Вопросы ихтиологии, 2019, T. 59, № 1, стр. 117-120

Эффективность нереста рыб в естественных популяциях, как и их воспроизводство в условиях искусственного выращивания, в значительной степени определяются репродуктивными характеристиками самцов. Наиболее достоверной характеристикой качества сперматозоидов является успешность оплодотворения (при условии качественных женских гамет). На успешность оплодотворения влияет множество факторов как в период до момента проникновения сперматозоида в микропиле икры, так и в процессе слияния его пронуклеуса с пронуклеусом яйцеклетки (Holt et al., 2004). Качество спермы самцов рыб оценивают по их двигательной активности в соответствии с морфологическими, физиологическими и биохимическими показателями. Вариабельность показателя оплодотворения чаще всего положительно коррелирует со скоростью движения сперматозоидов. Поэтому наиболее информативными методами определения качества и жизнеспособности клеток спермы являются функциональные тесты, определяющие характеристики движения сперматозоидов (Fauvel et al., 2010). К ним относятся такие показатели, как скорость движения сперматозоидов по прямолинейной и криволинейной дистанциям и доля подвижных сперматозоидов.

Для успешного осеменения икры рыб в искусственных условиях необходимо проведение качественной и быстрой предварительной оценки половых продуктов самцов (Павлов, 2006). В последнее время широкое распространение получили методы компьютерного анализа качества спермы, значительно упрощающие получение и обработку количественных данных (Rurangwa et al., 2004). Многие исследователи используют программу ImageJ с подключёнными плагинами CASA (Sanches et al., 2013; Suquet et al., 2016) или MTrack2 (Павлов, 2006; Емельянова и др., 2015). Оба плагина предполагают начальную графическую модификацию каждого видеоролика и ручной перенос данных, полученных в ImageJ, в статистические программы. Подобная обработка и анализ данных при наличии большого количества проб требуют огромных затрат времени исследователя.

Цель работы – разработать и оптимизировать алгоритм определения характеристик движения сперматозоидов рыб с помощью программы ImageJ на модельном объекте – черноморской камбале-калкане Scophthalmus maeoticus.

Для определения характеристик спермы использовали собственную модификацию метода компьютерного анализа (Баяндина, 2013) с помощью трёх компьютерных программ: VirtualDubMod – для захвата изображения и обработки образов, ImageJ – для анализа изображений и Microsoft Exсel – для анализа полученных данных. Видеосъёмку проводили с помощью инвертированного микроскопа NikonEclipse с подсоединённой аналоговой видеокамерой.

По полученным в ImageJ длинам пути каждого сперматозоида рассчитывали скорости движения сперматозоидов по криволинейной и прямолинейной дистанциям (мкм/с) и долю подвижных сперматозоидов для каждого образца (%). В соответствии с принятой системой оценки подвижности спермы рыб (Burness et al., 2005; Павлов, 2006) и собственными предварительными экспериментами сперматозоиды со скоростью <20 мкм/с считали малоподвижными и не учитывали при подсчёте средних скоростей.

Индивидуальные характеристики спермы определили у 15 самцов калкана, отловленных в Чёрном море в 2012 (8 экз.) и 2013 (7 экз.) гг. Пробы отбирали стерильными одноразовыми шприцами на борту научно-исследовательского судна непосредственно после поимки живой рыбы камбальными жаберными сетями с размером ячеи 200 мм. В период между отбором проб и их доставкой в лабораторию для оценки качества спермы (в течение 2–4 ч) шприцы со спермой без доступа воздуха и влаги находились в термосе под слоем льда (4–6°С). Для исследования характеристик подвижности сперматозоидов 0.1 мл спермы разбавляли охлаждённой (до 15°С) фильтрованной морской водой в соотношении 1 : 10 в двух повторностях. После разбавления сперма находилась в стерильном планшете при комнатной температуре.

Видеорегистрацию проводили в капле спермы, отобранной из планшета сразу после разбавления и через равные промежутки времени (5 мин), при увеличении микроскопа ×100. Видеосъёмку проводили в толще капли без использования покровного стекла, наличие которого приводит к уменьшению количества свободно перемещающихся сперматозоидов (Баяндина, 2013). В процессе видеозаписи поле зрения меняли, выбирая участки с наиболее подвижными клетками. Многие активные сперматозоиды быстро уходят из поля зрения, в связи с этим их подвижность регистрировали на протяжении коротких (0.5 с) отрезков времени. В программе VirtualDubMod нарезали каждый видеоролик в трёх разных полях зрения по 15 кадров. Полученные ролики (три для каждой повторности, т.е. 9 шт. для каждой пробы) сохраняли отдельными файлами (405 видеофайлов) с частотой 25 кадров в секунду, не содержащими аудиодорожку.

Видеозапись анализировали в программе ImageJ с помощью стандартного функционала и установленного плагина wrMTrck_Batch; все измерения регистрировали в пикселях (пк). Минимальные и максимальные размеры объекта определяли с помощью выделения Oval selection и вручную измеряли площади головки самого малого и самого большого сперматозоидов, наблюдаемых на протяжении всего видеоролика. Далее определяли площадь головок (Analyze/Measure). Для измерения максимальной скорости перемещения объекта между кадрами фиксировали дистанцию, преодолеваемую одним из самых быстрых сперматозоидов между двумя соседними кадрами, обозначив инструментом Straight Line начальную точку на первом кадре, а конечную − на втором; затем определяли длину отрезка (Analyze/Measure). В поле зрения находилось около 1000 сперматозоидов, площадь их головок варьировала в пределах 3−90 пк², т.е. объекты находились достаточно близко друг к другу. Скорость движения, подсчитанная вручную с помощью инструмента Straight Line, была равна 3–10 пк/кадр. Максимальную скорость устанавливали 20 пк/кадр. При значительном уменьшении этого параметра не учитывается часть быстродвижущихся сперматозоидов, при уменьшении − программа ложно распознаёт соседние объекты. Минимальное количество кадров, в течение которых движется объект, выставляли равным 5–7, так как сперматозоиды быстро уходят из поля зрения. Изменение площади объекта выставляли равным 90% в связи с тем, что сперматозоид может частично уходить в толщу жидкости и в процессе видеозаписи меняется видимая часть его головки.

Концентрацию сперматозоидов в эякуляте (кл/мл) подсчитывали в камере Горяева. Для этого сперму разбавляли морской водой в соотношении 1 : 100 в двух повторностях для каждой пробы. Заполненную камеру помещали под микроскоп и записывали видео с изменением глубины резкости. В полученных видеороликах с помощью программы VirtualDubMod вырезали видимую область с линейными параметрами, равными размерам большого квадрата камеры Горяева (0.2 × 0.2 мм). Таким образом, один ролик содержал запись всех сперматозоидов в объёме жидкости над квадратом, образованным большими делениями сетки камеры. Для подсчёта концентрации сперматозоидов в 1 мл регистрировали пять таких квадратов для каждой пробы.

Для определения значений скоростей движения всех объектов в кадре, медиан и средних, доверительных интервалов, а также для подсчёта доли подвижных сперматозоидов в пробах (число сперматозоидов в кадре, движущихся со скоростью >20 мкм/с относительно общего числа сперматозоидов, %) были написаны макросы под Excel, позволяющие обрабатывать txt-файлы с данными.

В результате анализа проб спермы калкана с помощью модифицированного метода получены следующие данные (в среднем по всем пробам): скорость движения сперматозоидов по криволинейной дистанции – 76 ± 40 мкм/с, по прямолинейной – 55 ± 43 мкм/с, доля подвижных сперматозоидов – 67%, концентрация – 3.6 ± 1.4 × 10⁹ кл/мл. Установлено, что сразу после активации спермы морской водой и в течение первых 20 мин доля подвижных сперматозоидов практически во всех пробах остаётся высокой, через 30 мин после активации показатели активности достоверно снижаются (рисунок).

Скорость движения сперматозоидов по криволинейной дистанции (VCL, мкм/с) (а) и доля подвижных сперматозоидов, % (б) в течение 240 мин после активации спермы восьми самцов черноморской камбалы-калкана Scophthalmus maeoticus; (−⚪−) − средние значения, (I) − средние квадратичные отклонения.

Плагин MTrack2 разработан для вычисления скоростей движения любых объектов (Stuurman, 2009), плагин CASA − специально для определения характеристик активности сперматозоидов (Wilson-Leedy, Ingermann, 2007). При использовании обоих плагинов алгоритм обработки видеофайлов, внесение начальных данных в ImageJ, сохранение данных в формате txt и их дальнейший перенос в Excel (или другую сходную программу) производится вручную для каждой пробы. Получение данных при анализе видеозаписей крайне трудоёмко и требует больших затрат времени.

Применение плагина wrMTrck_Batch (Nussbaum-Krammer et al., 2015) позволяет избежать повторения рутинных действий и предоставляет исследователю бóльшую свободу в выборе параметров, наиболее подходящих для анализа движения различных объектов, в частности: обрабатывать разные типы видеофайлов (cxd, avi, zip, mov); автоматически отделять объекты от фона (способ задаётся в начальном окне); автоматически переводить изображение в бинарное; отслеживать движения объектов, учитывая его минимальные и максимальные размеры в пикселях, максимальную скорость перемещения объекта между кадрами, изменение площади объекта; минимальное число кадров, в течение которых движется объект; производить запись дополнительных параметров (например, координат перемещения по осям x и y); пакетно обрабатывать массивы видеофайлов.

Пакетная обработка файлов значительно экономит время, позволяя подвергать анализу целые папки с вложенными видеофайлами. После обработки видеофайлов плагин wrMTrck_Batch автоматически сохраняет результаты для каждого файла отдельно в формате txt (с именем соответствующего видеофайла).

Написанные авторами макросы под Excel облегчают и ускоряют анализ данных, сохранённых в формате txt. Макросы для сбора txt-файлов для каждой пробы и создания результирующих таблиц по всем пробам позволяют выбирать отдельные txt-файлы, создают таблицы с подсчитанными характеристиками движения сперматозоидов и сохраняют полученные xls-файлы под заданными именами. Применение плагина wrMTrck_Batch в программе ImageJ и написанных макросов для Excel целесообразно для определения характеристик движения большого числа мелких объектов, таких как сперматозоиды рыб. При наличии большого массива обрабатываемых видеофайлов описанный в статье алгоритм позволяет избежать выполнения огромного количества рутинных действий по обработке каждого видеофайла в отдельности. На создание сводной таблицы характеристик движения сперматозоидов из 405 нарезанных видеороликов затрачивается не более 30 мин.