Кристаллография, 2020, T. 65, № 2, стр. 266-270

ВВЕДЕНИЕ

Олигопептидазы В (OpdBs) представляют собой сериновые пептидазы с трипсиноподобной субстратной специфичностью [КФ 3.4.21.83], принадлежащие семейству пролилолигопептидаз (POP), характерной особенностью которого является наличие N-концевого регуляторного β-пропеллерного домена и С-концевого α/β-гидролазного каталитического домена [1]. OpdBs или кодирующие их гены обнаружены в прокариотах, одноклеточных эукариотах и некоторых высших растениях [2]. Установлено, что эти ферменты относятся к факторам патогенеза трипаносомозов, лейшманиозов и других паразитарных, а в ряде случаев и бактериальных инфекций, и являются потенциальными мишенями для разработки терапевтических противоинфекционных средств [3].

К настоящему моменту получены только трехмерные структуры протозойных OpdBs из лейшмании Leishmania major и трипаносомы Trypanosoma brucei, которые продемонстрировали, что помимо аминокислотных остатков триады активного центра и первичного субстратсвязывающего центра функционирование OpdBs определяется наличием пяти междоменных солевых мостов [4, 5]. Однако консервативные в протозойных OpdBs заряженные аминокислотные остатки междоменного интерфейса, участвующие в образовании четырех из пяти функционально важных солевых мостов, не являются консервативными в большинстве бактериальных ферментов, что указывает на существование различных механизмов активации у OpdBs бактерий и простейших [6]. Поиск альтернативных структурных мотивов, регулирующих каталитическую активность OpdBs бактерий, затруднен отсутствием пространственных структур этих ферментов.

Цель настоящей работы – поиск условий кристаллизации и получение кристаллов, пригодных для рентгеноструктурного анализа (РСА) олигопептидазы В из психрофильной бактерии Serratia proteamaculans (PSP) [7, 8]. Рекомбинантная PSP была получена в системе экспрессии Escherichia coli и функционально охарактеризована [9–12], однако получить пригодные для РСА кристаллы длительное время не удавалось. С целью решения этой проблемы был использован метод термофлуор, представляющий собой разновидность дифференциальной сканирующей флуориметрии и позволяющий быстро анализировать стабильность водорастворимых белков в различных средах [13, 14].

В результате исследований установлено, что термостабильность PSP увеличивается в присутствии низкомолекулярных полиаминов. Кристаллы PSP, выращенные в присутствии спермина, были использованы для РСА, проведенного на синхротронном источнике НИЦ “Курчатовский институт”. Собранный набор дифракционных данных обработан до разрешения 1.88 Å.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение и очистка белка. Рекомбинантная PSP, содержащая N-концевой полигистидиновый таг, была получена с помощью металлохелатной афинной хроматографии, проводимой на Ni-NTA, как описано в [6, 10–12]. Для концентрирования белка использовали приборы для ультрафильтрации Centricon (Merck-Millipore, США). Для проверки чистоты препарата проведен ДСН-ПААГ-электрофорез с использованием ячейки для электрофореза Mini-Protean 3 (Bio-Rad, США). Концентрация разделяющего геля составляла 10–12%, концентрирующего – 4%. Гели окрашивали с помощью Coomassie G-250. Концентрацию белка определяли методом Брэдфорда с помощью реактива Bio-Rad Protein Assay и стандарта БСА (бычий сывороточный альбумин).

Дифференциальная сканирующая флуориметрия (термофлуор). Реакционная смесь для поиска условий, стабилизирующих PSP, содержала белок с концентрацией 0.5 мг/мл и 5-кратный краситель SYPRO Orange (λ_ex – 300 и 470 нм, λ_em – 570 нм) (Sigma-Aldrich, CША) в буферных растворах, различающихся pН, ионной силой, вязкостью, присутствием различных двухвалентных катионов, детергентов или лигандов из набора Silver Bullet (Hampton Research). Реакционную смесь раскапывали в 96-луночные планшеты для полимеразной цепной реакции в реальном времени (РВ-ПЦР); в качестве контроля использовали реакционные смеси без белка. Каждое условие анализировали в трех повторах. Кривые плавления снимали на РВ-амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, США) в режиме FRET в диапазоне температур от 25 до 65°С с интервалом 1°С. Обработку полученных данных проводили с использованием программы GraphPad Prism 8.0. Для построения кривых плавления из усредненных значений флуоресценции образцов, содержащих белок, вычитали усредненные значения флуоресценции контрольных замеров. Значения, выходящие за пределы S-образной области, обрезали, а кривые аппроксимировали в соответствии с уравнением Больцмановской кривой плавления [15]. Температуру плавления находили как значение температуры, при которой флуоресценция достигает половины максимального значения, что соответствует перегибу кривой плавления.

Поиск условий кристаллизации и выращивание кристаллов. Поиск условий кристаллизации PSP проводили методом “сидячей капли” посредством диффузии в парах в 96-луночных пластиковых планшетах Intelli-plate LowProfile (Art Robbins, США) при температурах +20 и +4°С. Использовали роботизированную систему кристаллизации “Rigaku” (Япония) РЦ МКБ НИЦ “Курчатовский институт” и стандартные наборы для скрининга условий кристаллизации глобулярных белков: Crystal Screen HT, Index HT, PEG/Ion HT, PEGRx HT, TOP-96 (Hampton Research и Anatrace). Оптимизацию найденных условий проводили методом “висячей капли” посредством диффузии в парах в 24-луночных планшетах (Linbro). В ходе оптимизации варьировали концентрацию белка и осадителя, pH и ионную силу буферных растворов. Кристаллы, пригодные для проведения РСА, были выращены в течение 7 дней при +4°С в условиях 200 мМ Lithium sulfate, 100 мМ Bis-Tris, pH 5.5, 23% PEG 3350.

Сбор и обработка дифракционных данных. Сбор дифракционных данных был проведен на станции Белок (λ = 0.787 Å) Курчатовского источника синхротронного излучения. Эксперимент проводили при температуре 100 K в прямой геометрии (θ = 0°). Кристалл находился в криопетле, в качестве криопротектора использовали раствор с добавлением 25% глицерина. Было собрано 350 дифракционных картин с шагом в 1°, расстояние образец–детектор 140 мм. Картины дифракции детектировались с помощью двумерного детектора Rayonix MARCCD.

Данные были проиндексированы и проинтегрированы с помощью программы iMosflm из пакета CCP4 [16]. Статистика набора данных приведена в табл. 1.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Несмотря на значительные успехи структурной биологии, кристаллизация белков все еще остается “наукой на грани искусства”. Объект данного исследования олигопептидаза В из S. proteamaculans – двухдоменный психрофильный фермент, плохо поддавался кристаллизации. Причиной этого могло быть постоянное движение доменов друг относительно друга, происходящее при переходе молекулы из открытой неактивной формы в закрытую активную и обратно, что описано в литературе для ферментов данного класса [5].

Чтобы найти условия, способствующие стабилизации и соответственно кристаллизации PSP, использовали метод термофлуор, представляющий собой разновидность дифференциальной сканирующей флуориметрии [13]. Данный метод позволяет быстро анализировать стабильность белков в растворах разного состава. Он основан на добавлении в водный раствор белка термостабильных флуоресцентных красителей, способных неспецифически связываться с гидрофобной поверхностью белка. При постепенном повышении температуры тепловая денатурация белка приводит к разворачиванию гидрофобного ядра, которое становится доступным молекулам красителя. При связывании красителя с гидрофобным ядром гашение флуоресценции снимается молекулами воды, и квантовый выход флуоресценции резко возрастает, что определяется РВ-амплификатором. Полученная кривая тепловой денатурации позволяет рассчитать температуру плавления белковой глобулы, являющуюся одним из показателей стабильности белка. Сдвиг температуры плавления при различных значениях pH, ионной силы, вязкости или в присутствии каких-либо добавок позволяет найти факторы, способствующие стабилизации белковой глобулы. Увеличение стабильности белка способствует повышению результативности структурных исследований, таких как РСА или гетероядерная спектроскопия ядерного магнитного резонанса высокого разрешения [13, 14].

В табл. 2 представлены все условия, при которых была исследована термостабильность PSP. В табл. 3 представлены три условия, при которых наблюдалось повышение температуры плавления PSP по сравнению с контрольным экспериментом, а на рис. 1 – результаты термофлуориметрии PSP в этих же условиях. Как видно из табл. 3, согласно результатам дифференциальной сканирующей флуориметрии температура плавления (T_пл) PSP была около 40°С, что коррелировало с данными по тепловой денатурации фермента, полученными ранее [9, 11, 17]. В трех найденных условиях T_пл поднималась более чем на 2°C. Сравнительный анализ этих условий показал, что во всех случаях повышение температуры плавления белковой глобулы происходило в присутствии низкомолекулярных полиаминов, к которым относятся спермин, спермидин, цистамин, кадаверин и хлорид гексаамминкобальта(III). Известно, что эти полиамины широко используются для получения кристаллов нуклеиновых кислот, что связано с их способностью нейтрализовать отрицательно заряженные фосфатные группы, большое количество которых на поверхности молекул препятствует кристаллизации [18]. Наблюдаемая стабилизация PSP в присутствии полиаминов скорее всего тоже связана с нивелированием отрицательных зарядов на поверхности белка положительно заряженными аминогруппами, что в свою очередь должно способствовать образованию стабильных кристаллических контактов. Поэтому дальнейшую кристаллизацию PSP проводили в присутствии полиамина – спермина (рис. 2).

Рис. 1.

Изменение кривой плавления PSP в присутствии низкомолекулярных полиаминов, определенное методом термофлуор. Серые линии – кривые плавления PSP в присутствии растворов D9, H4, B9 из набора Silver Bullets (табл. 3). Черная линия – контрольная кривая плавления PSP. Приведены средние значения по трем независимым экспериментам.

Рис. 2.

Химическая формула спермина – N,N´-бис(3-аминопропил)бутан-1,4-диамина.

Кристалл PSP, выращенный в присутствии спермина, представлен на рис. 3. Кристалл использовали для РСА, проведенного на станции Белок синхротронного источника НИЦ “Курчатовский институт”. Кристалл принадлежал пр. гр. P2₁2₁2₁ c параметрами ячейки: a = 70.74, b = = 100.44, c = 108.72 Å, α = β = γ = 90° (табл. 1). Собранный набор дифракционных данных позволяет определить структуру фермента с разрешением 1.88 Å.

Рис. 3.

Фотография кристалла PSP, выросшего в присутствии 5 мМ cпермина, полученная с помощью стереомикроскопа Nikon SZM 1000.

В заключение отметим, что в результате подбора условий, способствующих стабилизации белка в растворе, с помощью метода дифференциальной сканирующей флуориметрии (термофлуор) впервые удалось получить кристаллы бактериальной олигопептидазы В, пригодные для РСА.

Работы по дифференциальной сканирующей флуориметрии и рентгенокристаллографии PSP выполнены при поддержке Российского научного фонда (соглашение № 17-14-01256). Протокол проведения термофлуориметрических экспериментов был предварительно разработан при поддержке Министерства науки и высшего образования в рамках выполнения работ по Государственному заданию ФНИЦ “Кристаллография и фотоника” РАН.