Физиология растений, 2022, T. 69, № 1, стр. 80-87

ВВЕДЕНИЕ

Пероксидаза (ПО) является ключевым ферментом окислительно˗восстановительного метаболизма, вовлеченным как в генерацию, так и в утилизацию активных форм кислорода (АФК) [1, 2]. Известно, что ПО обладает широкой субстратной специфичностью к разнообразным по химическому строению субстратам. Наряду с перекисью водорода, фенольными соединениями и токсичными соединениями ароматической природы, субстратами ПО являются соединения азота различной степени окисленности – нитраты и нитриты [3–5]. В растениях одним из ключевых процессов азотного метаболизма является восстановление нитратов, происходящее как в листьях, так и в корнях с участием ферментов нитратредуктазы и нитритредуктазы [6]. Наряду с этим, в метаболизм азотных соединений могут быть также вовлечены и оксидоредуктазы, в частности, пероксидазы [7]. Взаимодействие ПО с азотными соединениями может сопровождаться образованием заряженных побочных продуктов, обладающих неспаренным электроном, а поэтому являющихся реакционно˗активными. Потенциально это взаимодействие может сопровождаться образованием активных форм азота (АФА), таких как радикал диоксида азота NO₂, три- и тетрооксиды диазота N₂O₃, N₂O₄, монооксид азота NO, пероксинитрит ONOO^–, S˗нитрозоглутатион GSNO, S˗нитрозотиол SNO [7, 8]. Известно, что АФА играют важную роль в передаче сигнала в растениях и регулируют широкий спектр физиологических и биохимических реакций [9, 10]. В частности, NO принимает участие в регуляции клеточного цикла растительной клетки, процессов дифференциации и морфогенеза растений. Он вовлечен в трансдукцию сигналов, стимулирующих синтез фитогормонов [11]. К настоящему времени накоплены данные об участии NO в ответных реакциях растений на действие стрессоров [11, 12]. Кроме того, АФА окисляют и нитрируют нуклеиновые кислоты, белки и липиды [9].

До настоящего времени роль ПО в метаболизме азотных соединений слабо изучена. В клетках животных показано, что некоторые ПО участвуют в образовании АФА [8], кроме того, некоторые ПО животного и растительного происхождения могут использовать NO в качестве субстрата [13, 14]. Вовлечение отдельных изоформ ПО, изолированных из сельскохозяйственных растений, в том числе злаковых, в метаболизм азотных соединений не было показано. Именно сельскохозяйственные растения подвергаются значительному стрессу при внесении высоких доз азотных удобрений, что ведет к накоплению азотистых соединений и продуктов их метаболизма в растениях и, в конечном итоге, в организме животных и человека, потребляющих эти растения с пищей. В работе Huang с соавт. [15] показано, что коммерческий препарат ПО хрена катализирует образование NO из гидроксимочевины в присутствии Н₂О₂. Кроме того, трансгенные растения табака со сверхэкспрессией гена пероксидазы swpa4 обладали повышенным уровнем NO [16]. В работе Sakihama с соавт. [5] продемонстрировано нитрование растительных фенолов с использованием коммерческого препарата ПО хрена. Реакция нитрования фенолов ПО хрена была подробно изучена в работе Kong с соавт. [17], проанализированы кинетические характеристики и предложен пинг˗понг механизм двухсубстратной ферментативной реакции (механизм двойного замещения). Эти данные свидетельствуют о сложном характере взаимодействия растительных ПО, азотсодержащих соединений и фенольных субстратов ПО с образованием биологически˗активных интермедиатов. В связи с этим, целью настоящего исследования была идентификация продуктов взаимодействия экстраклеточных ПО корней пшеницы с фенолами в присутствии азотных соединений. Для достижения этой цели в задачи исследования входили: 1) определение промежуточного продукта радикальной природы, образующегося в результате совместного ПО-опосредованного окисления фенолов и нитритов; 2) идентификация конечного продукта этой реакции.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект. Объектом исследования служили проростки яровой пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Казанская юбилейная, выращенные на растворе 0.25 мM СаСl₂ при 23°С, 12-часовом светопериоде и плотности потока энергии 100 Вт/м². Корни 5-дневных проростков немедленно после отсечения от проростков инфильтрировали Трис-HCl буфером (50 мМ рН 7.4) под давлением 80 кПа в течение 30 с. Буфер после инфильтрации (экстраклеточный раствор, ЭКР) использовали для выделения белков. Цитоплазматическое загрязнение ЭКР определяли по активности маркерного цитоплазматического белка глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.49) [18]. Содержание белка измеряли методом Брэдфорд [19].

Очистка белков. Экстраклеточные белки осаждали (NH₄)₂SO₄ (30–80%) и центрифугировали при 23 500 g в течение 20 мин. Образовавшийся осадок ресуспендировали в Трис˗HCl буфере (50 мМ рН 7.4) и диализовали против Трис-НСl буфера (25 мМ рН 9.0) в течение ночи при 4°С.

Ионообменную хроматографию проводили на колонке (1.5 × 13 см) с ДЭАЭ˗сефадексом А-50, уравновешенную Трис-НСl буфером (25 мМ рН 9.0). Связавшиеся белки элюировали в линейном градиенте концентрации NaCl (0−0.6 М) в том же буфере со скоростью 0.4 мл/мин. Объем фракций составлял 1 мл. Анализ гомогенности изоформ пероксидаз в каждой хроматографической фракции проводили методом электрофореза в неденатурирующих условиях, без добавления Na-ДДС и меркаптэтанола, в 12% ПААГ с последующим окрашиванием бензидином для визуализации пероксидазной активности (см. ниже). Молекулярную массу белков определяли с помощью маркеров молекулярной массы широкого диапазона (Bio-Rad, США) и окрашиванием гелей Кумасси G250. Для дальнейшего анализа образцы концентрировали методом ультрафильтрации на мембране Ultracel-10K (Merck Millipore, США).

Изоэлектрофокусирование белков проводили в ПААГ с использованием амфолинов рН 3.5−10 (LKB, Швеция). Для определения изоэлектрической точки белков использовали набор стандартов IEF-M1A (3.6−9.3) (Sigma, США).

Активность изоферментов пероксидазы в геле выявляли с помощью окрашивания 0.05 М раствором бензидина с 30 мМ Н₂О₂ в ацетатном буфере (0.2 мМ, рН 5.2).

Определение активности ферментов. Активность ПО (КФ 1.11.1.7.) измеряли спектрофотометрически (Perkin Elmer, США) с использованием бензидина в качестве субстрата (ε₅₉₀ = 34 мМ^–1 · см^–1). Реакционная смесь общим объемом 3 мл состояла из ацетатного буфера (100 мМ, рН 5.3), 1 мМ Н₂О₂, 1 мМ бензидина и 0.5 мл образца. Определение активности пероксидаз по окислению р-кумаровой кислоты (ε₂₈₅ = 17.787 мМ^–1 ⋅ см^–1) проводили в следующих условиях: К˗фосфатный буфер (35 мМ, рН 7.4), 0.1 мМ р-кумаровая кислота, 1 мМ Н₂О₂ и 0.05 мл образца, общий объем реакционной смеси составлял 0.5 мл. Нитратредуктазную активность ПО измеряли по скорости накопления продукта ферментативной реакции – нитрита [20]. Реакционная смесь общим объемом 0.5 мл состояла из 30 мМ Na-фосфатного буфера рН 8.0, 100 мМ KNO₃, 0.64 мМ K₂S₂O₅, 0.64 мМ диэтилдитиокарбамата натрия и 0.05 мл образца. Смесь инкубировали 20 мин при комнатной температуре, реакцию останавливали добавлением 0.05 мл ледяной уксусной кислоты, затем приливали 0.55 мл реактива Грисса и выдерживали в течение 20 мин. Количество образовавшегося продукта измеряли спектрофотометрически при 527 нм (Perkin Elmer, США).

В экспериментах по анализу ингибирования ферментативных реакций ингибиторы добавляли в инкубационную смесь перед добавлением фермента.

Определение феноксильного радикала. Детектирование феноксильного радикала осуществляли методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) [21]. Реакционная смесь состояла из Трис-HCl буфера (20 мМ, рН 7.4), 1 мМ хлорогеновой кислоты, 5 мМ Н₂О₂ и 0.05 мл очищенного фермента. Эксперименты проводили в присутствии или в отсутствие 5 мМ KNO₂. Для улавливания короткоживущих первичных радикалов добавляли 0.1 мл 1 M ZnSO₄ [22]. Спектры ЭПР приготовленных образцов регистрировали на спектрометре Х‑диапазона EMX (Bruker, Германия) при комнатной температуре.

Идентификация нитрофенола. Анализ реакции нитрования p-кумаровой кислоты пероксидазами проводился по модифицированному протоколу Sakihama с сотр. [5]. Реакционная среда состояла из К-фосфатного буфера (25 мМ, рН 7.4), 10 мМ KNO₂, 0.2 мМ p-кумаровой кислоты, 1 мМ Н₂О₂ и 0.05 мл очищенного фермента. Контроль образования 4‑гидрокси-3-нитрокоричной кислоты проводился спектрофотометрически (Perkin Elmer, США) по увеличению оптической плотности при 440 нм.

Идентификация продукта нитрования p-кумаровой кислоты пероксидазами проводилась с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ, Gilson, США). Реакционную смесь (К-фосфатный буфер (20 мМ, рН 7.4), 100 мМ KNO₂, 2 мМ p-кумаровая кислота, 10 мМ Н₂О₂) инкубировали с 0.1 мл очищенного фермента в течение 60 мин и центрифугировали при 5000 g в течение 5 мин. Полученный супернатант подвергали хроматографическому разделению с использованием колонки с обращенной фазой C˗18 (Ultrasphere ODS, 4.6 × 250 мм, Beckman, CША). Связавшееся вещество элюировали K-фосфатным буфером (50 мM, рН 7.0). Скорость элюирования составляла 0.5 мл/мин, объем вводимой пробы − 100 мкл. Выход веществ контролировали по поглощению при 314 и 440 нм с помощью диодно˗матричного детектора (Shimadzu SPD-M20A, Япония). Хроматографический профиль продукта сравнивали с профилем стандарта. Стандарт 4-гидрокси-3-нитрокоричная кислота был синтезирован в виде желтых игольчатых кристаллов из 4-гидрокси-3-нитробензальдегида и малоновой (пропандионовой) кислоты по протоколу Freund [23]. Подтверждение структуры стандарта осуществляли методом ¹H-ЯМР (CD₃OD, 600 МГц, Bruker, Германия).

Опыты проводили в трех˗пяти биологических повторностях, каждый вариант имел 3˗кратную аналитическую повторность. Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Мicrosoft Office Excel 2010. В таблицах приведены средние значения и их стандартные ошибки.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В ЭКР корней пшеницы были обнаружены белки, обладающие пероксидазной (16.9 ммоль/мин на мг белка) и нитратвосстанавливающей (3.3 ммоль/мин на мг белка) активностями. Наличие лишь следовых количеств цитоплазматического загрязнения (<0.99%) говорит о присутствии в растворе лишь апопластных белков. Изоферментный спектр апопластных пероксидаз пшеницы был представлен пятью анионными и катионными изоформами с молекулярными массами от 31 до 72 кДа (рис. 1) и изоэлектрическими точками от 3.6 до 7.9 (данные не представлены). Частичная очистка с помощью осаждения (NH₄)₂SO₄ (30–80%) и ионно˗обменной хроматографии выявила наличие двух основных изоформ ПО – ПО1 с молекулярной массой 31 кДа и pI 3.6 и ПО2 с молекулярной массой 65 кДа и pI 6.9 (рис. 1). Было обнаружено, что нейтральная изоформа ПО2 проявляла более высокую пероксидазную активность по окислению бензидина (в 19 раз) и естественного субстрата – р-кумаровой кислоты (в 24 раза), а также нитратвосстанавливающую активность (в 7 раз) по сравнению с ПО1 (табл. 1). И пероксидазная, и нитратвосстанавливающая активности ПО1 и ПО2 ингибировались NaN₃ и KCN. Азид более эффективно подавлял нитратвосстанавливающую активность ПО1 и ПО2, чем пероксидазную активность (табл. 2). Цианид эффективно ингибировал обе ферментативные реакции, причем в большей степени у ПО2, чем у ПО1.

Рис. 1.

Изоферментный спектр экстраклеточных ПО пшеницы:1 – неочищенный экстракт, 2 – частично очищенная ПО1, 3 – частично очищенная ПО2.

Окисление фенольных субстратов ПО сопровождается образованием ряда промежуточных продуктов, в том числе феноксильных радикалов. Образование первичных и вторичных феноксильных радикалов с характерными спектрами ЭПР было выявлено при окислении частично очищенной ПО2 пшеницы естественного фенольного субстрата – хлорогеновой кислоты (рис. 2а). Аналогичные результаты были показаны с ПО1 (данные не представлены). Через несколько минут после начала реакции спектр ЭПР менялся, первичные радикалы преобразовывались во вторичные (рис. 2б). Динамика накопления вторичных радикалов в присутствии ПО свидетельствует о постепенном их накоплении, в то время как при добавлении нитрита образование вторичных радикалов происходило мгновенно (рис. 2в). В отсутствие Н₂О₂ образования радикалов не происходило (данные не представлены).

Рис. 2.

Образование феноксильных радикалов при окислении хлорогеновой кислоты ПО2. (а) – при окислении хлорогеновой кислоты ПО2 без KNO₂, (б) – динамика накопления вторичных радикалов без KNO₂, (в) – при окислении хлорогеновой кислоты ПО2 при добавлении 5 мМ KNO₂. 1 – первичный радикал (g = 2.0044), 1₀ – 0 мин; 2 – вторичный радикал (g = 2.00415), 2₀, 2₅, 2₂₀ – 0, 5, 20 мин, соответственно.

Спектрофотометрический анализ продуктов реакции совместного окисления KNO₂ и p-кумаровой кислоты ПО2 корней пшеницы выявил образование нитропроизводного соединения. Повышение оптической плотности при 440 нм, по данным Sakihama с соавт. [5], свидетельствует об образовании 4-гидрокси-3-нитрокоричной кислоты (рис. 3). Аналогичные результаты получены для ПО1 (данные не показаны).

Рис. 3.

Образование нитропроизводного соединения р-кумаровой кислоты (λ = 440 нм) при добавлении KNO₂. 1 – без KNO₂, 2 – с добавлением KNO₂.

Хроматографический анализ продуктов реакции совместного окисления KNO₂ и p-кумаровой кислоты ПО2 корней пшеницы выявил образование нитропроизводного соединения (рис. 4). Без добавления KNO₂ (рис. 4) или в отсутствие ПО (данные не показаны) образования нитрофенола не происходило. Сравнение оптических спектров поглощения синтезированного стандарта 4-гидрокси-3-нитрокоричной кислоты и нитропроизводного продукта окисления ПО выявило идентичность формы спектров с характерными максимумами поглощения в области 314 и 440 нм при нейтральном рН (рис. 4а, б).

Рис. 4.

Хроматографический анализ продуктов реакции окисления KNO₂ и р-кумаровой кислоты ПО2 пшеницы. Сплошная линия – 314 нм, прерывистая – 440 нм. 1 – контроль, 2 – KNO₂. Во вставках показаны оптические спектры поглощения стандарта 4-гидрокси-3-нитрокоричной кислоты (а) и продукта окисления р-кумаровой кислоты (б).

ОБСУЖДЕНИЕ

Накопление азотсодержащих соединений и продуктов их метаболизма очень токсично для растений и животных. Наряду с нитрат- и нитритредуктазами, метаболизирующими эти соединения, оксидоредуктазы ПО также могут утилизировать азотсодержащие соединения, что приводит к образованию нитропроизводных фенольных соединений. В настоящей работе мы продемонстрировали, что апопластные ПО корней пшеницы могут участвовать в метаболизме азотсодержащих соединений, окисляя совместно нитриты и фенолы, в частности, с образованием 4-гидрокси-3-нитрокоричной кислоты, а также вероятно, путем восстановления нитратов до нитритов.

Как известно, окисление ПО фенольных субстратов сопровождается образованием ряда промежуточных продуктов, в том числе феноксильных радикалов, которые можно детектировать методом ЭПР [21, 24]. В настоящей работе обнаружено образование феноксильных радикалов апопластными ПО пшеницы при использовании хлорогеновой кислоты в качестве фенольного субстрата (рис. 2). В ходе окисления хлорогеновой кислоты апопластной ПО первичные феноксильные радикалы постепенно преобразовывались в более стабильные вторичные радикалы. Ранее образование первичных и вторичных радикалов хлорогеновой кислоты было показано с использованием коммерческого препарата ПО хрена [21]. По данным Sakihama с сотр. [24], время полужизни первичных феноксильных радикалов составляет 45 с, время полужизни вторичных радикалов составляет уже 20 мин. Увеличение времени жизни феноксильных радикалов за счет взаимодействия с двухвалентными металлами приводит к проявлению прооксидантных свойств радикалов, и, как следствие, перекисному окислению липидов и повреждению ДНК [24]. Наряду с этим, известно, что феноксильные радикалы могут проявлять антиоксидантные свойства, принимая участие в детоксикации Н₂О₂, гидроксильного радикала, синглетного кислорода, поскольку являются промежуточными продуктами при окислении фенолов пероксидазами [24]. В дальнейшем феноксильные радикалы либо восстанавливаются до фенола с помощью аскорбата или монодегидроаскорбат редуктазы [21], либо, при наличии нитритов и пероксидазы, нитрируются с образованием нитропроизводного [5]. В наших экспериментах добавление в реакционную смесь нитрита индуцировало мгновенное образование вторичных феноксильных радикалов даже в отсутствие ПО (рис. 2). Возможно, генерация вторичных феноксильных радикалов происходит неферментативным путем. Учитывая, что в отсутствие нитрита конверсия первичных радикалов и накопление вторичных радикалов происходит постепенно, можно полагать, что нитрит резко повышает токсичность действия феноксильных радикалов.

Для ПО различного происхождения характерно одновременное окисление нескольких субстратов [25]. Финальным продуктом совместного превращения фенольных соединений и нитритов, происходящее через образование промежуточных феноксильных радикалов, являются нитропроизводные фенолов [5]. В нашей работе при совместном окислении очищенными ПО1 и ПО2 кумаровой кислоты и нитрита обнаружено образование 4‑гидрокси-3-нитрокоричной кислоты (рис. 3). В отсутствии ПО появления этого нитропроизводного не наблюдается. Содержание нитрокоричной кислоты среди остальных продуктов реакции невелико (рис. 4), однако эта кислота имеет важное защитное значение. Например, известно, что присоединение нитрогруппы к тирозину, и в меньшей степени к триптофану, может приводить к изменению физико-химических свойств белков и их функций. Так, добавление нитрогруппы вызывает заметный сдвиг рКа гидроксильной группы с 10.07 в тирозине до 7.50 в 3˗нитротирозине и повышает гидрофобность тирозина, что сказывается на активности белка. Присутствие 3˗нитротирозина связывают с широким спектром заболеваний человека и животных [26]. В растениях нитрование тирозина вовлечено в разнообразные метаболические процессы, а также в ответные реакции на действие абиотических и биотических стрессоров [27, 28]. Оксикоричные кислоты близки по строению к тирозину, и их нитрование предотвращает нитрование аминогрупп белков [5]. Таким образом, образование нитрофенолов в результате совместного окисления фенолов и нитритов ПО может способствовать уменьшению нитрования белков.

Ранее нами было показано, что в листьях пшеницы при помещении растений в темноту происходило активирование ПО. Интересно, что при добавлении избытка нитрата значительного активирования ПО не наблюдалось [29]. Возможно, что снижение ПО активности по окислению фенолов в присутствии нитрата в темноте связано с взаимодействием нитрата с активным центром ПО. Известно, что нитрат ингибирует образование соединения Е1 (промежуточной полуокисленной формы фермента), связываясь внутри гемового “кармана” ПО [30]. Ранее было высказано предположение об участии ПО в восстановлении нитратов. Так, Пейве с соавт. [3] обнаружили нитратвосстанавливающую активность ПО во всех органах кормовых бобов, с более высоким уровнем в корнях. В наших экспериментах экстраклеточные ПО корней пшеницы также проявляли нитратвосстанавливающую активность с образованием нитрита. Интересно, что нитратвосстанавливающая активность ПО корней была более чувствительна к ингибитору гемсодержащих ферментов азиду, чем фенолоксидазная активность ПО (табл. 2). Аналогичные результаты с использованием коммерческого препарата ПО хрена были получены Ivanova с соавт. [20]. Чувствительность к цианиду обеих активностей ПО пшеницы в наших экспериментах была одинакова (табл. 2). Можно полагать, что, несмотря на то, что основным нитратвосстанавливающим ферментом в клетках растений является нитратредуктаза, в определенных условиях, например, при избыточном обеспечении растений нитратами или других стрессах, конкурентные взаимоотношения Н₂О₂ и нитрата приводят к “включению” нитратвосстанавливающей активности ПО.

Таким образом, участие ПО в метаболизме азота можно представить в виде совокупности реакций по восстановлению и окислению азота разной степени окисленности. Поступившие в корни нитраты в определенных условиях могут с помощью ПО корней метаболизироваться в нитриты, которые впоследствии могут быстро восстанавливаться нитритредуктазой до аммиака или посредством ПО включаться в состав нитропроизводных фенольных соединений. Кроме того, как показано данными ЭПР, ПО корней участвует в образовании первичных и вторичных феноксильных радикалов, которые являются интермедиатами образования нитрофенолов. В настоящей работе нами впервые показано участие одних и тех же изоформ ПО корней пшеницы как в возможном восстановлении нитрата, так и в окислении нитрита с образованием нитрофенола. Имеющиеся в настоящий момент данные свидетельствуют о том, что ПО могут регулировать концентрацию АФА. В частности, не исключено, что ПО-опосредованный метаболизм азота в растениях сопровождается образованием АФА, обладающих большим регуляторным действием. Будущие исследования прольют свет на вовлечение и физиологические роли растительных ПО в образовании и метаболизме АФА, таких как NO₂ и NO, как побочных продуктов совместного окисления азотсодержащих соединений и фенолов.

Работа выполнена в рамках государственного задания Федерального исследовательского центра “Казанский научный центр Российской академии наук” (анализ активности ферментов) с использованием оборудования Коллективного спектро-аналитического Центра физико-химических исследований строения, состава и свойств веществ и материалов Федерального исследовательского центра “Казанский научный центр Российской академии наук” и частично в рамках Программы стратегического академического лидерства Казанского (Приволжского) федерального университета (получение химического стандарта).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Настоящая статья не содержит каких˗либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов исследований.