Физиология растений, 2021, T. 68, № 2, стр. 115-131

ВВЕДЕНИЕ

Во всем мире болезни растений постоянно бросают вызов устойчивому земледелию. С точки зрения экономики и экологии наиболее эффективным способом борьбы с болезнями является создание новых сортов растений с долговременной и стабильной устойчивостью. Устойчивость можно эмпирически определить как долговременную и стабильную (durable), если она сохраняется на высоком уровне при длительном возделывании культуры на значительной территории и в условиях, благоприятных для развития болезни. Различение “свой – чужой” – это ключ к реакции растений на вторжение патогена. В дарвиновской парадигме коэволюцию двух участников взаимодействия патогена с растением-хозяином при естественном отборе в ненарушенной природной среде можно сравнивать с процессами селекции растений в нарушенной среде агроценозов. В обоих случаях мы наблюдаем дорогостоящий отбор (high fitness cost) – у патогена на вирулентность, а у растений на высокую устойчивость [1, 2]. Молекулярные исследования последних лет значительно углубили наше видение взаимодействия растений и патогенов, столь важного для эффективного контроля болезней. Поэтому выяснение генетических связей и молекулярных механизмов вирулентности и устойчивости необходимо для успешной селекции на долговременную устойчивость к болезням.

В последние годы успехам в создании долговременной устойчивости немало способствовали поразительные достижения в изучении патогенов и растений-хозяев, которые во многом опираются на новейшие методы исследования строения и активности генов, в первую очередь, “омик” технологии. Успехи этих исследований наглядно представлены в случае фитофтороза – экономически наиболее важной болезни картофеля и томатов (возбудитель – оомицет Phytophthora infestans (Mont.) de Bary). Фитофтороз часто служит моделью многоярусного взаимодействия растений с микроорганизмами, и результаты новых исследований существенно меняют как наши общие представления о молекулярном диалоге растения с патогеном, так и наши подходы к борьбе с фитофторозом.

Фитофтороз постоянно угрожает глобальной продовольственной безопасности, облагая картофелеводов налогом, достигающим 10 млрд. долларов в год, если учитывать прямые потери урожая и стоимость химической защиты растений [3–6]. Фунгициды (оомицетиды), которые применяют сегодня для борьбы с этим безжалостным патогеном, угрожают здоровью людей и биосферы в целом. По всей видимости, наиболее эффективным и экологически приемлемым путем сдерживания фитофтороза является создание новых сортов картофеля с долговременной устойчивостью к этой болезни [7–10]. Успешную селекцию на долговременную устойчивость к фитофторозу питает приток новых знаний о биологии патогена P. infestans и растения-хозяина Solanum L., в первую очередь, знаний о молекулах – инструментах вирулентности патогена и устойчивости растения [11–17].

Когда задачей селекции является долговременная и стабильная устойчивость к фитофторозу, пристальное внимание обращают на такие определяющие стороны P. infestans, как функциональное разнообразие факторов вирулентности патогена и невероятная пластичность его генома, которая обеспечивает быстрые изменения в составе факторов вирулентности и ярко проявляется в популяционном поведении патогена [5, 6, 18–20]. Молекулярные исследования играют все возрастающую роль в изучении многослойной защиты растений [1, 12, 21]. В результате мы во все большей степени можем оценить сложность молекулярного диалога между картофелем и P. infestans, который так драматично проявляется в эпидемиях фитофтороза [5, 6, 22].

Наиболее наглядным проявлением устойчивости картофеля к P. infestans служит защитная реакция, связанная со смертью клеток в ходе реакции сверхчувствительности (hypersensitive response, HR) вслед за вторжением патогена в клетки растения и переносом в растение специфичных эффекторов, которые действуют как факторы (а)вирулентности (Avr factors). Поэтому Avr генам и их продуктам – эффекторам, распознаваемым защитными системами растения, уделяется сегодня так много внимания в молекулярных исследованиях патогена [16, 23–26]. Не менее важны и механизмы, используемые растениями для распознавания и отпора патогенам. Лучше других изучены случаи, когда Avr гены распознаются соответствующими (matching) генами устойчивости к P. infestans (Rpi генами), кодирующими иммунные рецепторные белки. Все охарактеризованные к настоящему времени рецепторы эффекторов P. infestans у картофеля относятся к классу coiled coil – nucleotide binding – leucine rich repeat (CC-NB-LRR) внутриклеточных белков растений. Новые сведения об Avr и Rpi генах и их взаимодействиях быстро расширяют научную основу столь разных технологий селекции, как отдаленные скрещивания или транс- и цисгенез, используемые для переноса Rpi генов из дикорастущих видов Solanum в восприимчивые сорта картофеля [7–9, 27–29].

Тем не менее, вследствие быстрой эволюции генома и вторжения новых штаммов P. infestans, эпифитотии фитофтороза постоянно прорывают выстроенные селекционерами заграждения, обращая в ничто, иногда в течение нескольких дней, их многолетние усилия [5, 6, 19]. Поэтому неотложной задачей биологов растений является постоянный поиск новых источников устойчивости к фитофторозу, по преимуществу в генетическом материале дикорастущих видов Solanum, расширение круга Rpi генов, подробно исследованных и документированных молекулярными методами [17, 29–31], и выявление лучших сочетаний генов для включения их в перспективные сорта картофеля [32].

В случае картофеля молекулярные исследования с использованием новых методов анализа строения и активности Avr генов P. infestans и Rpi генов дикорастущих и культурных растений Solanum значительно способствуют борьбе с фитофторозом. Среди наиболее значимых методологических прорывов выделяются так называемые “омик” технологии (геномика, транскриптомика, протеомика, метаболомика и эффекторомика), молекулярная цитогенетика, новые типы ДНК маркеров, поиск новых аллелей Rpi генов (allele mining) и, наконец, методы секвенирования нового поколения (next generation sequencing, NGS) полноразмерных геномов и транскриптомов или избранных генов-мишеней (target genes) – в сочетании с биоинформационным анализом больших массивов данных о геномах и транскриптомах растения и патогена. Эти прорывные методологии позволили идентифицировать на молекулярном уровне многих участников взаимодействий ген-на-ген, описанных ранее классическими генетическими методами. Успехи этих исследований сделали фитофтороз популярной моделью взаимодействия и коэволюции патогена и растения-хозяина [12, 15–17, 22, 28, 33–39]. В то же время новый контекст исследований геномов и новый молекулярный инструментарий этих исследований позволяют создавать более продуктивные сорта картофеля.

Во многих отношениях этот обзор следует за предыдущей публикацией автора [39]. Здесь в центре внимания оказались новейшие методологии исследования и недавние обзоры, объединившие инновационные идеи эволюции растений и микроорганизмов с новыми концепциями фитопатологии и селекции растений. Библиография доведена до июня 2020 г.

РАСПОЗНАВАНИЕ ПАТОГЕНА И ЗАЩИТНЫЕ БАРЬЕРЫ РАСТЕНИЯ-ХОЗЯИНА: ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ

Иммунитет, индуцированный молекулярными структурами (Pattern-triggered immunity). Чтобы распознавать многочисленные патогены, сдерживать их вторжение и ограничивать повреждающее действие, растения создали сложную иммунную систему, которую часто описывают как два барьера или уровня защиты [1. 12, 40, 41]. Первый, все еще недостаточно исследованный барьер врожденного иммунитета (innate immunity) на поверхности клетки обычно обеспечивает широкий спектр устойчивости. Преграду для вторжения патогена на внеклеточном интерфейсе растение-микроорганизм (в апопласте клетки) описывают как иммунитет, запускаемый общими элиситорами, которые называют молекулярными структурами микроорганизма или патогена (microbe- and pathogen-associated molecular patterns, MAMPs and PAMPs); реакция на эти элиситоры получила общее название иммунитета, вызванного молекулярными структурами патогена (pattern-triggered immunity, PTI). Рецепторы на поверхности клетки, узнающие PAMPs или MAMPs, представлены по преимуществу рецептор-подобными киназами (receptor-like kinases, RLKs) и рецептор-подобными белками (receptor-like proteins, RLPs). Далеко не все RLKs и RLPs служат рецепторами, некоторые являются ко-рецепторами, каркасными белками или другими участниками сигнальных путей [40, 42].

При вторжении патогена в апопласт в растениях накапливаются антимикробные соединения, примером которых являются белки, связанные с патогенезом (pathogenesis-related, PR). Большинство PR генов индуцируются сигнальными соединениями: так, салициловая и жасмоновая кислоты или этилен экспрессируются волнами на протяжении процесса колонизации растения; помимо устойчивости к патогенам, PR белки служат специфичными маркерами системной приобретенной устойчивости, индуцированной патогеном [20, 43]. В свою очередь, P. infestans секретирует ферменты, которые могут подавлять такую защиту растений; к их числу относятся протеазы и ферменты, разрушающие клеточные стенки растения: пектатлиазы, полигалактуроназы, ксиланазы и т.д.

Полигенную и частичную устойчивость к фитофторозу, возникающую вследствие PTI, не адаптированного по отношению к определенному растению-хозяину, также называют полевой, количественной и расонеспецифичной устойчивостью. Она не является долговременной [9, 10, 14]. Более перспективными для создания долговременной устойчивости на основе PTI представляются гены-кандидаты, выявляемые методами ассоциативных генетических исследований, полногеномных ассоциативных исследований и сравнительного анализа транскриптов (transcript profiling). Эти гены кодируют ключевые ферменты синтеза гормонов растений, которые участвуют в защитном сигналинге: аллен-оксид синтазу и липооксигеназы из жасмонатного сигнального пути, 3‑окси-3-метилглутарил-коэнзим А редуктазу из мевалонатного пути и цитохром P450, участвующий в биосинтезе терпенов, а также анионную пероксидазу, участвующую в процессе суберинизации клеточной стенки [44, 45].

Иммунитет, индуцированный эффекторами (Effector-triggered immunity). В отличие от неадаптированного апопластного иммунитета, адаптированные к определенному хозяину (host-adapted) патогены секретируют в клетки растений многочисленные эффекторы, которые кодируются генами вирулентности и доставляются в клетки растения-хозяина с помощью специфичных структур и механизмов [22, 24, 46, 47]. Патогенезу, в котором участвуют эффекторы, у растений противостоит второй, цитоплазматический барьер, где эффекторы опознаются внутриклеточными RLKs. Этот процесс иммунитета, запускаемого эффекторами (effector-triggered immunity, ETI), специфично различает расы патогена. PTI и ETI активируют сложную сеть передачи сигналов, которая включает каскады митоген-активируемых киназ и/или химический сигналинг при участии гормонов растений, а также регуляцию на уровне транскрипции: все эти сигналы приводят к таким физиологическим изменениям в растении, как HR, образование активных форм кислорода и упрочнение клеточной стенки [12, 21, 23, 40, 43, 48]. В обновленной модели взаимодействия растения с патогеном интегрированы три уровня: распознавание, интеграция сигналов и реализация защитной реакции [22]. Сегодня этот континуум взаимодействия растения с патогеном стал горячей точкой молекулярной фитопатологии.

Когда-то новаторская парадигма “ген-на-ген” [49] предполагала, что устойчивость растения наблюдается, когда доминантный ген устойчивости растения встречает доминантный Avr ген патогена. Биохимической версией этой концепции является модель рецептор-лиганд, в соответствии с которой растения используют для защиты белки, распознающие продукты Avr генов патогена. Однако сегодня эту классическую модель считают сильно упрощенной, даже в случае моногенных взаимодействий ген-на-ген в цитоплазме растения. Во-первых, лишь в редких случаях засвидетельствованы прямые стерические взаимодействия белковых продуктов генов вирулентности и генов устойчивости, поэтому модель прямого взаимодействия по типу рецептор-лиганд дополнена моделями непрямого взаимодействия, например, “сторожа” (guard) и “ловушки” (decoy). Далее, наряду с моногенным взаимодействием, известно немало случаев, когда несколько генов или кластеры тесно сцепленных генов устойчивости распознают один единственный эффектор – и наоборот; кроме того, взаимодействия ген-на-ген для различных сочетаний патоген-растение в разной степени зависят от окружающей среды [23, 41, 48, 50]. Для описания эволюции и диверсификации генов устойчивости предложены две крайние концепции – “гонки вооружений” (Arms Race) и “окопной войны” (Trench Warfare), однако эволюция генов устойчивости, скорее всего, протекает в непрерывном пространстве взаимополезного (mutualistic) сожительства, которое часто использует механизмы и молекулярные компоненты защиты, описанные для обеих систем [12, 13, 46, 51, 52]. В наше время классические генетические исследования взаимодействия патогена с растением-хозяином дополняются молекулярными исследованиями участников этого взаимодействия и интегрируют существующие модели коэволюции и функции; такая интеграция поможет лучше понять быстрые изменения в агрессивности патогена и развитии болезни [5, 6, 20, 22, 24, 53, 54].

Среди многочисленных агентов ETI у Phytophthora лучше других исследованы RXLR эффекторы, продукты Avr генов этого патогена, и CC-NB-LRR рецепторы, продукты Rpi генов картофеля [11, 13, 16, 17, 25]; этим генам посвящены отдельные разделы обзора.

Phytophthora infestans: ЭВОЛЮЦИЯ ГЕНОМА И ГЕНОВ ВИРУЛЕНТНОСТИ

В основе нынешних представлений о геноме P. infestans лежат результаты секвенирования генома штамма T30-4 [55]. По своим размерам (240 млн п.н.) этот геном намного больше геномов других видов Phytophthora, прежде всего из-за изобилия ДНК повторов, составляющих около 74% генома P. infestans. Самым удивительным свойством этого генома, определяющим этиологию фитофтороза картофеля, является неравномерная плотность распределения генов. Участки, богатые “генами домашнего хозяйства” (housekeeping genes), чередуются с протяженными районами генома, в которых мало таких генов, но зато много повторов; эти участки содержат быстро эволюционирующие гены вредоносных (pathogenic) эффекторов. Примечательно, как столь необычное строение генома связано с поведением патогена. Быстро эволюционирующие гены эффекторов заключены в обширные и чрезвычайно динамичные участки генома, и такая локализация резко увеличивает частоту замен нуклеотидов, инсерций/делеций, перестроек и изменения копийности генов по сравнению с генами домашнего хозяйства. В результате эти участки хромосом оказываются уникальными нишами быстрой эволюционной диверсификации, которая определяет штамм-специфичный репертуар генов вирулентности [18, 53, 55, 56]. Haas и др. [55] постулировали, что такие динамические районы генома P. infestans определяют эволюционную пластичность генов эффекторов и создают столь характерную для эпидемии фитофтороза повышенную генетическую изменчивость, позволяющую патогену преодолеть устойчивость растения.

Эти представления получили дальнейшее развитие по мере того, как секвенирование других геномов P. infestans и особенно транскриптомов принесло многочисленные данные, согласующиеся с концепцией определяющего участия повторов в увеличении размеров генома P. infestans [57, 58]. Концепция двухчастного генома и двухскоростной (или даже многоскоростной) эволюции генома выявляет те особенности архитектуры генома, которые определяют быстрые динамические перестройки и генетическую диверсификацию участков, связанных с вирулентностью, и служат колыбелью адаптивной эволюции P. infestans [18, 59]. Такая ускоренная адаптация, обусловленная специфичной архитектурой генома, особенно важна в случае искусственного отбора патогенов в агроценозах [60].

В большинстве случаев адаптацию Phytophthora определяют дупликация генов, негомологичные рекомбинации и делеции в участках, богатых транспозонами и генами эффекторов. Однако существуют и другие механизмы регуляции: к их числу относятся значительные изменения копийности генов, избирательная потеря генов, а также точечные мутации, сдвиг рамки считывания, повреждения старт- и стоп-кодонов и изменения в характере экспрессии генов [53, 61]. Сюда следует прибавить и эпигенетическую регуляцию эволюции патогена [20, 62].

ОРУДИЯ ВИРУЛЕНТНОСТИ: Avr ГЕНЫ И ЭФФЕКТОРЫ P. infestans

Новые физиологические и молекулярные методы позволили идентифицировать многочисленные цитоплазматические Avr гены и их продукты, эффекторы, которые патоген образует, чтобы модулировать многослойный иммунитет растения-хозяина, а также мишени этих эффекторов в растительных клетках [16, 24, 25, 46, 55, 63–68].

Гены эффекторов P. infestans. Среди многочисленных генов эффекторов в полностью секвенированных геномах P. infestans преобладают два типа структур. RXLR эффекторы – это модульные белки, на N-конце которых находится консервативный мотив R–x–L–R (аргинин – любая аминокислота – лейцин – аргинин), за которым обычно следует короткий EER (глутаминовая кислота – глутаминовая кислота – аргинин) домен, необходимый для переноса эффектора в растительную клетку. Изучение консервативных последовательностей в модельном геноме штамма T30-4 предсказало существование 563 RXLR генов. Примерно половина из них обнаруживает клональную (lineage) специфичность, которая, главным образом, и определяет разнообразие эффекторов, обусловленное эволюцией патогена. Куда меньше известно о генах CRN (crinkling- and necrosis-inducing proteins) эффекторов, обладающих неожиданным многообразием и сложным строением. Как и RXLR эффекторы, CRN эффекторы – это модульные белки, определяющей структурой которых служит чрезвычайно консервативный N-концевой LFLAK домен из 50 аминокислот; напротив, их C-концевые участки более разнообразны [26, 55].

Наряду с индукцией HR при специфичном взаимодействии генов эффекторов с соответствующими Rpi генами растений Solanum, можно привести несколько примеров других проявлений RXLR Avr генов. AVR1 влияет на накопление эффекторов вблизи гаусторий [67]. Другие эффекторы, включая хорошо известные AVR-BLB2, AVR2 и AVR3a, нарушают Ca²⁺-сигналинг, связанный с защитой растения, повышают восприимчивость растения и подавляют смерть клеток [69–71]. Различные эффекторы атакуют параллельные участки в цепях передачи сигналов, приводящих к HR [72]. RXLR эффекторы самым разным образом локализованы в растительных клетках, и ко-экспрессия нескольких RXLR эффекторов, поражающих различные иммунные системы, способствует колонизации по сравнению с одиночными эффекторами [67].

Когда эффекторы попадают в дикорастущие или культурные растения Solanum, они специфично узнают соответствующие им (matching) рецепторные белки, кодируемые Rpi генами. Основанная на таком взаимодействии эффективная технология идентификации Avr и Rpi генов получила название эффекторомики. Для выявления соответствующих Rpi генов эффекторы транзиторно экспрессируются в листьях Solanum, и реакция клеточной смерти регистрируется невооруженным глазом. Чтобы убедиться в соответствии пар Rpi–Avr генов, гены-кандидаты ко-экспрессируют в листьях растений-тестеров, например, Nicotiana benthamiana Domin [15, 16, 65, 68].

Используемая ниже номенклатура Avr генов восходит к 11 Rpi генам, которые были обнаружены в генетическом материале S. demissum Lindl. и используются в стандартном Mastenbroek-Black наборе растений-дифференциаторов [73, 74] для различения штаммов (рас) P. infestans. Список эффекторов расширяется по мере обнаружения новых Rpi генов и их использования в опытах по эффекторомике [13, 16, 65]. Открытие, что многие AVR белки P. infestans принадлежат к классу RXLR эффекторов, позволило находить в генбанках новые гены эффекторов методами биоинформатики. К настоящему времени выявлены многочисленные мишени этих эффекторов, однако функции многих RXLR структур остаются неизвестными [13, 16, 22, 38, 47, 64, 67].

Генетический полиморфизм Avr генов. В полностью секвенированном геноме штамма T30-4 и других изолятов и штаммов P. infestans RXLR эффекторы были исследованы с помощью различных методов. Методы эффекторомики использовали, чтобы определить специфичную способность эффекторов вызывать клеточную смерть в листьях различных дикорастущих видов Solanum [65]. Эта работа существенно расширила круг известных Rpi генов и выявила значительное функциональное разнообразие уже известных RXLR Avr генов. Их структурное разнообразие возникает в результате дупликации Avr генов, их последующей рекомбинации и различной судьбы аллелей, отбираемых условиями окружающей среды, в первую очередь, самими инфицируемыми растениями [54].

Связь строения с функциональным полиморфизмом была впервые описана в случае гена Avr3a. Два аллеля этого гена кодируют белки AVR3aKI и AVR3aEM, которые различаются двумя аминокислотными остатками, непосредственно влияющими на реакцию растения-хозяина: первый из двух белков непосредственно активирует R3a киназу растения Solanum и вызывает иммунную реакцию, второй белок, вирулентный Avr3a обеспечивает вирулентность на протяжении биотрофной фазы патогенеза. Удаление C-концевого остатка тирозина у AVR3aKI не влияет на распознавание R3a, но лишает AVR3aKI способности подавлять смерть клеток, продлевая биотрофную фазу [75].

Популяционные исследования существенно расширили наши знания о разнообразии RXLR Avr генов. Клонирование и секвенирование полигенного семейства IpiO из изолятов P. infestans, собранных в Гватемале, Таиланде и США, выявили широкий спектр аллелей, различающихся по строению и копийности. Разнообразие IpiO генов коррелировало с агрессивностью патогена. Ген Rpi-blb1 картофеля опознавал эффектор IPI-O1, однако другой представитель того же семейства IPI-O4 избегал распознавания и угнетал HR, вызванную взаимодействием IPI-O1 с Rpi-blb1. Вызванное IPI-O4 подавление распознавания IPI-O1 определяет повышенную агрессивность патогена [76].

Другим примером значительного аллельного полиморфизма генов эффекторов служит семейство Avr-blb2. У штамма T30-4 P. infestans вариации отмечены у 24 из 279 исследованных нуклеотидных последовательностей, при этом из 14 полиморфных сайтов десять были локализованы в C-концевом домене эффектора. Аминокислотный остаток в положении 69 определял защитную реакцию, опосредованную геном Rpi-blb2: среди четырех вариантов белка AVR-BLB2, Phe-69 препятствует активации Rpi-blb2, и это говорит о том, что вирулентный аллель возник для того, чтобы избежать его узнавания геном устойчивости [64]. Изучение строения гена Avr-blb2 в глобальной метапопуляции P. infestans (352 изолята, собранных с 13 различных растений-хозяев в 23 странах) позволяет предположить, что Avr-blb2 появился вначале у вида-прародителя как единственная копия гена, а затем дивергировал по мере того, как клоны этой линии Phytophthora инфицировали растения Solanum во всем мире. Удивительно, что в популяциях P. infestans мы сегодня находим все варианты Avr-blb2: очевидно, патогену выгодно поддерживать дуплицированные и функционально различные версии гена Avr-blb2 [77].

Куда большие структурные различия между авирулентными и вирулентными формами были найдены у двух других Avr генов. Изучение последовательностей авирулентного AVR2 и вирулентного AVR2-like в серии линий и изолятов P. infestans обнаружило, что они различались 13 аминокислотными остатками, притом что полиморфизм внутри каждого класса не был столь значительным; некоторые изоляты были гомозиготными, а другие – гетерозиготными по гену Avr2 [78]. Еще сильнее – по 38 аминокислотным остаткам – различались авирулентный AVR1 и вирулентный AVR1-like эффекторы [79].

Анализ генома у изолятов P. infestans, собранных в 1100 случаях эпидемического проявления фитофтороза картофеля в Великобритании, выявил значительную гетерогенность репертуара RXLR эффекторов. В частности, наиболее агрессивный изолят 13_A2 содержал шесть новых Avr аллелей, включая вирулентный гомолог Avr2, которые отсутствовали у модельного штамма T30-4 [5]. Заметный аллельный полиморфизм гена Avr-vnt1 обнаружен в популяциях P. infestans в Европе и обеих Америках [80], а также в Европе при сравнении польских и норвежских популяций [81]. Среди 96 изолятов P. infestans, собранных в шести районах Китая, которые различались погодными условиями и агротехникой возделывания картофеля, значительный полиморфизм гена Avr3a позволил выделить 51 гаплотип, кодирующий 38 аминокислотных вариантов [82].

В последние годы для идентификации генов эффекторов начали использовать новую чрезвычайно эффективную технологию Pathogen target enrichment Sequencing (PenSeq); эта технология облегчает анализ аллельного разнообразия эффекторов, давая возможность провести эволюционный анализ генома и популяционные исследования патогена. PenSeq также позволяет выполнить широкомасштабные исследования изменчивости (присутствие/отсутствие гена) и полиморфизма последовательностей ключевых генов патогена, что является предварительным условием эффективного использования генов устойчивости растения-хозяина. Так, использование PenSeq для анализа нескольких линий P. infestans, включая 13_A2 и EC-1, позволило обнаружить 16 последовательностей RXLR эффекторов, отсутствовавших в геноме линии T30-4, который использовали при синтезе “наживок” (baits) для обогащения Avr генов при секвенировании. Сравнение шести различных изолятов выявило особенности профилей (присутствие/отсутствие генов) и аллельный полиморфизм ранее охарактеризованных Avr1, Avr2, Avr3a, Avr3b, Avr4, Avr-Smira2=Avr8, Avr-Smira1=Avr9, Avr10; Avr-vnt1, Avr-blb1 и Avr-blb2 генов. Кроме того, это PenSeq исследование расширило список Avr генов-кандидатов за пределы модельных последовательностей, использованных в качестве “наживок” для обогащения генов-мишеней; такое расширение списка генов было особенно заметным в случае комплексов генов, для которых характерен значительный аллельный полиморфизм [38]. Другим примером аллельной диверсификации Avr генов стало недавнее исследование S. americanum Mill., вида, который не является типичным растением-хозяином (non-host) P. infestans. У четырех изолятов P. infestans, авирулентных по отношению к растениям картофеля, несущим ген Rpi-amr1 (EU13_A2, EC1_A1, EU6_A1 и US23), исследовали 47 генов эффекторов с высокой скоростью экспрессии с помощью одномолекулярного секвенирования в реальном времени (single-molecule real-time sequencing, SMRT RenSeq) и PenSeq долгочитаемых (long-read) последовательностей и кДНК. Новый ген был идентифицирован как Avr-amr1 по HR, которую наблюдали при транзиторной ко-экспрессии с соответствующим геном Rpi-amr1 в растениях N. benthamiana. В геноме T30-4 вновь охарактеризованный локус Avr-amr1 расположен вблизи уже известных генов эффекторов Avr8 и Avr-Smira1 [83].

С точки зрения биологии популяций и эволюции P. infestans, PenSeq анализ Avr генов обладает важным преимуществом: в условиях положительного, или балансирующего отбора он позволяет напрямую исследовать генетическую изменчивость агентов вирулентности, выявляя причины генетических изменений и характер адаптивной эволюции лучше, чем при секвенировании всего генома. Транскриптомные профили генов RXLR эффекторов, исследованные в ходе развития болезни, показали, что экспрессия этих генов резко усиливается на раннем биотрофном этапе заражения картофеля. Эти профили легко соотнести с конкретными инструментами устойчивости растения, взаимодействующего с патогеном.

Если демографические исследования эффекторов позволяют судить о потенциальном арсенале P. infestans, то профиль экспрессии Avr генов, вероятно, говорит об их активном репертуаре. Уникальная способность линии 13_A2 поражать сорта картофеля оказалась результатом изменений в кодирующих последовательностях Avr генов и характере экспрессии этих генов. В опытах in planta для этой линии показаны характерные изменения индукции генов во времени. В отличие от штамма T30-4, у этого генотипа специфично экспрессировались 20 генов RXLR эффекторов, при этом наиболее активно экспрессируемые гены, в том числе Avr-blb1, Avr-blb2 и Avr-vnt1, сохраняли заметный уровень экспрессии в течение 2–3 дней после заражения, в полном согласии с кривой развития фитофтороза, и, вероятно, вносили важный вклад в нарастающую агрессивность линии 13_A2 [5].

Стратегию глубокого NGS транскриптомов, основанную на консервативности последовательностей генов RXLR эффекторов, использовали для сравнения пяти штаммов P. infestans из северо-западного и южного Китая и Европы, представляющих разные типы скрещивания, гаплотипы и патотипы; это исследование идентифицировало консервативные основные (core) гены RXLR эффекторов, определяющие вирулентность. Гены Avr2, Avr3a, Avr-blb1, Avr-vnt1 и Avr-Smira1 экспрессировались у всех исследованных штаммов, каждый из генов Avr3b, Avr4, Avr-blb2 и Avr-Smira2 экспрессировался у двух-четырех штаммов, а ген Avr1 – только у одного [58]. В доминирующем в Андах клоне EC-1 были найдены многочисленные вариации структуры и числа копий Avr генов. Некоторые из них были связаны с потерей гетерозиготности в митозе. Однако самыми примечательными оказались различия изолятов по скорости экспрессии многих Avr генов – при полном отсутствии различий в последовательности этих генов. В этом случае сайленсинг гена эффектора позволял избежать его распознавания Rpi генами [60].

Solanum: ГЕНЫ, РАСПОЗНАЮЩИЕ ПАТОГЕНЫ И ПРОТИВОСТОЯЩИЕ ИМ

Картирование признаков и предполагаемых генов устойчивости к фитофторозу. С начала 1990 гг. для картирования Rpi генов-кандидатов у культурных и дикорастущих видов Solanum методами неравновесного сцепления или ассоциативного анализа используется несколько видов ДНК маркеров: RFLP, Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP), Simple Sequence Repeats, – а позже Single Nucleotide Polymorphism (SNP) маркеры и diversity array technology. Наиболее надежны маркеры, последовательности которых расположены внутри последовательности гена или непосредственно примыкают к ее концам: в таких случаях рекомбинация между маркерным аллелем и признаком устойчивости встречается редко или вовсе не происходит даже после многочисленных скрещиваний. Такие основанные на ПЦР маркеры, как Sequence Characterized Amplified Region (SCAR) или Cleaved Amplified Polymorphic Sequences, позволили с высокой точностью картировать Rpi гены-кандидаты и локусы количественных признаков (Quantitative Trait Loci, QTLs) устойчивости к фитофторозу [17, 84–87]. Результаты полногеномного картирования и картирования высокого разрешения позволили создать различные наборы вырожденных праймеров, распознающих аналоги генов устойчивости (resistance gene analogues, RGAs) и их кластеры, и амплификация генома с этими праймерами в сочетании с AFLP анализом существенно расширила круг предполагаемых Rpi генов. Этот высокоразрешающий метод поиска и идентификации (tagging) новых аллелей, получивший название motif-directed profiling, был успешно использован для изучения новых геномов Solanum и полиморфизма индивидуальных геномов, а сочетание такого profiling с NGS обещает огромные преимущества в сравнении с технологией profiling, основанной на разделении фрагментов ДНК в геле [17, 30].

Чтобы синтезировать данные о картировании локусов полигенной устойчивости к фитофторозу, двадцать одна карта QTLs была совмещена с восемью опорными генетическими картами картофеля, полученными с помощью различных маркеров, в консенсусную карту, несущую 2141 маркер, и вся совокупность QTLs была представлена в виде мета-QTLs. Мета-QTLs устойчивости к фитофторозу были найдены на всех 12 хромосомах картофеля, и некоторые из этих локусов совпадали с положением уже известных Rpi генов [88]. Другие QTLs устойчивости к фитофторозу не совпадали с такими Rpi генами и RGAs; в этих локусах можно искать новые Rpi гены. Области QTLs, картированные стандартными методами, покрывают на физической карте участки длиной несколько млн. п.н. и содержат множество генов с различными функциями. Чтобы преодолеть это затруднение, секвенируют большие фрагменты геномов или целые геномы. Скрининг коллекций картофеля методами эффекторомики также расширяет круг Rpi генов на основе их функциональной активности [16, 17, 65, 66], однако эти данные часто трудно согласовать с результатами QTL анализа.

Обнаружение Rpi генов. Идентификация всего набора генов, определяющих устойчивость к P. infestans, – обязательное условие для понимания молекулярной природы различного течения болезни. За два последних десятилетий были найдены и клонированы более 20 Rpi генов дикорастущих видов Solanum. Секвенирование уже охарактеризованных Rpi генов показало, что все они принадлежат к CC-NB-LRR классу. Лучше других охарактеризованы ген R1 и его аналоги в кластере генов на хромосоме 5 S. demissum, ген R2 из S. demissum, его ортолог Rpi-blb3 из S. bulbocastanum Dun. и их ортологи из нескольких других видов в большом кластере на хромосоме 4, ген Rpi-blb2 из S. bulbocastanum на хромосоме 6, гены Rpi-blb1 и Rpi-bt1 из того же вида и Rpi-sto1=Rpi-plt1=Rpi-pta из S. stoloniferum Schlechtd. et Bché., S. polytrichon Rydb. и S. papita Rydb. на хромосоме 8, ген Rpi-vnt1 из S. venturii Hawkes et Hjerting и его ортологи из многочисленных южноамериканских видов Solanum на хромосоме 9 и гены R8 и R9a из S. demissum на той же хромосоме, ген Rpi-chc1 из S. chacoense Bitt. на хромосоме 10 и гены R3a и R3b из S. demissum на хромосоме 11 [10, 13, 14, 16, 17, 29, 37]. Последовательности еще нескольких идентифицированных Rpi генов-кандидатов пока не опубликованы. Сравнительное секвенирование отдельных Rpi генов и целых геномов клубненосных видов Solanum и за их пределами обнаружило функционально сходные формы Rpi генов и выявило обширный аллельный полиморфизм, который еще предстоит оценить селекционерам. В целом, клубненосные и неклубненосные виды Solanum, особенно виды из Южной Америки, открывают широчайшие возможности для эволюционных исследований Rpi генов и их использования в селекции картофеля [28, 29, 31, 89].

Анализ генома удвоенного моноплоида S. tuberosum группа Phureja клон DM [90] предсказал присутствие 361 CC-NB-LRR гена, расположенного на всех 12 хромосомах. Большинство этих генов физически организованы в кластеры, в основном гомогенные, что позволяет предполагать, что они сравнительно недавно дивергировали от общего предка. Примечательно, что в отличие от RXLR эффекторов, сосредоточенных в бедных другими генами участках генома P. infestans, CC-NB-LRR гены находятся в участках генома картофеля, ничем не выделяющихся по плотности генов или повторов [91]. К настоящему времени полные последовательности геномов получены и опубликованы еще для нескольких культурных видов картофеля: полиплоидных S. ×chaucha Juz. et Buk., S. curtilobum Juz. et Buk., S. juzepczukii Buk. и S. tuberosum subsp. andigena Hawkes и subsp. tuberosum L. [92], и двух дикорастущих видов: S. commersonii Dun. [93] и S. chacoense [94]. Эти последовательности помогают оценить разнообразие структур, соответствующих CC-NB-LRR Rpi генам и их гомологам, и изучить кластерную организацию Rpi генов.

Характерно сходство в организации уже известных кластеров Rpi генов в различных геномах Solanum. По всей видимости, некоторые линии Rpi генов появились еще до дивергенции клубнеобразующих видов Solanum; далее, вслед за эволюцией геномов, которая определила нынешний ландшафт этих видов в двух Америках, начался независимый процесс адаптации различных Rpi генов к местным популяциям патогена [95]. Поражает случай контрастного распределения генов у дикорастущих видов картофеля: гены Rpi-blb1=Rpi-sto1 найдены только у мексиканских видов серий Bulbocastana и Longipedicellata, в то время как ген Rpi-vnt1 характерен для южноамериканских видов Tuberosa [16]. Удвоение всего генома, избирательная тандемная дупликация и удержание (retention) генов, равно как внутригенная и межгенная рекомбинация и конверсия CC-NB-LRR генов, описанные моделью эволюции генов устойчивости под названием “рождение-и-смерть”, наполняют резервуар генов картофеля чрезвычайно разнообразными структурами, которые служат материалом для естественного и искусственного диверсифицирующего отбора; дело селекционеров – выбрать из этого огромного резервуара линии независимых генов со специфичностью к различным патогенам [1, 50]. Кластеризация генов может расширять полиморфизм их последовательностей благодаря внутри- и межгенной мейотической рекомбинации, приводя к появлению структур с новой специфичностью [13]. В качестве примера можно указать на эволюцию почти полностью идентичных структур у картофеля, в результате которой возникли два CC-NB-LRR гена устойчивости к столь различным болезням, как поражение цистообразующей нематодой Globodera pallida и Potato virus X [96].

Такие новые технологии секвенирования, как NGS, генерируют данные со скоростью, на несколько порядков величины превосходящей ту, что достигали традиционные технологии предшествующего периода. Технология RenSeq (Resistance gene enrichment Sequencing) включает конструирование “наживок” на основе последовательностей известных семейств NB-LRR генов и секвенирование обогащенных таким образом образцов NB-LRR RGAs [34]. Выделение интересующих исследователя семейств генов позволяет изучить специфические компоненты генома. Благодаря существенному уменьшению размеров и упрощению состава анализируемых фрагментов генома еще до сравнительного секвенирования, этот метод значительно облегчает обнаружение Rpi генов и их высококачественную аннотацию. В случае генома клона DM S. tuberosum метод RenSeq выявил почти вдвое больше NB-LRR генов, чем полное секвенирование генома [90]. Эта технология позволила также быстро отобрать SNP маркеры, косегрегирующие с локусами устойчивости к P. infestans у нескольких видов Solanum, и с помощью этих маркеров выявить Rpi гены-кандидаты в еще не охарактеризованных геномах Solanum. Важным подспорьем в применении новых методов стало развитие высокоразрешающих биоинформатических методов обнаружения и исследования полиморфизма генов.

Однако возникает вопрос, какая доля CC-NB-LRR Rpi генов-кандидатов, обнаруженных при полном секвенировании генома или RenSeq методом, участвует в устойчивости к фитофторозу. Стабильная трансформация восприимчивых к фитофторозу сортов картофеля в устойчивые с помощью предполагаемых Rpi генов является надежным, но чрезвычайно дорогим и трудоемким доказательством их функциональности. Более доступными методами валидации Rpi генов являются эффекторомика, основанная на транзиентной трансформации растений [66], мета-QTL анализ [88], маркерный анализ и транскриптомный анализ растений картофеля, инфицированных P. infestans.

NGS технологии [15, 17, 34, 35, 37] резко ускорили картирование высокого разрешения и обнаружение новых генов и открыли новые возможности для сравнительных исследований геномов (генотипирование путем секвенирования, полногеномное секвенирование, баркодинг и т.д.) и транскриптомов (RenSeq, Candidate gene-Sequencing, Bulked segregant RNA-Seq, QTL-Seq, dRenSeq и др.). Дальнейшим развитием серийного анализа экспрессии генов (serial analysis of gene expression, SAGE) стал DeepSAGE метод транскриптомного анализа; при изучении взаимодействия растения-хозяина с патогеном этот метод обнаруживает новые гены-кандидаты. При изучении этим методом совместимых и несовместимых взаимодействий растения и патогена по ходу развития болезни транскрипция полигенных семейств, как правило, отвечающих за PTI защитные реакции, сильнее изменялась у восприимчивых растений [97]. Использование другой разновидности SAGE технологии, SuperSage, дало много новой информации о специфичном усилении или ослаблении транскрипции отдельных генов, включая гены устойчивости к фитофторозу, при вторжении патогена [33]. При сравнении транскриптомов устойчивых и восприимчивых генотипов картофеля методом RNA-Seq, у устойчивого сорта Sarpo Mira экспрессировалось приблизительно на четверть больше предполагаемых генов устойчивости, чем у восприимчивого сорта Desiree, однако ни один из обнаруженных генов не принадлежал к уже известным Rpi генам [98].

При дальнейшем усовершенствовании RenSeq технологии специфичные “наживки”, сконструированные для захвата и секвенирования фрагментов ДНК, были укорочены до размеров, соответствующих средней длине Rpi гена-кандидата, и для клонирования индивидуальных Rpi генов использовали SMRT RenSeq метод. Это позволяет собрать de novo Rpi гены, их регуляторные элементы и сложные локусы, даже работая с недостаточно охарактеризованным генетическим материалом, и быстро клонировать многочисленные новые Rpi гены [15, 35].

Расширение круга “наживок” для захвата генов-кандидатов привело к созданию еще одного мощного и экономически эффективного приложения RenSeq технологии как диагностического инструмента (dRenSeq). Метод определяет уже известные Rpi гены, надежно их идентифицирует, а также позволяет валидировать полные последовательности уже известных функциональных Rpi генов в генетических коллекциях и селекционных программах. В зависимости от условий гибридизации (stringency conditions, mismatch rates) при захвате Rpi генов и RGAs, метод dRenSeq позволяет также выявить ранее неизвестные полиморфизмы, перспективные для поиска новых Rpi генов и новых аллелей уже охарактеризованных Rpi генов у таких недостаточно охарактеризованных видов, как S. americanum, S. andigena, S. pinnatisectum Dun. и S. verrucosum Schlechtd. [37, 38, 57, 99, 100]. В случае S. andigena этот метод успешно различил усиление и ослабление транскрипции отдельных генов: при совместимом взаимодействии гены восприимчивости индуцировались сильнее, чем при несовместимом взаимодействии. Чтобы связать устойчивость образца S. andigena 03112-233 к P. infestans с известными или вновь обнаруженными генами устойчивости, для dRenSeq анализа использовали 21 известный функциональный Rpi ген. Ни один из них не удалось выявить при этом анализе, так что, по всей видимости, за устойчивостью этого образца к P. infestans стоит неизвестный ген [57].

ВМЕСТО ЗАКЛЮЧЕНИЯ: ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ НОВЫХ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ФИТОФТОРОЗА

Сегодня мы стали свидетелями успешного использования результатов генетических и геномных исследований картофеля в селекции картофеля. Экспериментальные данные, полученные благодаря новейшим молекулярным технологиям, и возникшие на их основе новые представления о вредоносности патогена и устойчивости растения оказывают заметное воздействие на селекцию картофеля на долговременную устойчивость к фитофторозу и способствуют развитию интегрированных методов борьбы с этой болезнью.

ГМ растения-дифференциаторы. Вот уже почти сто лет для различения патотипов (рас) P. infestans широко используют HR реакцию Mastenbroeck-Black растений-дифференциаторов [73, 74]. Исходно предполагали, что эти сорта картофеля содержат по одному Rpi гену, перенесенному из S. demissum [9]; однако некоторые из этих “моногенных” растений в действительности содержат более одного Rpi, что препятствует правильному диагнозу [101]. Кроме того, существующие наборы растений-дифференциаторов не содержат генов, которые в настоящее время наиболее успешно используются в селекции на долговременную устойчивость: Rpi-blb1, Rpi-sto1, Rpi-blb2, Rpi-vnt1 и др. [8]. Радикальным выходом из создавшегося положения стала трансформация растений картофеля сорта Desiree каждым из десяти Rpi генов [101]. Такие по-настоящему моногенные растения-дифференциаторы обеспечивают более точное генотипирование изолятов P. infestans, однако их применение наталкивается на ограничения, вызванные их ГМ происхождением.

Эффекторомика. Прямое изучение Avr генов, непосредственно определяющих вредоносность популяций P. infestans, открыло новые перспективы для мониторинга популяций патогена, отслеживания его перемещений в агроценозах и раннего предупреждения о появлении новых и, возможно, более агрессивных патотипов. Среди наиболее многообещающих диагностических приложений наших знаний об Avr генах следует назвать эффекторомику – легкодоступный чувствительный и производительный метод анализа аллельного разнообразия Avr генов, поиска новых Rpi генов путем скрининга генетических коллекций и определения функций вновь обнаруженных генов в связи с селекцией на долговременную устойчивость к фитофторозу [66, 102]. Эффекторомика дает уникальные сведения о составе Avr генов, которые могут стать частью интегрированной системы защиты картофеля, помогая, к примеру, планировать состав генов устойчивости путем сортосмены или схему применения фунгицидов [103].

Прямое определение репертуара Avr генов и использование арсенала эффекторов. Новые знания об эволюции и диверсификации Avr генов патогена позволяют разработать более сложные системы использования Rpi генов, которые сближают агроценозы с популяциями дикорастущих растений, где лишь изредка наблюдаются эпидемии [32]. Если эффекторомика различает гены авирулентных эффекторов по их функции, то все новые и новые успехи технологий секвенирования генома позволяют рано обнаружить новые структуры Avr генов и таким образом сигнализировать о появлении новых патотипов. Репертуар Avr генов, выявленный методами геномики, позволяет следить за распространением патогена в агроценозах и способствует селекции на устойчивость к фитофторозу, идентифицируя гены вирулентности в популяциях патогена и гены устойчивости и восприимчивости к этому патогену в инфицированных посадках картофеля [68]. Технология PenSeq призвана ответить на многие вопросы биологии патогена и преодолеть ограничения современных фитопатологических исследований благодаря широким параллельным исследованиям последовательностей генов, включая массовое определение аллельного полиморфизма ключевых Avr генов P. infestans и их положения на карте генома и на карте территории [38]. PenSeq выявляет Avr гены, определяющие потенциал долговременной устойчивости картофеля, достигнутой при интрогрессии Rpi генов. Более того, эта технология позволяет ре-аннотировать гены-кандидаты эффекторов в геноме P. infestans, тем самым расширяя поле будущего применения Avr генов как инструмента селекции.

Поиски новых Rpi генов. За два последних десятилетия значительно увеличилось число охарактеризованных последовательностей генома культурных и дикорастущих форм, принадлежащих к разным видам картофеля и регионам их произрастания. При всем недостатке знаний о генетическом разнообразии картофеля на уровне полных геномов, в предшествующий NGS период различные методы поиска новых аллелей смогли предложить селекционерам много перспективных Rpi генов [10, 13, 14, 17]. В эпоху NGS методы геномики позволяют по-новому и глубже взглянуть на разнообразие геномов в генетических коллекциях, выявить в истории культурного картофеля эволюционные процессы интрогрессии и гибридизации и идентифицировать гены, которые стали точкой приложения процессов одомашнивания, а затем и селекции [28, 31]. Новую dRenSeq технологию с успехом использовали для изучения аллельного полиморфизма Rpi генов и их аналогов, обнаружения Rpi генов в лучших сортах картофеля и идентификации новых аллелей этих генов у дикорастущих видов Solanum [37, 57, 99, 100, 104].

Использование Rpi генов для создания долговременной устойчивости к широкому спектру рас P.  infestans. В полиплоидных геномах растений дикорастущих видов Solanum обычно поддерживается разнообразие многочисленных аллельных вариантов Rpi генов. Расширение наших знаний о полиморфизме и эволюции Rpi генов помогает выстроить стратегии пирамидирования Rpi генов, которые во многом сходны с процессами эволюции в популяциях дикорастущих форм, где редко происходят эпидемии. По мере увеличения разнообразия Rpi генов, сорта и гибриды картофеля постепенно достигают все более высокой устойчивости к болезни.

В природных экосистемах, примером которых служит долина Толука в Мексике [105], в результате совместной эволюции растений картофеля и P. infestans возникают популяции растений и микроорганизмов, в которых лишь изредка происходят эпифитотии. Напротив, в агроценозах, особенно при стремительном вторжении новых особо вирулентных штаммов патогена, эпидемии фитофтороза приводят к значительным потерям урожая [5, 6]. Одной из эффективных стратегий борьбы с фитофторозом является селекция на высокую и долговременную устойчивость, основанная на пирамидировании Rpi генов, распознающих различные Avr гены. Доступным источником такого генетического материала служат дикорастущие виды картофеля. Методами скрещивания или генетической инженерии многочисленные Rpi гены этих видов можно интрогрессировать в те сорта картофеля, которых требует рынок.

Подобная пирамида генов останется эффективной, пока растение содержит хотя бы один Rpi компонент, способный опознать соответствующий ему Avr ген патогена и запустить защитную реакцию. В основе пирамидирования (сборки) нескольких генов устойчивости в одном сорте с целью сделать его устойчивость долговременной лежит принцип, в соответствии с которым вероятность мутации сразу нескольких Avr генов из авирулентных в вирулентные низка и снижается с увеличением числа генов устойчивости в пирамиде. Теоретически, пирамида из четырех генов устойчивости устоит перед вторжением патогена – при условии, что эта пирамида и популяция патогена-колонизатора соответствуют нескольким критериям. Во-первых, собранные в пирамиду гены устойчивости должны проявляться полностью, чтобы исключить ситуацию, когда штамм патогена, несущий характерный Avr аллель, сможет инфицировать и колонизовать растение, несмотря на присутствие в нем соответствующего (matching) гена устойчивости. Во-вторых, не все гены устойчивости одинаково важны для устойчивости пирамиды; лучшие гены и их сочетания – это те, с которыми еще не сталкивалась инфицирующая популяция патогена. В-третьих, важна низкая частота рекомбинации генома патогена, поскольку при рекомбинации, когда, к примеру, в популяции P. infestans присутствуют два типа спаривания, частота независимых мутаций генов вирулентности окажется много выше, чем в исходно бесполых популяциях. В-четвертых, устойчивость будет долговременной при незначительной скорости распространения новых патотипов в полевых популяциях патогена [1, 32, 106].

В случае картофеля наиболее очевидным способом достигнуть долговременной устойчивости к P. infestans является вовлечение в селекцию новых Rpi генов и сосредоточение в одном сорте как можно большего числа этих генов. В два последних десятилетия такое пирамидирование опиралось на идентификацию и клонирование перспективных Rpi генов, в первую очередь, из разнообразных дикорастущих видов Solanum; особенный интерес представляют недостаточно изученные южноамериканские виды картофеля, которые ранее не вовлекались в практическую селекцию [28, 31, 36, 107, 108]. В создании селекционных источников долговременной устойчивости важную роль играют многие описанные выше “омик” технологии быстрой идентификации, клонирования и характеристики Rpi и Avr генов. При обогащении селекционных источников новым генетическим материалом путем идентификации и интрогрессии новых Rpi генов и новых аллелей уже охарактеризованных Rpi генов важно тщательно изучать уже существующие пулы Rpi генов, чтобы не включать в пирамиды те используемые селекционерами гены, которые уже преодолены местными штаммами патогена [9, 27–29, 31, 87, 108].

Внимание многих селекционеров сосредоточено на создании сортов картофеля с долговременной устойчивостью к фитофторозу методами генетической инженерии. Зарегистрированные в настоящее время сорта несут пирамиды, содержащие до трех Rpi генов широкой расовой специфичности, например, Rpi-sto1:Rpi-vnt1.1:Rpi-blb3 или Rpi-blb1:Rpi-blb2:Rpi-vnt1.1. Хотя порознь эти гены иногда преодолеваются некоторыми изолятами P. infestans, вместе они обеспечивают долговременную устойчивость [109]. В сравнении с половой или соматической гибридизацией, важным преимуществом ГМ стратегий является то, что при этом не переносятся нежелательные сцепленные гены (linkage drag). Однако генетическая инженерия сельскохозяйственных растений – это дорогостоящий процесс; вдобавок, к ней отрицательно относятся многие потребители, и использование ГМ сортов ограничено законодательством многих стран, особенно в Европе [13, 110]. Чтобы преодолеть законодательные ограничения на использование трансгенных растений, голландские генетики и селекционеры предложили концепцию цисгенеза; в этом случае с помощью генно-инженерных методов Rpi гены переносятся только из тех дикорастущих видов Solanum, которые можно скрещивать с сортами картофеля [8, 27, 111, 112].

Традиционное пирамидирование Rpi генов, основанное на гибридизации, включает многочисленные этапы скрещивания и отбора потомства [9] и поэтому оказывается чрезвычайно медленным и трудоемким процессом, даже при эффективном использовании молекулярных маркеров. Однако пока этим методом удается сосредоточить в одном растении больше Rpi генов, чем с помощью сегодняшних ГМ технологий. В качестве примера можно указать на многочисленные сложные (multiparental) гибриды, созданные отечественными генетиками и селекционерами путем отдаленного скрещивания с использованием десятка дикорастущих видов Solanum; эти гибриды несут SCAR маркеры до пяти Rpi генов на генотип. Клональные линии, полученные на основе этих гибридов, вот уже много лет отличает высокая устойчивость к фитофторозу, и они являются перспективными селекционными донорами таких генов широкого спектра устойчивости, как Rpi-blb1=Rpi-sto1, Rpi-blb2, Rpi-vnt1, R2=Rpi-blb3 и др. [113]. Важным преимуществом таких линий является сохранение генетического окружения расоспецифичных Rpi генов, интрогрессированных из родительских форм, включая гены расонеспецифичной устойчивости [84]. Вместо одиночных генов при отдаленных скрещиваниях переносятся целые кластеры генов, что повышает устойчивость растений сразу к нескольким болезням. Эти свойства сложных гибридов – залог стабильности будущих сортов картофеля, которые будут препятствовать распространению в посадках картофеля более адаптированных штаммов патогена [107, 113]. Однако при столкновении с большими популяциями P. infestans со смешанным A1 и A2 типом спаривания и заметным перемещением Avr генов вследствие миграции патогена одним только пирамидированием Rpi генов нельзя добиться долговременной устойчивости. Для ее поддержания важна такая организация защиты растений, которая снижает эффективный размер популяции патогена, например, севооборот и применение фунгицидов [106].

Автор признателен Вл.В. Кузнецову и Е.В. Рогозиной за конструктивные замечания и предложения.

Работа поддержана Государственным заданием 0574-2019-0001.

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов исследований.