическим элюентом. Оптимизация режима хроматографического разделения может быть проведена путем изменения селективности разделения за счет изменения состава и градиента подвижной фазы либо за счет радикального увеличения эффективности хроматографической колонки. На рис. 1 приведены хроматограммы разделения пептидных смесей иммунизированной гемолимфы GM на колонке Zorbax Eclipse XDB-С18 в условиях градиентного элюирования №№ 1 и 2 (табл. 2). Использование ион-парного агента ТФУ в подвижной фазе (режимы № 2–6) оказывает значительное влияние на селективность разделения пептидов. К тому же, по данным [20], использование ТФУ способствует подавлению нежелательных процессов в колонке.

Рис. 1.

Хроматограммы разделения на колонке Zorbax Eclipse XDB-С18 пептидных смесей гемолимфы Galleria mellonella после иммунизации B.сereus (1) и НДМГ (2) в режимах градиентного элюирования № 1 (а) и № 2 (б). Детектирование при 214 нм.

Порядок элюирования пептидов гемолимфы GM в разных режимах разделения на октадецилсиликагеле в большинстве случаев зависит от массы М пептидов и количества звеньев n в их цепи, но может изменяться при добавлении ТФУ в элюент (табл. 3).

В режиме элюирования № 1 сравнительно короткоцепочечный пептид № 2 выходит из колонки после массивного пептида № 9. Модель SSRCalc объясняет аномально сильное удерживание на SiO₂–С18 пептида № 2 его высокой гидрофобностью, так как в первичной структуре цекропинов содержится более половины гидрофобных остатков. После добавления ТФУ (режим № 3) наблюдается инверсия выхода пептидов №№ 2, 9 из колонки. По данным [20], величина и направление модифицирующего эффекта ион-парного агента зависят от знаков заряда ТФУ и пептидов. В кислой среде происходит протонизация концевых аминогрупп пептида № 9 (аргинин К) и удерживание пептида увеличивается. Пептид № 2 содержит кислые концевые карбоксильные группы (аспарагиновая D и глутаминовая E кислоты), ионизацию которых подавляет ТФУ.

Иммунизация гемолимфы GM сопровождается деструкцией некоторых исходных пептидов и образованием их фрагментов f массой 1–3 кДа с установленной в [7–9] антибактериальной активностью.

На рис. 2а проведено сопоставление экспериментальных (режим элюирования № 3) и рассчитанных с помощью алгоритма SSRCalc значений t_R некоторых пептидов GM (табл. 3). Полученная линейная зависимость свидетельствует о возможности модели SSRCalc адекватно прогнозировать порядок элюирования короткоцепочечных пептидов GM. Модель BioLCCC дает худшие прогнозы, так как изначально была предложена для описания удерживания макромолекул полимеров и белков. Также для режима элюирования № 3, который мы считаем оптимальным, на рис. 2б приведена зависимость экспериментальных значений t_R от дифференциальных мольных энергий Гиббса δ(∆G), рассчитанных относительно стандартного пептида Nisin. Ее можно описать уравнением δ(∆G) = –0.0797 t_R + 2.5082 (коэффициент корреляции r² = 0.994) или в логарифмической форме δ(∆G) = –2.68 $\ln {{t}_{{\text{R}}}}$ + 9.2272 (r² = 0.9998). Полученная зависимость свидетельствует о том, что разделение пептидов GM происходит в соответствии с общими физико-химическими закономерностями, т.е. является отражением связи порядка элюирования в данной системе с изменением свободной энергии Гиббса. Знание одной из взаимозависимых величин позволяет решить задачу определения или предсказания другой в данном процессе разделения.

Рис. 2.

Корреляция экспериментальных (режим элюирования № 3) и рассчитанных (SSRCalc) значений времен удерживания t_R антибактериальных пептидов Galleria mellonella (а) и зависимости экспериментальных значений t_R от дифференциальных мольных энергий Гиббса δ(∆G) (б): 1 – линейная зависимость, 2 – логарифмическая зависимость.

Проведение хроматографии при повышенной температуре – удобное средство изменения селективности и повышения эффективности разделения. В табл. 4 приведены параметры удерживания антибактериальных пептидов в условиях режима элюирования № 4 при температуре 40°С. С повышением температуры роль специфических взаимодействий уменьшается, снижается вязкость растворителя, но усиливаются конформационные изменения в биомолекулах, приводящие к нарушениям в их вторичных структурах. Например, при изменении температуры от 25 до 40°С значение t_R цекропина № 2 увеличивается с 35.2 до 47.7 мин в результате раскручивания α‑спиралей его молекул и увеличения площади их гидрофобного контакта с поверхностью неподвижной фазы. Разупорядоченные молекулы пептидов могут взаимодействовать друг с другом, образуя более устойчивую и энергетически выгодную конформацию. По-видимому, таким взаимодействием можно объяснить соэлюирование четырех фрагментов антимикробных пептидов №№ 2, 4, 7 при t_R = 39.6 мин. Повышение температуры нарушает адсорбционное равновесие в хроматографической системе и не позволяет реализовать критический режим. В результате модели SSRCalc и BioLCCC не способны правильно предсказывать параметры удерживания пептидов (табл. 4), корреляция между экспериментальными и расчетными значениями t_R отсутствует.

В результате проведенных исследований по оптимизации режима градиентного элюирования смеси пептидов гемолимфы GM путем изменения состава и скорости подвижной фазы, температуры колонки, протяженности градиента удалось получить хроматограммы с равномерным распределением сравнительно хорошо разрешенных пиков (рис. 3). Оптимальное разрешение получено в режиме градиентного элюирования № 3. Причем в этом режиме удалось добиться хроматографического разделения пептидов №№ 4, 7, 8 и исключить этап их очистки, что не удавалось ранее [7].

Рис. 3.

Хроматограммы пептидных смесей гемолимфы Galleria mellonella (режим элюирования № 3): 1 – до иммунизации, 2, 3 – после иммунизации B. cereus и несимметричным диметилгидразином, соответственно. Детектирование при 210 нм.

После иммунизации GM усложняется хроматографический профиль пептидных смесей гемолимфы (рис. 3), появляются новые пики и увеличивается интенсивность прежних сигналов, т.е. наглядно проявляется иммунный ответ организма. Идентификация пептидов методом МАЛДИ-МС [7, 9] позволила установить, что воздействие бактерий и токсикантов приводит к деструкции исходных пептидов гемолимфы, их модификации и синтезу новых короткоцепочечных соединений с массой до 3 кДа с антибактериальной активностью.

Для разделения аминокислот, пептидов, антибиотиков и других высокополярных соединений в качестве сорбента часто используется пористый графитированный углерод (ПГУ), обладающий высокой удельной поверхностью и пористостью, механической прочностью и стабильностью в широком диапазоне значений pH и температур [21, 22]. Для разделения смеси антимикробных пептидов GM на колонке Hypercarb с сорбентом ПГУ сравнительно более удачным оказался режим градиентного элюирования № 6. Однако даже в этом режиме разделение пептидной смеси на колонке Hypercarb было намного хуже, чем на колонке Zorbax Eclipse XDB-С18 (рис. 4). В элюате удалось обнаружить только пептид № 6 (t_R = = 8.2 мин) и низкомолекулярные компоненты антикоагулянта (ЭДТА, тиомочевина). Пептид № 6 на колонке Zorbax Eclipse XDB-С18 удерживается сравнительно слабее (t_R = 3.5 мин), что соответствует данным [22] о больших временах удерживания аминокислот на Hypercarb по сравнению с фазами на основе силикагеля.

Рис. 4.

Хроматограммы разделения смеси пептидов гемолимфы Galleria mellonella на колонках Hypercarb (а) и Zorbax Eclipse XDB-С18 (б) в условиях хроматографического режима № 6. Детектирование при 210 нм.

Сильное удерживание антибактериальных пептидов GM на колонке Hypercarb связано с высокими значениями теплот их адсорбции (табл. 5), которые были рассчитаны молекулярно-статистическим методом для графита и использованы для ПГУ (Hypercarb) с учетом эмпирического поправочного коэффициента [22]. При проведении расчетов полипептидную цепь представляли в виде суммы инкрементов аминокислотных остатков –HN–CН(R)–CO–. Зная теплоты их адсорбции и учитывая С-концевую аминокислоту, по аддитивным схемам определили теплоты адсорбции исследуемых пептидов на ПГУ.

Высокие значения теплот адсорбции пептидов позволяют предположить, что они хемосорбируются на ПГУ. По-видимому, структура ПГУ способствует возникновению π–π-взаимодействий с полярными группами пептидов, которые являются сильнополярными соединениями и при рН 2.5 имеют высокий положительный заряд (z = 5–8). Сила взаимодействия пептидов с ПГУ зависит от площади сорбированной молекулы, а также от типа и расположения ее функциональных групп по отношению к поверхности сорбента. Вблизи поверхности ПГУ конформация молекул пептидов может измениться, нарушится их вторичная структура и пептидные клубки развернутся. Адсорбция пептидных цепочек характеризуется высокими энергиями взаимодействия между молекулами и, соответственно, преимущественным вкладом энтальпийного фактора в удерживание. Однако необратимая в данных условиях потеря одной степени свободы позволяет говорить и о вкладе энтропийной составляющей в удерживание. Тот факт, что некоторые пептиды все-таки хроматографируются на Hypercarb, указывает на их глобулярное строение либо на неплоское расположение молекул пептидов на поверхности сорбента. В целом, хроматограмма пептидной смеси на Hypercarb характеризуется более низкой оптической плотностью элюата, чем хроматограмма на Zorbax Eclipse XDB-С18. Это свидетельствует о том, что полного элюирования антимикробных пептидов не произошло и что исследуемые пептиды в данных условиях не хроматографируются. Поэтому дальнейшие исследования хроматографического поведения антибактериальных пептидов проводились только на колонке Zorbax Eclipse XDB-С18 с октадецилсиликагелем, взаимодействие которого с пептидами в большей степени является только дисперсионным.

Хроматографический процесс зависит как от равновесных характеристик сорбции, так и от кинетики сорбции. Знание кинетических характеристик процесса позволяет оценить качество колонки и оптимизировать разделение. В табл. 6 приведены результаты расчета эффективности хроматографического разделения антимикробных пептидов GM на колонке Zorbax Eclipse XDB-С18 в оптимальном режиме градиентного элюирования № 3. Параметры N (число теоретических тарелок) и H (приведенная высота, эквивалентная теоретической тарелке) отражают качество использованного сорбента, качество заполнения колонки, правильность выбора хроматографического режима, а также являются мерой интенсивности процессов размывания в колонке.

Разрешение R между двумя соседними хроматографическими пиками является мерой качества разделения и определяется как статическими характеристиками сорбционного слоя, так и динамическими условиями проведения разделения, влияющими на эффективность [20]. Поскольку R > 1, то разделение исследуемых пептидов происходит полностью и с высокой эффективностью. Значения хроматографических параметров, приведенные в табл. 6, свидетельствуют о том, что колонка, сорбент и хроматографический режим для разделения антибактериальных пептидов выбраны правильно, поскольку достигается высокая эффективность разделения и размывание в колонке незначительно.

Таким образом, исследованы условия хроматографического разделения смесей антибактериальных пептидов гемолимфы Galleria mellonella, иммунизированной Bacillus сereus и несимметричным диметилгидразином, в условиях градиентной ОФ ВЭЖХ на колонках Zorbax Eclipse XDB-С18 и Hypercarb. Определены оптимальные условия разделения смесей пептидов путем изменения состава элюента, режима градиентного элюирования, температуры и эффективности хроматографической колонки. Дана оценка термодинамических и кинетических характеристик сорбции индуцированных пептидов на октадецилсиликагеле, получены корреляционные зависимости между расчетными и реальными временами их удерживания, между удерживанием и первичной структурой антибактериальных пептидов. Использование пористого графитированного углерода в колонке Hypercarb оказалось неэффективным для разделения смесей полярных пептидов из-за их сильного взаимодействия с сорбентом в исследованных режимах градиентного элюирования.

Работа выполнена в рамках государственного задания ИФХЭ РАН.

Авторы благодарят Центр коллективного пользования ИФХЭ РАН за предоставленное для исследований оборудование.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.