Журнал физической химии, 2023, T. 97, № 2, стр. 293-300

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Математическим выражением модели хроматографического удерживания служит зависимость фактора удерживания (k) бесконечно разбавленной пробы от состава ПФ. Требование бесконечного разбавления анализируемого вещества связано с необходимостью выполнения измерений в линейной области изотермы адсорбции. В противном случае k будет функцией концентрации аналита. Классические модели удерживания для обращенно-фазовой [12] или нормально-фазовой [13] жидкостной хроматографии описывают монотонные зависимости k от концентрации одного из компонентов бинарной ПФ. В случае элюирования ОПХ на исследуемой колонке наблюдаются U-образные зависимости [11], требующие более сложных уравнений.

Сочевинский [14], а позже Тсуи с соавт. [15] предложили механизм удерживания, в котором наряду с адсорбционными взаимодействиями учитывали влияние взаимодействий одного из компонентов ПФ (активного) с аналитом. Итоговое уравнение допускало немонотонное поведение фактора удерживания как функции концентрации активного компонента. Мы расширили модель Тсуи и др. на случай участия обоих компонентов бинарной ПФ (в данной работе воды и метанола) в сольватации и в конкурентной адсорбции соответственно:

В уравнениях (1) и (2) А – аналит, S – хиральный селектор неподвижной фазы, u и ${v}$ – число молекул воды (W) и метанола (М), участвующих в сольватации аналита в ПФ, а х и у – число молекул воды и метанола, вытесняемых аналитом с адсорбционного центра. Путем несложных математических преобразований, аналогичных описанным в работе [15], из системы уравнений (1) и (2), дополненных определением k как отношения количеств аналита в неподвижной и подвижной фазах, можно получить следующее выражение: где C_W и C_М – молярная концентрация воды и метанола в ПФ, K_S и K_A – константы равновесия сольватации и конкурентной адсорбции соответственно, ϕ – отношение объемов неподвижной и подвижной фаз в колонке и q_s – концентрация хиральных селекторов на поверхности неподвижной фазы.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Эксперименты выполняли на жидкостном хроматографе LC-20 ADXR (Shimadzu, Япония), оснащенном прецизионным насосом, диодно-матричным детектором, автодозатором и термостатом колонок. Измерения проводили на колонке Nautilus-R (4.6 × 250 мм) с привитым ристоцетином А производства ЗАО “БиоХимМак СТ” (Москва); размер частиц насадки составлял 6 мкм. Подвижными фазами служили смеси деионизованной воды с метанолом (“х.ч.”). Концентрацию метанола варьировали в диапазоне от 20 до 100% (здесь и далее указаны объемные проценты). Расход ПФ составлял 1 мл/мин. Хроматограммы записывали на длине волны 254 нм. Объем пробы был 2 мкл. Фактор удерживания аналитов определяли с большинством составов ПФ при температуре 25°C. При содержании метанола 50, 90 и 100% измерения выполняли при 20, 25, 30 и 40°С для вычисления термодинамических характеристик адсорбции. Исследуемые соединения получали в виде рацематов известным методом [16] и очищали двойной перекристаллизацией. Для измерений использовали их растворы в метаноле, концентрация которых не превышала 1 мг/мл и подбиралась таким образом, чтобы ее двукратное увеличение не изменяло заметно времени удерживания пиков. Соблюдение этого условия обеспечивает нахождение концентрации адсорбата в линейной области изотермы адсорбции. Каждое измерение повторяли 3 раза. Мертвый объем колонки (V₀) определяли по 1,3,5-три-трет-бутилбензолу (ТтББ), элюируя его чистым метанолом (“х.ч.”). В указанных условиях ТтББ не удерживается на ХНФ с привитыми антибиотиками и, обладая размерами сопоставимыми с таковыми для ОПХ, позволяет адекватно оценить доступное для исследуемых соединений пространство насадки [17]. В расчеты вносили поправку на внеколоночный объем, который определяли в системе без колонки. Стандартные энтальпию (ΔН⁰) и энтропию (ΔS⁰) адсорбции из раствора вычисляли по уравнению Вант-Гоффа:

где Т – абсолютная температура колонки, R – универсальная газовая постоянная. Фазовое отношение (ϕ) рассчитывали через геометрический (V_col) и мертвый объемы колонки как ϕ = (V_col – V₀)/V₀. Линейная зависимость в координатах $\ln k$ – 1/T с коэффициентом корреляции не менее 0.99 наблюдалась для всех исследованных систем.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Общие закономерности удерживания и энантиоразделения. В данной работе рассмотрены семь ОПХ с различными боковыми группами и заместителями у хирального центра. Хроматографические характеристики удерживания и разделения исследуемых веществ как функции концентрации метанола в ПФ представлены в табл. 1. В целом удерживание из водно-метанольных растворов характеризуется более высокими значениями k по сравнению с водно-ацетонитрильными средами. Для всех соединений наблюдается монотонно-убывающая зависимость k от содержания метанола с относительно небольшим увеличением удерживания в элюентах, содержащих менее 10% воды. Наибольшее удерживание в сопоставимых условиях показывают соединения I и II с пара- и мета-бромфенильными заместителями соответственно. В то же время соединение III с объемным м-трифторметилфенильным радикалом характеризуется наименьшим удерживанием. Подобное влияние заместителей на удерживание ОПХ наблюдали и для систем H₂O–CH₃CN [11]. Вероятно, размер бромфенильного заместителя оптимален для образования прочных адсорбционных комплексов обоих энантиомеров I и II с хиральным селектором. При этом соединения с заместителями меньшего размера удерживаются слабее.

Природа органического компонента ПФ оказывала заметное влияние на энантиоселективность. Так, в водно-метанольных растворах коэффициент разделения (α = k₂/k₁, индексы 1 и 2 означают первый и второй элюируемый энантиомер соответственно) достигал значения 2.35 для энантиомеров соединения I, которые не разделялись ни при каких условиях в ПФ H₂O–CH₃CN. Рацематы соединений с фенильным (IV и V) и м-бромфенильным (II) заместителями при элюировании метанолом показали наихудшее разделение из всех исследованных ОПХ. Наоборот, при элюировании ацетонитрилом эти аналиты характеризовались более высокими значениями α. Замена фенильного радикала тиенильным приводит к улучшению энантиоразделения, что противоположно результатам, полученным с ацетонитрилом. Наилучшее энантиоразделение с метанольными ПФ демонстрировал ОПХ VII с коротким, но разветвленным трет-бутильным заместителем у хирального центра. Энантиоселективность ХНФ по отношению к этому соединению оказалась выше, чем по отношению к ОПХ с крупными арильными радикалами. По-видимому, размер заместителя у VII способствует более оптимальному размещению его сильнее удерживаемого энантиомера внутри хиральной полости селектора.

При использовании CH₃OH в качестве органического компонента ПФ энантиоселективность в целом была выше и наблюдалась в большем диапазоне концентраций органического компонента по сравнению с ацетонитрильными ПФ. Такое же поведение наблюдалось в работе Екборг-Отт и др. [18], в которой разделение энантиомеров дипептидов на ристоцетиновой ХНФ было лучше из водно-метанольных смесей. Это может быть связано с особенностями взаимодействия ПФ с хиральным селектором или особенностями сольватации растворителем адсорбционного комплекса. Это не может объясняться сольватацией аналита в ПФ, поскольку последний – ахиральный процесс, и он не влияет на величину α.

Влияние состава подвижной фазы на удерживание. Зависимость k от концентрации ацетонитрила в ПФ имела U-образную форму [11]. Замена ацетонитрила на метанол привела к изменению зависимости – исчезновению ярко выраженной возрастающей ветви при высоком содержании органического компонента (φ > 90%) (рис. 1). Увеличение концентрации метанола свыше 90% приводило лишь к небольшому подъему ветви зависимости k от φ. Похожее поведение демонстрировали энантиомеры липофильного Leu-Leu при элюировании водно-метанольными смесями на колонке Chirobiotic R [8].

Убывающая ветвь зависимости k от φ объясняется увеличением элюирующей силы ПФ, обусловленным улучшением ее сольватирующей способности по отношению к гидрофобным ОПХ. Как видно из рис. 1, ПФ с апротонным ацетонитрилом обеспечивают лучшую сольватацию молекул ОПХ, чем водно-метанольные смеси при сопоставимых составах ПФ, до φ < 80%. Дальнейшее увеличение доли органического компонента не приводит к существенному увеличению сольватирующей способности смеси, и другой фактор начинает играть важную роль – десорбирующая активность воды. Молекулы воды, адсорбируясь на полярных участках неподвижной фазы, экранируют их от взаимодействия с аналитом. Поскольку антибиотиковые ХНФ преимущественно адсорбируют воду из бинарных водно-органических смесей [19], небольшого содержания воды в элюенте (~20%) достаточно для насыщения активных центров неподвижной фазы. По мере роста φ содержание воды уменьшается, как и ее экранирующее действие, что приводит к росту фактора удерживания. Очевидно, этот эффект будет менее выражен для метанола, потому что как протонное соединение он сам может экранировать бренстедовские активные центры.

Расширенная модель Тсуи и др., основанная на сочетании процессов вытеснительной адсорбции и сольватации в жидкой фазе, хотя и является упрощенным отражением реального процесса удерживания, хорошо описывает результаты эксперимента (табл. 2). Типичный пример аппроксимации экспериментальных данных модельной кривой показан на рис. 2. Регрессионные вычисления выполнялись для зависимостей k(C_M) для обоих энантиомеров одновременно, поскольку параметры модели, относящиеся к процессу в ПФ (K_S, u и ${v}$), для энантиомеров одинаковы. Это позволило увеличить число степеней свободы и тем самым устойчивость решения. Произведение q_sϕK_A в рамках регрессионной процедуры выступает как один подгоночный параметр. В предварительных расчетах было установлено, что параметр u, относящийся к воде, не превышал значения 0.16 для всех исследованных ОПХ и почти не влиял на точность подгонки. Поэтому его в дальнейших вычислениях приняли равным нулю для сокращения числа подгоночных параметров. С физической точки зрения, это указывает на то, что вода плохо сольватирует молекулы ОПХ, о чем свидетельствует плохая растворимость в воде исследованных соединений.

Значения подгоночных параметров выражения (3) приведены в табл. 2. Кажущееся число молекул метанола, вступающих в сильное сольватационное взаимодействие с аналитом в ПФ, близко к 2 для всех соединений, кроме V (1.7) и VI (1.6), которые характеризуются относительно низкой липофильностью (см. значения $\lg {{K}_{{ow}}}$ в табл. 1). Согласно модели, молекулы ОПХ вытесняют с поверхности от одной до двух молекул метанола и значительно менее одной молекулы воды. Очевидно, это условные цифры, которые, по-видимому, указывают на то, что при адсорбции ОПХ молекулы воды не удаляются, а остаются связанными с хиральным селектором. Сравнение значений подгоночных параметров для энантиомеров ожидаемо показывает, что энантиоселективность обеспечивается не столько различием в значениях стехиометрических коэффициентов уравнения (3), сколько различием в значениях констант адсорбционного равновесия.

Термодинамика адсорбции характеризуется экзотермическим тепловым эффектом для всех исследованных соединений во всех рассмотренных составах ПФ. Удерживание первого элюируемого энантиомера – энтальпийно контролируемый процесс (|ΔН⁰| > |TΔS⁰|) в ПФ с высоким содержанием воды (50% СН₃ОН) и становится энтропийно контролируемым в ПФ, обогащенных метанолом (табл. 3). Это обстоятельство приводит к положительным значениям ΔG⁰ (за исключением ОПХ I и VI в чистом метаноле) и соответственно слабому удерживанию, k < 1 (см. табл. 1). Прочнее удерживаемый энантиомер характеризуется сильно превалирующим энтальпийным вкладом в 50% СН₃ОН и сохранением энтальпийного контроля для соединений I, II, V–VII в чистом метаноле (табл. 3). Разделение энантиомеров (если наблюдается) во всех случаях характеризуется энтальпийным контролем (табл. 3), т.е. происходит благодаря различию в энергиях связи между энантиомерами и хиральным селектором. Энтропийные эффекты действуют в противоположном направлении, нивелируя до некоторой степени различия в сродстве между энантиомерами и селектором.

Изменение термодинамических характеристик адсорбции энантиомеров с увеличением доли СН₃ОН в ПФ происходит симбатно или квазисимбатно (тренды зависимостей сохраняются, но не точно повторяют друг друга) для соединений I–III, V и VI и антибатно для соединений IV и VII. Оба последних ОПХ содержат алкильные заместители, но в разных положениях: у IV – этильный радикал удален от хирального центра, а у VII – трет-бутильный радикал находится у хирального центра. Возможно, наличие неполярных заместителей влияет на особенности взаимодействия аналитов с растворителем в составе адсорбционного комплекса (особенности сольватации энантиомеров в ПФ не должны приводить к антибатному поведению, так как этот процесс является ахиральным, и соответствующие термодинамические вклады одинаковы для обоих оптических изомеров).

Тепловые эффекты адсорбции ОПХ из водно-метанольных растворов заметно (на 10–20 кДж/моль) выше таковых для водно-ацетонитрильных смесей [11] при сопоставимом составе жидкой фазы. Логично предположить, что это вызвано более высокой энтальпией сольватации ОПХ в смесях H₂O–СН₃CN по сравнению со смесями H₂O–СН₃ОН, благодаря лучшему взаимодействию менее полярного ацетонитрила с гидрофобными молекулами ОПХ. Поскольку десольватация аналита предшествует его взаимодействию с адсорбентом, то тепловой эффект сольватации вычитается из общего теплового эффекта адсорбции.

Таким образом, механизм удерживания ОПХ на ХНФ Nautilus-R из водно-метанольных смесей вполне объясняется сочетанием процессов сольватации аналита в ПФ и конкурентной адсорбцией на поверхности неподвижной фазы, причем сольватирующая способность элюента определяется содержанием метанола. Десорбирующая активность воды, играющая важную роль в элюировании ОПХ из водно-ацетонитрильных смесей в области высоких содержаний органического компонента (более 80%) [11], в данном случае не оказывает существенного влияния, поскольку метанол, в отличие от ацетонитрила, сам эффективно экранирует бренстедовские активные центры поверхности. Этим объясняется различие в форме кривых k(φ) ОПХ для ПФ с метанолом и ацетонитрилом. Природа органического компонента ПФ также влияет на энантиоселективность Nautilus-R по отношению к изученным ОПХ. Другой важный фактор энантиораспознавания –природа заместителя у хирального центра: арильные заместители, в общем, обусловливают меньшие значения α, чем разветвленный трет-бутильный радикал.

Работа выполнена при поддержке гранта Российского фонда фундаментальных исследований (код проекта № 19-33-90133). Авторы выражают благодарность И.В. Фефиловой за синтез соединения IV.