Кристаллография, 2020, T. 65, № 4, стр. 597-604

ВВЕДЕНИЕ

Белки семейства аспарагиназ, относящиеся к классу амидогидролаз (EC 3.5.1.1), катализируют гидролиз аспарагина до аспарагиновой кислоты и аммиака [1]. При физиологических условиях эта реакция практически необратима. Большинство известных бактериальных аспарагиназ также способно гидролизовать L-глутамин с активностью, в некоторых случаях сравнимой с аспарагиназной [2, 3]. L-аспарагиназы относятся к ферментам медицинского значения, которые находят широкое применение в качестве эффективных противоопухолевых средств при лечении острых лимфо-бластных лейкозов, лимфо- и ретикулосарком. Их ярко выраженная противоопухолевая активность связана с тем, что в ряде опухолевых клеток отсутствует фермент аспарагинсинтетаза, вследствие чего клетки этого типа не способны синтезировать аспарагин и зависят от доставки данной аминокислоты из внешних источников [4, 5], что нарушает биосинтез белка. Существенным недостатком аспарагиназ в качестве медицинских препаратов является их токсичность, частично связанная с наличием глутаминазной активности. L-глутамин играет существенную роль в транспорте азота в крови, и длительное отсутствие этой аминокислоты при аспарагиназной терапии приводит к серьезным нарушениям в организме. Недостатком аспарагиназ является также их относительно низкая стабильность в условиях применения [6, 7]. В этой связи представляют интерес способы качественного усовершенствования L-аспарагиназ, в первую очередь с целью увеличения времени их действия и оптимизации соотношения специфической аспарагиназной и неспецифической глутаминазной активности [8].

Одним из способов повышения устойчивости аспарагиназ к действию протеиназ является внесение направленных мутаций в аминокислотные последовательности L-аспарагиназ, что осуществляется путем замены аминокислотных остатков, подвергающихся протеолизу, на альтернативные остатки, не узнаваемые соответствующими протеиназами [8–10].

Особый интерес как объект для модификации вызывает L-аспарагиназа бактерий Wolinella succinogenes (WAS). Фермент хорошо изучен, обладает доказанным противоопухолевым действием, пониженной токсичностью, протеолитической стабильностью и длительным временем циркулирования в кровотоке [11–15]. L-аспарагиназа Wolinella succinogenes отличается от ферментов из Escherichia coli и Erwinia chrysanthemi предельно низкой глутаминазной активностью, демонстрирует низкие побочные эффекты и высокий уровень противоопухолевой активности, что делает ее наиболее пригодной для медицинского применения [16–20].

На основе этого фермента создан мутантный вариант рекомбинантной L-аспарагиназы Wolinella succinogenes (WASm), в которой аминокислотный остаток валина в положении 23 заменен на остаток глутамина, а аминокислотный остаток лизина в положении 24 заменен на остаток треонина. Введением двух мутаций K24T, V23Q в N-концевую подвижную петлю исходной молекулы WAS, ограничивающую активный центр и содержащую два каталитически важных остатка, был получен фермент, устойчивый к действию трипсина [21]. Полученный мутантный фермент WASm практически полностью сохранил исходную аспарагиназную активность, имел большую устойчивость к трипсину, а его глутаминазная активность оказалась на порядок ниже исходной [21].

В [22] были установлены пространственные структуры мутантной формы L-аспарагиназы WASm в апо-форме и в комплексах с продуктами реакции – L-аспарагиновой и L-глутаминовой аминокислотами в кристаллах (пр. гр. P2₁). В настоящей работе проведено сравнение конформации молекулы апо-формы мутанта L-аспарагиназы WASm и упаковок молекул апо-фермента в двух кристаллических модификациях – новой (пр. гр. P22₁2₁) и ранее установленной (пр. гр. P2₁ [22]). Кристаллы ромбической формы содержат две субъединицы (димер) в независимой части ячейки в отличие от моноклинной модификации с четырьмя субъединицами (тетрамером) в независимой части ячейки.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Мутантная L-аспарагиназа WASm (V23Q, L24T) получена, как описано в [21]. Поиск условий кристаллизации проведен методом диффузии паров растворителя в висячей капле с использованием приготовленных растворов полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 3350, 4000, 8000 различной концентрации в интервале 6–25% при значениях рН от 5.5 до 7.2. Пригодные для структурного исследования кристаллы апо-формы L-аспарагиназы WASm получили при температуре 295 K. К 2 мкл раствора белка (концентрация 12 мг/мл) в фосфатном буфере концентрацией 0.01 М, рН 7.2, на силиконированной стеклянной пластинке добавляли равный объем резервуарного раствора, содержащего 8%-ный ПЭГ 3350 в фосфатном буфере концентрацией 0.1 М, рН 7.2. Стеклянной пластинкой с каплей накрывали ячейку, содержащую 0.5 мл резервуарного раствора. В этих условиях выросли кристаллы, принадлежащие моноклинной (a = 62.820, b = = 109.170, c = 87.700 Å, β = 95.50°, пр. гр. P2₁) и ромбической (a = 60.619, b = 79.959, c = 108.469 Å, пр. гр. P22₁2₁) сингониям. Дифракционные наборы от ромбических кристаллов (пр. гр. P22₁2₁) были получены, как описано в [23].

Структура кристаллов решена методом молекулярного замещения с использованием программы Phaser [24] и координат аспарагиназы (PDB_ID: 1WSA) в качестве стартовой модели. Для уточнения структуры использовали программу Refmac [25]. Ручную правку моделей проводили при помощи программы Coot [26], используя карты электронной плотности, рассчитанные с коэффициентами 2|F_o|–|F_c| и |F_o|–|F_c|. Независимая часть кристаллической ячейки содержит две субъединицы молекулы аспарагиназы, биологически активной формой которой является гомотетрамер. На картах электронной плотности не были локализованы аминокислотные остатки 1, 2, 18/А–27/А, 17/В–29/В, 289/B. Статистические характеристики уточнения приведены в табл. 1. Координаты атомной модели депонированы в Международный банк белковых данных (PDB_ID: 6SYH).

Анализ и сравнение пространственных структур апо-фермента разных модификаций проводили с использованием программ COOT [26], LSQ из пакета CCP4 [27], PISA, PyMol [28, 29]. Межмолекулярные и межсубъединичные контакты были определены с использованием программы CONTACT комплекса ССР4 и PISA [27, 28].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Биологически активной формой аспарагиназы является гомотетрамер, состоящий из двух димеров. Каждый димер содержит два активных центра, в формировании которых участвуют обе субъединицы димера. Независимая часть ячейки ромбических кристаллов (пр. гр. P22₁2₁) содержит один из димеров тетрамерной молекулы фермента, а моноклинных кристаллов (пр. гр. P2₁) – тетрамер.

Как и в других белках семейства аспарагиназ, на N-конце полипептидной цепи каждой субъединицы молекулы имеется консервативный участок TGGTIAG. N-концевые аминокислотные остатки (10–31 в WASm) образуют подвижную петлю, ограничивающую активный центр. В подвижной петле расположены два остатка, принимающие участие в катализе. В аспарагиназе Wolinella succinogenes это Thr14 и Tyr27 [16]. Как и в большинстве пространственных структур L-аспарагиназ, не все аминокислотные остатки подвижной петли были выявлены на картах электронной плотности. В молекуле апо-формы WASm ромбических кристаллов, так же как и ранее в моноклинных, не были локализованы остатки Glu23 и Thr24, где проведены замены, а также каталитически важный остаток тирозина (Tyr27).

Чтобы изучить особенности упаковки молекул фермента в обеих кристаллических модификациях, были проанализированы строение тетрамерных молекул апо-формы аспарагиназы WASm, внутримолекулярные и межмолекулярные контакты в обеих кристаллографических группах. При совмещении пар субъединиц тетрамерной молекулы апо-формы (пр. гр. P2₁) по Сα-атомам среднеквадратичное отклонение RMSD_сред колеблется в пределах 0.091–0.120 Å, максимальное отклонение (до 1.295 Å) наблюдается только для остатков подвижных петель. Конформация аминокислотных остатков активных центров во всех четырех независимых субъединицах в структуре P2₁ одинакова.

При совмещении двух независимых субъединиц A и B апо-формы WASm ромбической модификации (пр. гр. P22₁2₁) по Сα-атомам RMSD_сред = = 0.301 Å, максимальные отклонения (до 6.843 Å) наблюдаются для петли 266–294, один из аминокислотных остатков которой, Glu287, входит в активный центр субъединицы. В субъединицах A и B конформации петель 266–294 существенно различаются. При совмещении димеров AB молекул двух кристаллических модификаций (пр. гр. P22₁2₁ и P2₁) по Cα-атомам RMSD_сред составляет 0.270 Å. Максимальные значения RMSD (7.101 и 7.090 Å) наблюдаются для остатков Ala286 и Glu287 субъединиц B (Glu287 – один из остатков активного центра молекулы). Положения аминокислотных остатков Glu287 в субъединицах A обеих структур практически совпадают. Поскольку Glu287/A является одним из остатков, формирующих активный центр субъединицы B, строение активных центров субъединиц B в рассматриваемых структурах разных модификаций одинаковое. В субъединицах A молекул из разных структур строение активных центров различно, так как в активный центр субъединицы A входит остаток Glu287 субъединицы B из петли, положение которой в ромбической модификации существенно отличается от положения аналогичной петли субъединицы B в пр. гр. P2₁ (рис. 1).

Рис. 1.

Активные центры субъединиц A при совмещении димеров AB молекул мутантной аспарагиназы двух кристаллических модификаций: P22₁2₁ (черный цвет), P2₁ (серый).

Анализ полярных контактов молекул аспарагиназы в апо-формах обеих кристаллических модификаций показал, что внутримолекулярные полярные контакты практически эквивалентны в отличие от контактов межмолекулярных. Межмолекулярные полярные контакты в двух кристаллических модификациях представлены в табл. 2 и 3. На рис. 2а изображена независимая тетрамерная молекула кристаллической модификации P2₁ в окружении контактирующих с ней молекул; на рисунке выделены аминокислотные остатки, образующие полярные контакты с соседними молекулами в кристаллической ячейке. В модификации P2₁, когда в независимой части ячейки содержится тетрамерная молекула, все субъединицы молекулы вовлечены в межмолекулярные контакты в разной степени (табл. 2). Площадь поверхности остатков тетрамерной молекулы, участвующих в межмолекулярных контактах, равна 2172.9 Ų. Число остатков – 94, из них принимающих участие в образовании 18 полярных контактов – 28.

Рис. 2.

Независимая тетрамерная молекула кристаллической модификации пр. гр. P2₁ в окружении контактирующих с ней молекул (а) и тетрамерная молекула кристаллической модификации пр. гр. P22₁2₁ в окружении соседних димеров (б). Выделены аминокислотные остатки, образующие полярные контакты с соседними молекулами в кристаллической ячейке.

Тетрамерная молекула в кристалле пр. гр. P22₁2₁, состоящая из двух димеров, связанных кристаллографической осью второго порядка, представлена на рис. 2б в окружении соседних димеров. Площадь поверхности остатков димера молекулы, участвующих в межмолекулярных контактах, равна 2182.3 Ų. Число остатков – 87, из них принимающих участие в образовании 20 полярных контактов – 30. Так как молекула (тетрамер) в этой кристаллической модификации формируется с помощью кристаллографической оси второго порядка, площадь контактов и количество остатков удваиваются. Упаковка молекул в кристаллах пр. гр. Р22₁2₁ более компактная, чем в P2₁. Коэффициенты Метьюса [30] для структур соответственно равны 1.95 и 2.22 ų/Да, что свидетельствует о большей доли растворителя в моноклинной структуре (44.53%), чем в ромбической (36.95%).

В обеих кристаллических формах можно отметить одни и те же аминокислотные остатки, участвующие в образовании полярных межмолекулярных контактов (Ser57, Lys82, Lys211, Glu262, Lys292, Glu321). Но все эти остатки тетрамерных молекул в кристаллах разных модификаций образуют, как правило, полярные контакты не с одинаковыми аминокислотными остатками соседних молекул, связанных с исходной элементами симметрии. Так, если в модификации пр. гр. P22₁2₁ можно отметить формирование пар полярных связей Lys82/A (x, y, z)–Asn138/B (x – 1, –y, ‒z + 1), Asn138/A (x, y, z)–Lys82/B (x – 1, –y, –z + 1) и Lys211/A (x, y, z)–Asp319/B (x – 1, y, z), Asp319/A (x, y, z)–Lys211/B (x – 1, y, z), то в пр. гр. P2₁ Lys82/D (x, y, z) контактирует с Asp46/A (x – 1, y, z) или Lys82/A (x – 1, y, z) – с Lys143/D (x, y, z). В обеих модификациях контакты между одинаковыми остатками образуются только в следующих случаях. Остаток Glu262 контактирует с Ser57 (OE1_ Glu262/A (x, y, z)–OG_Ser57/C (–x, y – 1/2, –z + 1), пр. гр. P2₁), (OE1_Glu262/B (x, y, z)–N_Ser57/B (‒x, y – 1/2, –z + 1/2), пр. гр. P22₁2₁), а остаток Glu321 – с Lys292 (OE1_Glu321/B (x, y, z)–NZ_Lys292/A (–x, y – 1/2, –z + 1/2), пр. гр. P22₁2₁), (OE2_Glu321/A (x, y, z)–NZ_Lys292/D (‒x, y – 1/2, –z + 1), пр. гр. P2₁).

На рис. 3 представлены упаковки молекул в обеих кристаллических модификациях. В кристаллах Р22₁2₁, в которых ось симметрии второго порядка тетрамерной молекулы совпадает с кристаллографической осью симметрии 2, молекулы фермента образуют сплошные каналы вдоль оси a кристаллической ячейки, т.е. вдоль оси симметрии второго порядка кристалла (рис. 3а). Поверхность канала формируется спиралями 32–40, 42–48 и петлями 54–59 субъединиц молекул, связанных осью симметрии 2, а также спиралями 229–238, 255–267 субъединиц молекул, полученных в результате преобразований симметрии с помощью винтовых осей 2₁, расположенных вдоль осей b и c кристаллической ячейки. Размеры полости канала оценены по расстояниям между Cα-атомами остатков, расположенных на поверхности канала и связанных осью симметрии 2. Поперечное сечение канала имеет вытянутую форму, наименьшее расстояние (10.18 Å) наблюдается между атомами Cα остатков Ala39 (x, y, z) и Val32 (x, –y + 1, –z + 1), а между более удаленными областями канала, связанными осью 2, наименьшее расстояние 38.37 Å – между остатками Gly249. На рис. 4а представлены четыре молекулы и их активные центры, ближайшие к поверхности канала (пр. гр. P22₁2₁). Активные центры молекул расположены на поверхности каналов и в основном доступны для молекул растворителя. Однако в молекулах, связанных преобразованием симметрии –x, y – 1/2, –z + 1/2, два остатка активного центра Gln61/A (x, y, z) и Glu287/A (–x, y – 1/2, ‒z + 1/2) принимают участие в межмолекулярных контактах. Эти остатки в другой кристаллической форме (пр. гр. P2₁) образуют межсубъединичные полярные связи в димерах молекулы.

Рис. 3.

Упаковки молекул WASm в двух кристаллических модификациях: а – пр. гр. P22₁2₁, б – пр. гр. P2₁.

Рис. 4.

Четыре молекулы фермента и их активные центры, ближайшие к поверхности канала: а – пр. гр. P22₁2₁, б – пр. гр. P2₁.

В кристаллах моноклинной модификации (пр. гр. P2₁) можно выделить каналы, которые образуют молекулы, связанные кристаллографической осью симметрии 2₁, направленной вдоль оси b, и трансляциями вдоль осей b и c кристаллической ячейки. Ось канала направлена вдоль оси a ячейки кристалла (рис. 3б). Поверхность канала формируется спиралями 31–40, 42–47 субъединиц A и D молекулы (x, y, z), спиралями 31–40, 42–47 субъединиц C и B молекулы, полученной преобразованием (x, y, z – 1), спиралями 229–238 и 255–267 субъединицы A молекулы (–x, y + 1/2, ‒z, кристаллографическая ось 2₁), спиралями 229–238 и 255–267 субъединицы C молекулы (–x, y – 1/2, –z). Каналы в кристаллических решетках обеих модификаций сходны по форме. В модификации пр. гр. P2₁ наименьшее расстояние (17.62 Å) фиксируется между атомами Cα остатков Ala39 субъединиц A и C, расположенных на расстоянии трансляции вдоль оси с; для удаленных областей канала наименьшее расстояние 34.32 Å – между остатками Lys241 субъединиц A и C молекул, формирующих полость канала и находящихся на расстоянии трансляции вдоль оси b. Таким образом, в кристаллах пр. гр. P2₁ канал имеет больший размер, чем в кристаллах пр. гр. P22₁2₁.

На рис. 4б представлены молекулы фермента, образующие канал, и ближайшие к поверхности канала активные центры. Анализ внутримолекулярных и межмолекулярных взаимодействий с помощью программы PISA показал, что активные центры молекул в обеих кристаллических модификациях доступны для растворителя.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Рассмотрены упаковки молекул и описаны межмолекулярные контакты в двух кристаллических модификациях мутанта L-аспарагиназы Wolinella succinogenes (WASm). Площадь поверхности остатков тетрамерной молекулы, участвующих в межмолекулярных контактах, равна 2172.9 Ų в моноклинных кристаллах и 4364.6 Ų – в ромбических. Число полярных взаимодействий в ромбической форме кристаллов значительно больше, чем в моноклинной. Обе формы различаются по содержанию воды; доля растворителя в моноклинной структуре 44.53%, в ромбической 36.95% (коэффициенты Метьюса [30] для структур соответственно равны 1.95 и 2.22 ų/Да). Таким образом, упаковка ромбической формы более плотная. В обеих кристаллических решетках описаны заполненные растворителем каналы. Показано, что аминокислотные остатки активных центров молекул в обеих модификациях доступны для растворителя.

Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования РФ в рамках Государственного задания ФНИЦ “Кристаллография и фотоника” РАН.