Микробиология, 2023, T. 92, № 2, стр. 233-239

Содовые озера южной Сибири уже несколько десятилетий являются классическим объектом изучения микробных сообществ, адаптированных к жизни в полиэкстремофильных условиях – при повышенных значениях рН и высокой минерализации с преобладанием натриевых солей карбоната/бикарбоната (Труды…, 2007; Sorokin et al., 2014, 2015c). Гидрохимический режим озер этого типа в континентальных районах с умеренным климатом крайне нестабилен и напрямую зависит от меняющихся климатических параметров, наблюдаемых в разные сезоны и годы (среднемесячное количество осадков, температурный режим и т.д.). Недавно опубликованы метагеномные и метатранскриптомные исследования таксономического и функционального разнообразия микробных сообществ содовых озер, локализованных на разных континентах (Vavourakis et al., 2018; Zorz et al., 2019; Banda et al., 2021; Pellegrinetti et al., 2022). Эти работы демонстрируют, с одной стороны, высокое сходство географически далеких галоалкалофильных сообществ, а с другой – значительное влияние солености на их состав и функционирование.

Терминальная фаза разложения органического вещества в содовых озерах происходит преимущественно при участии сульфатредуцирующих микроорганизмов, активность которых определяется как высокой продуктивностью содовых озер, так и содержанием сульфатов, часто превышающим их концентрацию в морских место-обитаниях (Sorokin et al., 2011). Однако повышенное содержание метана, наблюдаемое в осадках многих содовых озер, свидетельствует о протекании также и активных процессов метаногенеза (Sorokin et al., 2015a). В содовых озерах выявлены все четыре известные катаболические пути образования метана: гидрогенотрофный, ацетокластический, метилотрофный и миксотрофный (метил-редуцирующий), причем общая соленость и температура являются ключевыми факторами, определяющими активность метаногенных архей в этих экосистемах (Sorokin et al., 2015a, 2022).

Наряду с метаногенами, в содовых озерах обнаружены алкалофильные метанотрофные бактерии, осуществляющие процесс окисления метана (Khmelenina et al., 2000; Sorokin et al., 2014, 2015с). Наиболее активен этот процесс в содовых озерах при значениях рН 9–10 и концентрации ионов Na⁺ ниже 1.5 М. В аэробном поверхностном слое осадков таких озер обычно доминируют метанотрофы I типа, относящиеся к группе гаммапротеобактерий Methylomicrobium‒Methylotuvimicrobium, способные сохранять метаболическую активность при низком содержании кислорода. В последние годы метанотрофные бактерии I типа детектируются молекулярными методами в восстановленных осадках и бескислородных водах меромиктических водоемов. Предполагается, что в таких условиях для окисления метана метанотрофы могут использовать другие акцепторы электронов, помимо кислорода (нитраты, нитриты), и/или поддерживать активность при тесном взаимодействии с оксигенными фототрофами (см. обзор Каллистова и соавт., 2017 и ссылки в нем).

Таким образом, по имеющимся на сегодняшний день данным в осадках содовых озер с умеренной соленостью (до 100 г/л) происходят активные процессы круговорота метана, в котором участвуют разнообразные метаногенные археи и метанотрофные бактерии I типа.

В последние годы стали появляться работы, которые связывают образование метана в аэробной водной толще различных озер с прямой конверсией углекислоты в метан оксифототрофами (см. обзор Bižić et al., 2020 и ссылки в нем; Thottathil et al., 2022). Возможность протекания такого процесса в содовых озерах в настоящее время не выявлена. Напротив, для низкоминерализoванного (около 8 г/л) меромиктического содового озера Соначи (Восточно-Африканская рифтовая долина, Кения), где в аэробных слоях воды на фоне цианобактериального цветения обнаружена необычайно высокая концентрация биогенного метана (до 156 мкмоль/л), было показано, что его образование связано с развитием гидрогенотрофных и ацетокластических метаногенов во взвешенных частицах (Fazi et al., 2021). Отмечая связь высокой концентрации метана с цветением цианобактерий, авторы этой работы не анализировали суточную динамику содержания метана в воде. Таким образом, вопрос о концентрациях, продуцентах и закономерностях появления метана в воде содовых озер остается практически неизученным.

В этой связи целью нашей работы стало изучение in situ суточной динамики метана в цианобактериальных сообществах мелководного содового озера Горчина 1 в Кулундинской степи и поиск корреляций с динамикой численности прокариот, вовлеченных в процессы образования и окисления метана.

Озеро Горчина 1 (51°40′19′′ N 79°54′20′′ E) входит в группу из четырех небольших озер, окруженных сосновым бором и расположенных в Михайловском районе Алтайского края. Экспериментальную работу проводили в начале июля 2019 г. Соленость определяли портативным рефрактометром ATAGO ATCS/MillE (Япония), значения рН – с помощью полевого потенциометра-кондуктометра “WTW” (Германия). Общую карбонатную щелочность определяли методом титрования 1 M раствором HCl. Интенсивность освещения измеряли с помощью люксметра ТКА-ЛЮКС (НТП “ТКА”, Россия). Объектом исследования служило придонное фототрофное сообщество, развивавшееся на мелководье у уреза воды (рис. 1). Образцы биомассы отбирали в течение суток в 00:00, 04:00, 08:00, 12:00, 16:00 и 20:00. В каждой точке времени биомассу брали непосредственно из озера в одной и той же локации.

Рис. 1.

Содовое озеро Горчина 1 в июле 2019 г.: (а) – общий вид; (б) – рыхлое придонное фототрофное сообщество. Стрелками отмечена исследованная фототрофная биомасса: локализация относительно береговой линии (а); общий вид биомассы, использованной для измерений (б).

Морфологическое разнообразие фототрофных микроорганизмов в природных образцах изучали в нативных препаратах под световым микроскопом Jenaval (“Carl Zeiss”, Германия). Идентификацию доминирующих цианобактерий производили морфологически с учетом генетических данных, полученных нами как ранее (Namsaraev et al., 2018), так и в данном исследовании. Содержание хлорофилла а (хлф а) в биомассе определяли аналогично предыдущим исследованиям (Namsaraev et al., 2018).

Для измерения содержания метана 1 мл биомассы фототрофного сообщества (в двух повторностях для каждой точки времени) помещали в пенициллиновый флакон объемом 20 мл, сразу фиксировали формалином в конечной концентрации 3.7% и герметично закрывали резиновой пробкой с алюминиемым колпачком. Фиксированные образцы транспортировали в лабораторию, где измеряли содержание метана на хроматографе Кристалл-2000-М (ЗАО СКБ “Хроматэк”, Россия) с пламенно-ионизационным детектором. Полученные значения пересчитывали в нмоль CH₄/см³ с учетом объема газовой фазы пенициллинового флакона.

Образцы фототрофного сообщества для экстракции ДНК и получения метагеномов отбирали одновременно с остальными. Биомассу помещали во флаконы объемом 60 мл, хранили и транспортировали в лабораторию в охлажденном виде. Выделение тотальной ДНК из природных образцов, а также последующий метагеномный анализ проводили по ранее описанной методике (Yakimov et al., 2022). Долю отдельных представителей прокариот в микробном сообществе вычисляли по соотношению покрытия прочтениями их геномов.

Статистический анализ данных (средние значения ± стандартные отклонения, коэффициенты корреляции Спирмена (ρ)) проводили с использованием он-лайн калькулятора: https://ncalculators.com/statistics/.

Общая соленость воды озера в момент проведения исследования составила 30 г/л, общая щелочность – 0.4 моль-экв/л, значение рН – 10.52. По данным многолетних наблюдений (2005‒2022 гг.) для озера Горчина 1 характерен широкий диапазон изменений общей солености (30‒400 г/л) и общей щелочности (0.4‒5.9 моль-экв/л). До 2018 г. рапа озера соответствовала статусу гиперсоленого водоема с общим содержанием солей более 85 г/л (Namsaraev et al., 2018). Но в 2018 г. мы наблюдали сильное распреснение, когда общая соленость снизилась до 30 г/л, что повлекло за собой значительные изменения в составе фототрофных сообществ (Горленко и соавт., 2020). В 2019 г. общая соленость не изменилась, и озеро второй год наблюдений находилось в стадии минимальной минерализации за весь многолетний период мониторинга.

В день проведения измерений стояла малооблачная погода, и интенсивность солнечного освещения в течение суток изменялась от 0 до 96.3 клк (рис. 2). В первой половине дня (в 08:00 и 12:00) в точке сбора образцов в планктоне озера наблюдали цветение цианобактерий с доминированием Limnospira (Arthrospira) fusiformis и Anabaenopsis issatchenkoi, которое исчезло во второй половине дня (16:00 и 20:00) и отсутствовало ночью и ранним утром (0:00, 4:00). На дне вдоль береговой линии наблюдали скопление толстого слоя рыхлой фототрофной биомассы с преобладанием бентосных цианобактерий (рис. 1) и доминированием негетероцистных нитчатых Nodosilinea sp., Sodalinema (ранее Geitlerinema) sp. и гетероцистных cf. Trichormus sp. Метагеномный анализ показал, что доля цианобактерий в анализировавшихся микробных сообществах в течение суток варьировала от 17.32 до 32.11% (табл. 1), при этом преобладали геномные последовательности, принадлежащие Nodosilinea sp. (от 14.93 до 21.48%). Относительная численность цианобактерий в образцах, собранных в разное время суток, значимо коррелировала с интенсивностью солнечного света (ρ = 0.7263), что может говорить об активной поведенческой адаптации этих оксигенных фототрофов к изменениям физико-химических условий в течение дня. Интересно, что в образцах не выявлено значимой линейной корреляции между численностью цианобактерий и содержанием хлф а (ρ = ‒0.3553), что может быть объяснено как вкладом эукариот (в образцах обнаружены эвгленовые водоросли), так и присутствием неактивного (“мертвого”) хлорофилла или его производных.

Рис. 2.

Содержание метана и относительная численность метаногенных архей (1) и метанотрофных бактерий (2) в придонной фототрофной биомассе озера Горчина 1 в течение суток (июль 2019 г.). В точке 04:00 метагеномный анализ не проводили (н/д – нет данных). Относительная интенсивность освещения приведена вне осей ординат и отражает изменение интенсивности солнечного освещения в течение суток, где минимальное значение соответствует 0 клк (00:00, полночь), а максимальное – 96.3 клк (12:00, полдень) (подробнее см. в табл. 1).

Важно отметить, что, несмотря на доминирование нитчатых цианобактерий, в озере не происходило образования слоистых цианобактериальных матов, аналогичных галофильным. Биомасса исследуемого цианобактериального сообщества была рыхлой и достаточно однородной, то есть не имела резких физико-химических градиентов, которые обусловлены слоистостью бентосных микробных матов. Кроме того, развитие этого рыхлого сообщества происходило на мелководье недалеко от уреза воды (рис. 1). Глубина озера здесь составляла всего несколько сантиметров, что позволяет предположить в целом аэробные условия в дневное время. Визуальных изменений в придонной фототрофной биомассе в течение дня не наблюдали. Содержание хлф а в образцах не коррелировало с интенсивностью солнечного света (ρ = 0.0475), что позволило нам использовать этот критерий для количественных оценок биомассы. Ее плотность в собранных образцах имела сопоставимые значения (табл. 1) и составляла в среднем 46.8 ± ± 11.8 мкг хлф а/см³.

Содержание метана в образцах придонной фототрофной биомассы изменялось в течение дня (рис. 2, табл. 1). Ночью и ранним утром оно составляло в среднем 42.2 ± 2.5 нмоль CH₄/см³. Утром в 8:00 был зафиксирован пик (202.4 ± 3.1 нмоль CH₄/см³), после чего произошло резкое снижение содержание метана в придонной биомассе, которое в 12:00 и 16:00 составило в среднем 3.8 ± 2.3 нмоль CH₄/см³. Вечером в 20:00 содержание метана снова увеличилось (28.9 ± 5.4 нмоль CH₄/см³), хотя еще не достигло ночных и раннеутренних значений. Содержание метана и хлф а в образцах линейно не коррелировало (ρ = 0.03358), т.е. изменения в содержании метана нельзя напрямую связать с разной плотностью образцов (разной биомассой сообщества в 1 мл образца). Отметим, что содержание метана имело умеренную отрицательную корреляцию с численностью цианобактерий (ρ = ‒0.6484), то есть наши данные не позволяют линейно связать выделение метана в данном эксперименте с прямой фотосинтетической активностью цианобактерий, как это предполагается для некоторых других экосистем (Bižić et al., 2020; Thottathil et al., 2022).

Метагеномный анализ выявил в изучаемых образцах геномные последовательности, относящиеся к гидрогенотрофным метаногенным археям рода Methanocalculus и метанотрофным бактериям рода Methylotuvimicrobium. Из полученных данных удалось лишь частично восстановить геном Methanocalculus – 22.8% полноты сборки по оценке CheckM (Parks et al., 2015) и 0% контаминации. Полученные фрагменты генома, однако, содержали как частичную последовательность гена 16S рРНК (1040 п.о., 99.9% сходства с Methanocalculus alkaliphilus AMF2^T (Sorokin et al., 2015b); рис. 3), так и частичную последовательность гена mcrA (425 п.о., 98.82% сходства с Methanocalculus alkaliphilus AMF2^T). Более того, полученные фрагменты генома имеют уровень ANI c геномом Methanocalculus alkaliphilus AMF2^T 99.11%, т.е. можно с уверенностью говорить, что выявленный нами организм является штаммом именно этого вида.

Рис. 3.

Филогенетическое дерево, построенное на основании сравнительного анализа последовательностей гена 16S рРНК с использованием алгоритма maximum likelihood и bootstrap анализа (1000 повторов, значения ниже 50% не показаны).

Геном представителя Methylotuvimicrobium удалось собрать более полно (70% полноты сборки; 2.5% контаминации). Фрагментов гена 16S рРНК в нем обнаружить не удалось, однако с помощью программного обеспечения для геномной классификации GTDB-Tk v2 (Chaumeil et al., 2022) он был однозначно классифицирован как представитель рода Methylotuvimicrobium. Этот же вывод подтверждается анализом гена pmoA: 97.54% сходства к “Methylotuvimicrobium buryatense” 5GB1C по фрагменту длиной 448 п.о. Эти два генома имеют уровень ANI 90%, то есть, вероятно, относятся к разным, хотя и близкородственным видам. Стоит отметить, что ближайшие родственники обнаруженных нами метаногенного и метанотрофного микроорганизмов ранее были выделены также из содовых озер (Kaluzhnaya et al., 2001; Sorokin et al., 2015b).

На основе оценки покрытия прочтениями генома представителя рода Methylotuvimicrobium было показано, что в течение суток его доля в микробном сообществе изменялась незначительно (табл. 1) и в среднем составила 0.74 ± 0.11%. Линейная корреляция численности Methylotuvimicrobium с содержанием метана, численностью цианобактерий и интенсивностью солнечного света не выявлена (табл. 1). Доля Methanocalculus в микробном сообществе в течение суток изменялась более выраженно (рис. 2, табл. 1), положительно коррелировала с содержанием метана (ρ = 0.8497) и отрицательно – с относительной численностью цианобактерий (ρ = ‒0.7333). Таким образом, можно предположить, что метан, который содержится в биомассе придонных фототрофных сообществ, не поступает из анаэробных осадков, а производится метаногенными археями, развивающимися непосредственно в составе фототрофного сообщества с доминированием оксифототрофов, в первую очередь цианобактерий.

Полученные нами данные показывают, что активные процессы цикла метана, обусловленные жизнедеятельностью метаногенных архей и метанотрофных бактерий, происходят не только в осадках содовых озер, но и в цианобактериальных сообществах, развивающихся в аэробной воде на мелководье. Причем относительная численность микроорганизмов, участвующих в этих процессах, различна в разное время суток. Ночью в отсутствие фотосинтетической активности в цианобактериальном сообществе складываются микроаэробные‒анаэробные условия, и происходит постепенное увеличение численности метаногенов. По нашим наблюдениям этот процесс начинается после 16:00 и длится до рассвета, при этом в сообществе поддерживается относительно стабильная концентрация метана. Содержание метана в биомассе является результатом баланса процессов его выделения метаногенами, потребления метанотрофами и естественной дегазации в атмосферу. Наши данные не позволяют оценить скорости этих процессов и их вклад в результирующую концентрацию метана. Особо следует отметить пик содержания метана в 8:00, пятикратно превышающий ночные и раннеутренние значения. Причиной его появления может служить выделение диазотрофными цианобактериями водорода, который стимулирует развитие и активность гидрогенотрофных метаногенов рода Methanocalculus. Известно, что сообщества цианобактерий Nodosilinea sp., Sodalinema sp. и cf. Trichormus sp., преобладавших в исследованных образцах, способны к светозависимой азотфиксации (Namsaraev et al., 2018). Физико-химические условия, сложившиеся в утреннее время должны быть благоприятны для такого рода взаимодействия: интенсивность солнечного света постепенно увеличивается и активирует светозависимую фиксацию азота цианобактериальным сообществом, но, вместе с тем, еще не происходит насыщения воды фотосинтетическим кислородом в той степени, которая способна ингибировать активность метаногенов, развивающихся, преимущественно, в анаэробных микронишах. Такое ингибирование, по-видимому, могло наступить к полудню, когда интенсивность солнечного света достигла пика, а относительная численность цианобактерий в сообществе увеличилась. Одновременно с этим произошло снижение концентрации метана в биомассе фототрофного сообщества вследствие аэробного окисления метана метанотрофами рода Methylotuvimicrobium.

Представленные в данной работе результаты и объяснения натурных наблюдений носят предварительный характер и, безусловно, в дальнейшем требуют получения подтверждений. Кроме того, представляют интерес вопросы, связанные с особенностями суточной динамики микробных процессов при различной солености, которая, как было сказано выше, существенно влияет на состав и функционирование микробных сообществ содовых озер. Работы по изучению суточной динамики микробных процессов в цианобактериальных сообществах содовых озер предполагается продолжить с использованием хроматографических, радиоизотопных и геномных методов.