Кристаллография, 2020, T. 65, № 5, стр. 770-773

ВВЕДЕНИЕ

Трансаминазы (TА; аминотрансферазы; EC 2.6.1.) катализируют обратимый стереоселективный перенос аминогруппы с аминосубстрата на кетон/кетокислоту/альдегид с образованием хирального амина/аминокислоты и нового кетосоединения [1]. В клетках всех организмов ТА являются ключевыми ферментами метаболизма аминокислот. Помимо фундаментальной функции ТА находят широкое применение в биотехнологии, в частности в синтезе оптически активных аминов и неприродных аминокислот и в стереоселективном аминировании органических соединений [2–5].

Среди многообразия ТА ферменты, принадлежащие IV типу укладки (суперсемейство D-аланинтрансаминаз), исследованы меньше всего и представлены тремя различными по свойствам и структуре семействами: трансаминазами D-аминокислот (специфичны к D-аминокислотам), трансаминазами разветвленных аминокислот – BCAT (специфичны к гидрофобным L-Leu, L-Val и L-Ile) и (R)-амин-трансаминазами (специфичны к R-аминам и кетонам). Недавно были обнаружены TA смешанного типа (mixed-type TA) [6–8], для которых характерна активность, свойственная всем перечисленным выше семействам. Такие ферменты отличаются заменами в консервативных для ТА мотивах активного центра, создающими возможность связывания в одном активном центре различных по строению и заряду субстратов. Указанное свойство делает актуальным поиск таких ферментов в новых геномных библиотеках для последующего создания на их основе биокатализаторов. Особую важность приобретает поиск ТА в термофильных и гипертермофильных организмах, например в археях, так как в данном случае искомый белок заведомо будет обладать повышенной термостабильностью, необходимой при биотехнологическом применении.

Одним из таких ферментов является термостабильная ТА из археи Thermoproteu suzoniensis (TUZN1299, EC 2.6.2.42). В [9] была установлена пространственная структура данного фермента с разрешением 2.0 Å и проведена его функциональная характеристика, показавшая высокую термостабильность фермента и необычно широкую для ВСАТ субстратную специфичность. В частности, TUZN1299 был активен как с гидрофобными природными разветвленными L-аминокислотами и их линейными аналогами, так и с положительно-заряженными L-аминокислотами.

В настоящей работе получена пространственная структура TUZN1299 в комплексе с неприродным линейным субстратом – L-норвалином, с разрешением 2.15 Å. Анализ структуры позволяет установить преимущественную конформацию лиганда, несмотря на неполную его заселенность, и остатки, принимающие участие в координации L-норвалина. Полученная структура дополняет немногочисленные структурные данные о комплексах ТА с субстратами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Очистка и выделение белка. Получение кристаллов комплекса с L-норвалином. Очистку и выделение TUZN1299 проводили по протоколу, описанному в [9]. Белок концентрировали до 10 мг/мл при помощи концентраторов Millipore для последующей кристаллизации.

Кристаллы комплекса TUZN1299 с L-норвалином получали методом настаивания кристаллов холо-формы фермента в 50 мМ растворе субстрата в течение 6–12 ч. Кристаллы холо-фермента получали согласно методике, описанной в [9].

Сбор и обработка дифракционных данных. Решение и уточнение структуры. Перед сбором рентгенодифракционных данных кристаллы вылавливали петлей и переносили в криораствор, содержащий кроме компонентов, входящих в противораствор, 25% глицерина, после чего кристалл в петле замораживали в парах азота. Дифракционные наборы собирали при температуре 100 K на станции BL41XU синхротронного источника SPring-8 (Япония). Дифракционная картина фиксировалась детектором Pilatus6M-F. Для расчета стратегии сбора данных использована программа HKL2000 [10], предложившая следующие параметры: длина волны 0.7 Å, угол вращения 144°, угол качания 0.3°, расстояние кристалл–детектор 600 мм. Набор дифракционных данных обработан с использованием программ XDS и XSCALE [11]. Статистика набора данных приведена в табл. 1.

Решение структуры проведено методом молекулярного замещения при помощи программы MOLREP [12]. В качестве стартовой модели использовали установленную ранее структуру холо-формы TUZN1299 (код PDB_ID: 5CE8). Кристаллографическое уточнение структуры проведено с использованием программ Refmac5 [13] и Coot [14] до достижения R-факторами следующих значений: R_work = 18.7, R_free = 23.4 (табл. 2).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Кристаллы TUZN1299 принадлежат пр. гр. P3₁12. В независимой части элементарной ячейки кристалла содержатся три субъединицы белка. При попарном сравнении субъединиц между собой по Сα-атомам RMSD не превышает 0.2 Ų.

Общая архитектура субъединицы TUZN1299 в комплексе с норвалином не отличается от таковой для холо-формы фермента (PDB_ID: 5СЕ8), RMSD не превышает 0.3 Ų. В активном центре фермента находится кофактор – пиридоксальфосфат (PLP). Электронная плотность характерных для норвалина размеров обнаружена в каждой из субъединиц независимой части элементарной ячейки с si-стороны кофактора в непосредственной близости от него. Проведенный разностный синтез электронной плотности позволил сделать вывод о том, что L-норвалин ковалентно связан с кофактором и вместе они образуют внешний альдимин (рис. 1). Следует отметить, что во всех субъединицах молекула L-норвалина имеет половинную заселенность, что, по-видимому, связано с нефизиологичностью кристаллизационных условий. Наиболее удачным оказалось описание электронной плотности в активном центре TUZN1299 в виде смеси (с половинной заселенностью) ковалентно связанного с норвалином внешнего альдимина и внутреннего альдимина, связанного с каталитическим лизином Lys150. Тем не менее на основании полученных структурных данных можно сделать вывод о том, что основными мотивами, участвующими в координации норвалина, являются следующие (рис. 1): молекула PLP (образуется ковалентная связь между атомом C4 и атомом азота основной цепи норвалина); боковая группа остатка Tyr91; атомы азота основной цепи остатков Ala249 и Ala250 (взаимодействие осуществляется через консервативную молекулу растворителя). Три последних остатка координируют карбоксильную группу субстрата в P-кармане, при этом его алифатическая группа, находящаяся в О-кармане, никак не фиксирована, что выражается в размытой электронной плотности в этом месте. Последний факт достаточно логичен, так как известно, что О-карман BCAT-трансаминаз ответственен за активность с различными типами субстратов (substrate promiscuity) за счет содержания характерных аминокислот для связывания как заряженных, так и гидрофобных групп [1]. В случае с норвалином наличие гидрофобных аминокислот Ile103*, Leu105*, Phe31 и Phe121, по-видимому, способствует связыванию алифатической группы субстрата в О-кармане (звездочка обозначает остатки из второй субъединицы активного димера фермента, активный центр ТА всегда образован остатками от двух субъединиц).

Рис. 1.

Стереоизображение структуры активного центра ТА TUZN1299. Показана молекула L-норвалина, ковалентно связанная с кофактором. Синтез Fo–Fc показан сетчатой поверхностью (уровень срезки 3σ).

При связывании норвалина происходит поворот плоскости кольца молекулы PLP относительно оси, проходящей через N1- и С6-атомы, в сторону связываемого субстрата (сдвиг между соответствующими С4А-атомами составляет порядка 1.4 Å). Поворот кольца сопровождается изменением конформации остатков Arg139, Glu184 и Tyr155, при этом OH-атом последнего, как и в случае холо-формы, имеет короткую водородную связь с атомом O3PLP [9], что характерно и для других ферментов этого класса [6, 8].

Положение и конформация остальных остатков активного центра при связывании субстрата остались неизменными по сравнению со структурой холо-формы фермента (рис. 2).

Рис. 2.

Наложение остатков активного центра комплекса TUNZ1299 с L-норвалином (показана нумерация остатков) на остатки холо-формы фермента (код PDB – 5CE8).

Работы по экспрессии и выделению белка, а также уточнению пространственной структуры выполнены при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 19-14-00164), кристаллизация и рентгеноструктурный эксперимент выполнены при поддержке Федерального космического агентства (проект КЭ (ЦР) “Кристаллизатор”), работы по анализу полученной структуры выполнены при поддержке Министерства науки и высшего образования РФ в рамках Государственного задания ФНИЦ “Кристаллография и фотоника” РАН.