Микология и фитопатология, 2022, T. 56, № 6, стр. 431-440

ВВЕДЕНИЕ

Alternaria Nees (Dothideomycetes, Pleosporales, Pleosporaceae) – большой род грибов, который, благодаря полиморфизму и нестабильности признаков, в течение многих десятилетий привлекает внимание систематиков и вызывает дискуссии вокруг таксономии и номенклатуры этих грибов. В последнее время серия работ привела к реконструкции молекулярной филогении Alternaria с удовлетворительным уровнем подробности и четкости (Lawrence et al., 2012, 2013, 2014; Woudenberg et al., 2013, 2014; Al Ghafri et al., 2019). В настоящий момент морфологический и филогенетический анализ позволяют говорить о примерно 360 видах рода (Wijayawardene et al., 2020), объединенных в 29 секций, а также несколько монотипических линий, которым статус секций пока не присвоен (Lawrence et al., 2016; Al Ghafri et al., 2019; Gannibal et al., 2022a).

Представители рода Alternaria встречаются почти повсеместно на большом спектре субстратов: чаще на растениях и растительных остатках, реже в почве, находящихся в сырости строительных материалах, а также в воздухе и пыли (Rotem, 1994; Woudenberg et al., 2013). Значительное количество видов Alternaria являются патогенами культурных растений и приводят к существенным экономическим потерям в сельском хозяйстве (Rotem, 1994; Logrieco et al., 2009). Иногда грибы этого рода вызывают болезни человека и животных (Pastor, Guarro, 2008). В результате ревизии было достаточно убедительно задокументировано присутствие в России 31 вида Alternaria с четким таксономическим статусом (Gannibal, 2015). За последние годы было сделано еще несколько находок новых для России видов Alternaria (Gannibal, 2019; Gannibal, Gasich, 2019; Gannibal et al., 2022b), тогда как некоторые видовые эпитеты были переведены в синонимы (Gannibal et al., 2022a).

Идентификация видов Alternaria представляет собой непростую задачу, поскольку многие из них имеют близкие, почти идентичные, морфологические параметры. Кроме того, особенностью видов Alternaria является высокая вариабельность морфологии конидий и конидиеносцев в пределах одной колонии. Определить вид по морфологическим признакам даже специалисту не всегда представляется возможным. Филогенетический анализ ДНК и другие молекулярные методы являются более надежным и информативным инструментом, тем не менее, идентификация по морфологическим признакам остается в большинстве случаев более доступной.

Определительные ключи для микромицетов в последнее время составляются относительно редко. Для Alternaria последнее масштабное руководство по идентификации было издано E.G. Simmons (2007). Для видов Alternaria, встречающихся в России, был опубликован небольшой определитель на русском языке (Gannibal, 2011). За последнее десятилетие систематика рода значительно преобразовалась, поэтому оба определителя существенно устарели. Кроме того, традиционный формат определения не является самым эффективным. Альтернативный электронный интерактивный формат составления ключей по сравнению с традиционным “бумажным” дихотомическим ключом обладает несколькими существенными преимуществами, перечисленными ниже.

1. Многовходовость – определение может начинаться с оценки любого признака и продолжаться любым путем, удобным для пользователя. Алгоритм определения заранее не задан и может быть выбран пользователем в зависимости от набора признаков объекта, которые доступны для наблюдения в конкретном случае. Эта особенность ключа повышает надежность (используются наиболее четкие признаки) и увеличивает скорость за счет использования наиболее характерных признаков, которые могут привести к результату всего за несколько шагов.

2. Политомичность – пользователь после выбора признака видит сразу все возможные его состояния, что повышает удобство и в некоторых случаях определяет правильность выбора. Традиционные дихотомические ключи часто демонстрируют пользователю только один вариант фенотипа (например, вариант “споры овальные” при антитезе “споры иной формы”). Выбор тезы или антитезы при этом может быть неочевиден в случае, если состояние признака близко, но не совпадает с указанным. Перечисление сразу всех состояний признака может уменьшить количество таких приводящих к сомнениям и ошибкам шагов. В случае сомнений пользователь может выбрать сразу несколько состояний. При составлении определителя для видов с широким диапазоном изменчивости также есть возможность прописать сразу несколько возможных состояний признака.

3. Для удобства пользователя после каждого шага (выбора состояния признака) отображается список видов, обладающих выбранными признаками и свойствами, и ведется своего рода обратный отсчет. Это позволяет в нужный момент остановить определение, доведя его до той точности, которая необходима (род, секция, вид).

4. Электронный формат – отсутствие бумажного носителя дает возможность снабжать определитель любым необходимым количеством качественных цветных иллюстраций. Ключ может быть опубликован в сети Интернет и/или может храниться и распространяться при помощи различных электронных или оптических носителей.

5. Редактируемость – электронный ключ может быть оперативно изменен и дополнен без значительных организационных и финансовых затрат, что обеспечивает актуальность и соответствие современной систематике грибов.

Целью настоящей работы являлось составление электронного многовходового политомического ключа для идентификации наиболее распространенных в России секций и видов грибов рода Alternaria.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для включения в определитель были отобраны таксоны, встречающиеся на территории России и представленные более чем одной находкой. Также было включено несколько не обнаруженных в стране, но широко распространенных в мире таксонов – патогенов культурных растений (например, A. bataticola, A. grandis, A. simsimi).

В зависимости от специфичности морфологии максимально низкими таксономическими уровнями, до которых возможно определение, сочли секции (10 секций) и виды (32 вида, включая одну группу из двух видов). Таксоны, определяемые до уровня секции: Infectoriae, Ulocladioides, Pseudoulocladium, Ulocladium, Gypsophilae, Nimbya, Phragmosporae, Pseudoalternaria, Teretispora, Undifilum. Таксоны, определяемые до уровня вида: A. acalyphae, A. calendulae, A. cucumerina, A. dauci, A. porri, A. silybi, A. solani, A. linariae, A. zinniae, A. bataticola, A. grandis, A. simsimi (sect. Porri); A. alternata, A. arborescens, A. gaisen, A. burnsii, A. gossypina + A. longipes (sect. Alternaria, виды даны в соответствии с Woudenberg et al., 2015); A. avenicola, A. eryngii, A. photistica, A. panax (sect. Panax); A. papavericola, A. penicillata (sect. Crivellia); A. chlamydosporigena, A. embellisia (sect. Embellisia); A. brassicae (monotypic lineage); A. brassicicola (sect. Brassicicola); A. japonica (sect. Japonica); A. helianthiinficiens (sect. Helianthiinficientes); A. radicina (sect. Radicina); A. sonchi (sect. Sonchi).

Сначала было выбрано 32 диагностических признака, которые используются в систематике рода и не являются комплексными. Для каждого признака был составлен список возможных состояний (от 2 до 29). Названия признаков и их состояний были переформулированы из традиционной описательной формы в предельно лаконичную и конкретную. Все признаки были составлены как качественные (non numerical), несколько признаков частично дублируют друг друга (например, внешний вид спороношения и длина цепочек спор) (табл. 1). Признаки и их состояния были выбраны таким образом, чтобы позволить определять как грибы непосредственно на естественном субстрате, так и культуры на искусственных питательных средах. В тех случаях, когда состояние признака зависит от субстрата, он был включен в название признака. Так, некоторые микроморфологические признаки можно наблюдать только при культивировании на бедной среде – картофельно-морковном агаре (Simmons, 2007). Некоторые культуральные особенности необходимо фиксировать исключительно на богатой среде – картофельно-сахарозном или картофельно-декстрозном агаре.

Информация о признаках и их состояниях была внесена в специализированную базу данных с помощью программы DELTA Editor (Dallwitz et al., 1999) и сохранена в виде редактируемого файла в формате DELTA – Description Language for Taxo-nomy. Затем в базу данных электронного определителя были внесены названия таксонов и отмечены возможные состояния каждого признака для каждого таксона. Для работы с электронными ключами база данных была транслирована в текстовые файлы specs, items и chars. Созданный таким образом электронный ключ был протестирован – с его использованием осуществлены попытки идентифицировать разными способами каждый из введенных в базу видов Alternaria. Завершением этапа работы стало создание html-страницы для загрузки Java-апплета NaviKey v. 5.01 (Neubacher, Rambold, 2005) и базы данных, обеспечивающих функционирование определителя.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Согласно описанному алгоритму был создан электронный определительный ключ для 32 видов и 10 секций рода Alternaria и размещен в сети Интернет (http://alternaria.ru). Ключ имеет две версии – русскоязычную и англоязычную.

Порядок использования ключа:

1. В левой верхней панели “Доступные признаки” необходимо выбрать признак, который кажется пользователю наиболее легко наблюдаемым и характерным. Выбор признака приведет к появлению в правой верхней панели “Доступные состояния признака” вариантов его состояний.

2. В панели “Доступные состояния признака” выбрать подходящее состояние. При необходимости можно отметить несколько состояний, используя клавишу “Ctrl”. Для подтверждения выбора необходимо кликнуть на кнопку “Выбрать”. Выбор отобразится в левой нижней панели “Выбранные признаки”. При этом в правой нижней панели “Результат идентификации” отобразится список таксонов, обладающих признаком с данным состоянием.

3. Повторять шаги 1 и 2. При возникновении сомнений в правильности выбора признака или его состояния можно отметить признак в левой нижней панели “Выбранные признаки” и удалить его.

4. После того, как в панели “Результат идентификации” останется один таксон либо при исчерпании признаков, которые доступны для наблюдения, работа с ключом прекращается. При уменьшении таксонов-кандидатов до одного рекомендуется выбрать состояния еще одного или нескольких признаков, чтобы убедиться, что они также соответствуют оставшемуся таксону. При наведении курсора на объект с помощью левой кнопки мыши можно просмотреть в отдельном окне все состояния всех признаков, характерных для данного таксона.

В ходе работы с определителем использование опции “показывать признаки только оставшихся объектов” дает возможность отображать в верхних окнах только те признаки и состояния, которые имеют отношение к оставшимся в правом нижнем окне таксонам. Признаки, по которым нельзя дифференцировать оставшиеся таксоны, оказываются скрыты.

В ситуациях, когда для одного признака было выбрано несколько состояний, опция “показывать объекты, подходящие хотя бы по одному признаку” позволяет отображать в правой нижней панели только те объекты, которые соответствуют выбору хотя бы по одному состоянию признака, а не по выбранной комбинации.

Программа NaviKey потенциально позволяет использовать и ряд других опций и функций. В настоящей версии определителя грибов рода Alternaria зависимые признаки и числовые запросы не были использованы, и для всех таксонов все признаки в базе данных имеют привязку к одному или нескольким состояниям, поэтому выбор соответствующих опций (использовать зависимость признаков, принимать более широкие интервалы, принимать перекрывающиеся интервалы) не влияет на ход идентификации. Опция “показывать объекты, не имеющие выбранных признаков” в данном определителе также не функциональна, поскольку для всех таксонов указано хотя бы одно состояние каждого признака.

ОБСУЖДЕНИЕ

Современная систематика сумчатых грибов довольно динамична и в большинстве случаев опирается на комплексный (полифазный) подход, включающий наблюдение морфологических признаков, изучение физиологических свойств и филогенетический анализ. Молекулярно-генетические методы универсальны и позволяют проводить точную и надежную идентификацию таксонов, тогда как наблюдение морфологических признаков трудоемко, требует специальных навыков и не всегда дает однозначное представление о таксономическом статусе исследуемого гриба. По этой причине практика составления и использования определителей утрачивает свою популярность. Однако во многих случаях лаборатории, проводящие рутинные анализы в целях фитосанитарного мониторинга, не располагают техническими и временными возможностями для применения молекулярных методов и нуждаются в доступных руководствах для идентификации организмов по морфологическим признакам. В то же время, даже при проведении молекулярно-генетического анализа, необходима предварительная идентификация гриба для формирования рабочей гипотезы и обоснованного выбора локуса для секвенирования или специфичных праймеров для ПЦР. Поэтому можно предположить, что определительные ключи, заняв свою определенную нишу, не исчезнут полностью.

Идентификация по ключу, если за ней не следует молекулярный или иной анализ, должна завершаться тщательным сравнением образца с имеющимися в литературе описаниями и изображениями вида, который был выбран в ходе определения. Это особенно актуально для грибов рода Alternaria, поскольку многие виды одновременно формируют конидии, сильно отличающиеся по форме и размерам. При идентификации трудно понять, какие конидии стоит считать молодыми, а какие зрелыми, и даже зрелые конидии могут иметь параметры, варьирующие в широком диапазоне значений. По этой причине разные исследователи могут субъективно воспринимать наблюдаемые под микроскопом структуры и их размеры, оценивая все конидии сразу или только наиболее крупные. В разработанном определителе на нужный таксон можно в ряде случаев выйти, выбрав не только наиболее характерные морфологические параметры, но также и близкие к ним значения. Это уменьшает вероятность исключения нужного вида из результатов идентификации, но добавляет в них сходные по морфологии виды.

Для идентификации различных организмов, в первую очередь насекомых и растений (Kuoh, Song, 2005; Brach, Song, 2006; Schneider et al., 2019), но также и отдельных групп грибов и грибоподобных организмов (Chenari Bouket et al., 2015; McTaggart et al., 2017; Petersen et al., 2022), разработано немало электронных ключей с различными вариантами интрефейса, среди которых, по нашему мнению, формат интерактивного определителя с четырьмя окнами наиболее удобен. Некоторые подобные онлайн определители перестали быть доступными из-за отказа большинства разработчиков интернет-браузеров поддерживать Java-апплеты из соображений безопасности. По этой причине представленный в данной статье определитель также может быть использован только оффлайн. Программное обеспечение для создания и использования ключа бесплатное. Также помимо базового англоязычного интерфейса нами было обеспечено создание русскоязычной версии NaviKey v. 5.01. Существуют другие платформы для создания определительных ключей, в том числе коммерческие (Lucid, https://www.lucidcentral.org).

В качестве примера определителя, наиболее сходного с нашим по структуре, можно указать на ключ для идентификации грибоподобных организмов рода Phytophthora de Bary (Ristaino, 2012). База определителя основана на 20 морфологических и культуральных признаках и позволяет идентифицировать 55 видов Phytophthora. Описание каждого вида дополнено фотографиями и рисунками, информацией о географическом распространении и круге хозяев, а также ссылками на депонированные в базе NCBI GenBank нуклеотидные последовательности нескольких генов типовых штаммов. Сходным образом организован ключ для идентификации 78 представителей рода Pythium Pringsh. (Moorman et al., 2014), основанный на 32 морфологических и культуральных признаках, возможные состояния которых дополнены наглядными микрофотографиями и рисунками наблюдаемых структур. Позднее на основе новых знаний о систематике этой группы организмов был разработан более полный ключ, содержащий описание 88 видов Pythium (Chenari Bouket et al., 2015). Приведенные ключи были разработаны для специалистов в области биологии и экологии, не занимающихся таксономией.

Для обучения студентов и аспирантов, а также технического персонала, осуществляющего рутинный фитопатологический анализ, был разработан ключ для идентификации грибов, встречающихся на семенах овощных культур (Pierozzi et al., 2020). В базе определителя всего лишь 11 видов, среди которых три вида Alternaria. Достоинствами ключа являются его простота и наличие иллюстраций. Но в то же время нельзя не отметить малое количество признаков (шесть), по которым ведется определение.

Очевидно, потребность в определительных ключах для идентификации организмов в ближайшее десятилетие сохранится. Интерактивные политомические ключи для решения этой задачи удобнее и эффективнее классических дихотомических предшественников. Поскольку наблюдение морфологии микромицетов обычно подразумевает использование лабораторного оборудования (микроскопы, оборудование для работы с чистыми культурами), то в создании электронных ключей для смартфонов нет большой необходимости. По нашему мнению, более востребованными будут версии ключей для стационарных компьютеров, которые позволят проводить идентификацию микромицетов до уровня родов и секций. Надежная идентификация до уровня вида с помощью такого ключа возможна только для видов с хорошо отличимой морфологией или при условии подкрепления видовой принадлежности молекулярными методами.