Известия РАН. Серия биологическая, 2023, № 4, стр. 339-345

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали сухую биомассу тонкоизмельченной хитинсодержащей кутикулы куколок (КК) мухи H. illucens, состав которой был изучен в соответствии с методиками и выражен в %: протеин – по ГОСТ 13496.4–2019, п.8; хитин по клетчатке – по ГОСТ 31675–2012; жир – по ГОСТ 13496.15–2016; содержание углеводов – безазотистых экстрактивных веществ определяли расчетным способом путем вычитания из 100% суммы вышеперечисленных компонетов.

Качественный состав функциональных групп хитина определялся методом ИК-Фурье спектроскопии с применением приставки нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО). Исследование проводилось на ИК-Фурье спектрометре марки “Frontier” (Perkin Elmer).

Для разделения материала КК на фракции использовали стандартный набор сит ГОСТ 51568–99.

Изучение микрорельефа и энергодисперсионных спектров поверхности частиц хитина куколок проводилось с помощью сканирующего электронного микроскопа “TESCAN Mira 3 LMU” (Чехия).

Для исследования сорбционных свойств материала КК использовался краситель метиленовый голубой (МГ) как общепринятое стандартное вещество при определении сорбционной емкости. Растворы, содержащие МГ в заданных концентрациях, готовились путем растворения расчетной навески реактива в дистиллированной воде.

Адсорбционные исследования проводились в статических условиях. Использовался раствор МГ с исходной концентрацией 25 мг/дм³, объемом по 100 см³, который помещали в стеклянные колбы вместимостью 250 см³, куда добавляли навески материала КК заданной массы. Колбы с раствором МГ и навесками КК встряхивались на автоматическом шейкере в течение 24 ч при температуре 22 ± 0.1°C. Затем содержимое колб отфильтровывалось через бумажный фильтр, в фильтрате определялись остаточные концентрации МГ. Сорбционная емкость A, ммоль/дм³, рассчитывалась по формуле:

где C_н – начальная концентрация МГ, ммоль/дм³; C_р – равновесная концентрация МГ после адсорбции, ммоль/дм³; V – объем модельного раствора, дм³; m – масса сорбционного материала, г.

Изучение процесса адсорбции осуществлялось при температуре 22 ± 0.1°C.

Статистическую обработку данных осуществляли согласно ГОСТ Р 8.736–2011 “Государственная система обеспечения единства измерений (ГСИ). Измерения прямые многократные. Методы обработки результатов измерений. Основные положения”

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Кутикула куколок содержит белок и хитин практически в равных количествах, составляя 95% от всех компонентов. Суммарная доля жира и безазотистых экстрактивных углеводов не превышала 5% (табл. 1). Результат указывает на перспективность кутикулы куколок как источника хитина, который не требует специального обезжиривания для последующего выделения.

Высушенный и измельченный материал КК с помощью набора сит разделился на фракции: ∅ < < 0.25 мм; 0.25 < ∅ < 0.5 мм; 0.5 < ∅ < 1 мм. Путем взвешивания определенных объемов КК определился насыпной вес (ρ_нас) для каждой фракции (табл. 2).

Как видно из табл. 2, с повышением размера частиц, насыпной вес материала уменьшается, что объясняется меньшей плотностью упаковки частиц.

Качественный состав материала КК фракции <0.25 мм изучали методом ИК-спектроскопии.

На ИК-Фурье спектре (рис. 1) исследованного образца в области 3500–3100 см^–1 присутствует широкая полоса, характерная для валентных колебаний гидроксильных групп. В области 3000–2800 см^–1 имеются два пика, характерные для метильных и метиленовых групп. В области 1700–800 см^–1 присутствуют полосы при 1643 см^–1, характерные для N–H связи, 1543 см^–1 для C=O-связи, полоса при 1378 см^–1 соответствует сумме колебаний связей N–H и C–N в амидах. Полоса 1010 см^–1 соотносится с валентными колебаниями C–O-связи.

Рис. 1.

ИК-спектр образца сорбционного материала из кутикулы куколок H. illucens.

Анализ полос в ИК-спектре полученного нами хитина из КК H. illucens показал сходство структуры хитина, полученного из личинок, куколок и имаго насекомого другими исследователями (Soetemans et al., 2020; Wang et al., 2020; Triunfo et al., 2022), что позволяет предположить его пригодность для промышленных и биомедицинских применений.

Также выявлено, что ИК-спектры хитинов, выделенных из панцирей креветок, водорослей и КК H. illucens, сопоставимы между собой (Coltelli et al., 2022). Сходную картину имеют ИК-спектры хитинов, полученных из личинок черной львинки, лосося атлантического, кальмара и панциря тигровой креветки (Brigode et al., 2020).

На рис. 2 показаны микрофотографии частиц сорбционного материала при разных увеличениях. Как видно из полученных данных, поверхность частиц сорбционного материала имеет высокоразвитую структуру, а его состав содержит множество элементов, таких, как Ca, Mn, P, C, O и др. (табл. 3). Основными элементами являлись углерод (в среднем 39.3%), кислород (в среднем 32.2%), а также кальций (в среднем 11%). Можно отметить, что по содержанию углерода и кислорода образцы разных участков кутикулы существенно не различались, что характерно для органической природы исследуемого материала, в то время как доля кальция различалась в два раза. Это, по-видимому, связано с особенностями структурной организации кутикулы, в которой Са располагается неравномерно по всей массе кутикулы, и локализован в зоне соединения между хитиновой и белковой фазами, которая включает соли кальция, обычно карбонаты в форме кальцита, для увеличения жесткости кутикулы (Vincent, Wegst, 2004).

Рис. 2.

Микрофотографии частицы сорбционного материала с разрешением: а – 250; б – 25 нм.

Для проверки возможности использования хитинового материала для очистки водных сред использовался раствор метиленового голубого, как общепринятый стандарт при определении сорбционной емкости. Рациональная масса добавки составила 2 г/дм³, длительность взаимодействия модельного раствора и хитиновым сорбционным материалом – 20 мин (рис. 3, 4).

Рис. 3.

Влияние длительности взаимодействия модельного раствора с хитиновым сорбционным материалом на эффективность очистки.

Рис. 4.

Влияние массы добавки сорбционного материала на эффективность очистки.

Последующим этапом работы было определение расчетным путем удельной площади поверхности (Sуд) сорбционного материала. Для этого строилась изотерма адсорбции, представленная на рис. 5, которая по классификации ИЮПАК, относится к изотермам I типа и характеризует изотерму на микропористых твердых телах.

Рис. 5.

Изотерма адсорбции красителя метиленовый голубой на поверхности порошка хитиновых кутикул куколок H. illucens.

Значение Sуд исследуемого сорбционного материала рассчитывалось по формуле:

где A_∞ = 0.118 ммоль/г; N_A – число Авогадро, 6.02 × 10²³ ммоль^–1; Q – площадь поперечного сечения молекулы МГ, М = 319.85 г/моль.

Полученное значение S_уд составило 20.6 м²/г.

Изотерма адсорбции обработана методом регрессии с помощью программного обеспечения MATLAB в рамках моделей Ленгмюра, Фрейндлиха и Дубинина–Радушкевича (Галимова и др., 2016). Полученные результаты (рис. 6, табл. 4) позволяют утверждать, что адсорбция МГ материалом хитиновых КК черной львинки наиболее адекватно описывается моделью Дубинина–Радушкевича (R² = 0.8031), которая описывает процесс адсорбции на твердых пористых адсорбентах, к которым можно отнести материал КК. Эта модель используется также для идентификации протекания физической или химической адсорбции, так как константа Дубинина–Радушкевича применяется для определения энергии адсорбции. По величине энергии сорбции (E) можно судить о природе взаимодействия между КК и активными центрами сорбционной поверхности, т.е. получить ответ на вопрос, является ли процесс закрепления МГ на поверхности сорбента физическим процессом, или он имеет химический характер. При E < 8 кДж/моль адсорбция носит физический характер, а при E от 40 кДж/моль и выше – химический.

Рис. 6.

Изотермы адсорбции, обработанные в рамках моделей: а) Ленгмюра, б) Фрейндлиха, в) Дубинина–Радушкевича.

В нашем случае значение E = 5.534 кДж/моль, поэтому следует утверждать, что в данном случае имеет место физический процесс адсорбции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследованы некоторые физико-химические свойства хитина, выделенного из кутикулы куколок мухи H. illucens. Определен качественный и гранулометрический составы полученного хитина, а также изучен микрорельеф поверхности последнего. Исследованы сорбционные свойства материала на примере красителя метиленового голубого. Установлено, что сорбционная емкость материала составляет 0.118 ммоль/г (38 мг/г). Математическая обработка изотермы сорбции в рамках моделей Ленгмюра, Фрейндлиха, Дубинина–Радушкевича, показала, что лучше всего процесс описывается моделью Дубинина–Радушкевича (R² = 0.8031), а процесс адсорбции имеет физическую природу (E = 5.534 кДж/моль). Полученные данные свидетельствуют о возможности доставки пробиотиков, сорбированных на поверхности хитина силами физической адсорбции, в организм-реципиент, где, благодаря, слабой энергии сорбционного взаимодействия пробиотики освобождаются и вступают в биохимический круговорот веществ в организме, а хитиновая часть принимает участие в моторике кишечника.

Работа выполнена в рамках реализации федеральной программы поддержки университетов “Приоритет 2030” с использованием оборудования на базе Центра высоких технологий БГТУ им. В.Г. Шухова.