Микология и фитопатология, 2023, T. 57, № 2, стр. 134-140

ВВЕДЕНИЕ

Фитопатогенный гриб Rhizoctonia solani Kuhn регистрируется во многих типах почв и вызывает на картофеле комплексное заболевание, проявляющееся в форме сухой язвенной гнили ростков, стеблей и столонов, что приводит к изреживанию, задержке и выпадам всходов этой культуры (Baker, 1970; Carling, Leiner, Westphale, 1989; Wilson et al., 2008). На клубнях картофеля симптомы болезни также многообразны: склероции, углубленная пятнистость и сетчатый некроз, которые приводят к снижению качества и урожайности культуры во всех зонах возделывания. В Западной и Восточной Сибири потери урожая от ризоктониоза достигают 30–45%. Поражение картофеля ризоктониозом в условиях резко континентального климата региона может достигать максимально 67–70.8% при распространенности заболевания на уровне 80–100%, а заселенность клубней склероциями достигает 56.2% (Shaldyaeva et al., 2006; Tsror, 2010).

Перспективное направление в защите картофеля от заболевания – использование препаратов на основе биологических агентов, в первую очередь микроорганизмов, часто обладающих полифункциональным действием. Они стимулируют рост и развитие растений, их устойчивость к абиотическим стрессам и вредным организмам. Использование биопрепаратов на основе микроорганизмов приобретает в современных условиях большое значение и инициирует активный поиск новых, более эффективных штаммов микроорганизмов для подавления патогенов. Появляется все больше доказательств того, что применение микроорганизмов, колонизирующих ризосферу и сами растения (например, бактерии Pseudomonas и Bacillus, грибы арбускулярной микоризы и грибы-эндофиты), имеет высокий потенциал в качестве средств биологической защиты от фитопатогенов, позволяющих снижать заболеваемость и стимулировать рост растений (Wilson et al., 2008). Установлено, что энтомопатогенные грибы Metarhizium и Beauveria находятся в мутуалистических взаимоотношениях с растениями, выступая поставщиками азота, производителями вторичных метаболитов, промоторами роста, антагонистами грибных и вирусных фитопатогенов (Vega, 2018) и могут быть использованы в качестве микопестицидов с перспективой долгосрочной замены синтетических пестицидов (Lednev et al., 2019).

Так, подавление фитопатогенных грибов после обработки растений различными видами грибов родов Metarhizium и Beauveria было показано в следующих системах: Pythium myriotylum и Rhizoctonia solani – растения томатов и хлопчатника (Ownley et al., 2008), Fusarium oxysporum – лук (Flori, Roberti, 1993), мучнистая роса – огурец (Kim et al., 2010), вирус желтой мозаики – тыква (Jaber, Salem, 2014).

Аскомицет Metarhizium robertsii является одним из наиболее распространенных в почве видов энтомопатогенных грибов, поражающий насекомых разных отрядов. Жизненный цикл этого гриба как факультативного сапротрофа включает разные стадии: патогенную, проходящую на насекомых, и покоящуюся, когда конидии гриба попадают во внешнюю среду (почва, различные части растений и др.). Исследования (Hu, Leger, 2002; Bruck, 2010) показали, что на последней стадии гриб способен к колонизации растений и размножению в их ризосфере. Являясь известными энтомопатогенами, в лабораторных условиях грибы рода Meta-rhizium (М. robertsii, М. anisopliae) подавляли фитопатогенные организмы родов Pythium, Fusarium и Rhizoctonia (Ownley et al., 2010; Sasan, Bidochka, 2013). Проведенные нами предварительные полевые испытания Metarhizium robertsii в борьбе с ризоктониозом показали (Tomilova et al., 2020), что предпосадочная обработка клубней картофеля конидиями гриба сдерживает развитие ризоктониоза картофеля в период вегетации в условиях Западной Сибири.

Целью данного исследования было изучение эффективности применения прототипа препарата на основе конидий M. robertsii против ризоктониоза в производственных агроэкосистемах картофеля лесостепи Приобья.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Лабораторные исследования проводили на базе Института систематики и экологии животных СО РАН и Новосибирского ГАУ. Производственные испытания проведены в ЗАО “Приобское” Новосибирской области (2021 г.). Объектами исследований являлись сорт картофеля Ред Скарлет, штамм энтомопатогенного гриба Metarhizium ro-bertsii (изолят Р-72) и возбудитель ризоктониоза Rhizoctonia solani.

В работе использован энтомопатогенный гриб Metarhizium robertsii (штамм Р-72) из коллекции микроорганизмов Института систематики и экологии животных СО РАН Российской академии наук. Штамм выделен из погибших личинок колорадского жука Leptinotarsa decemlineata Say на территории Латвии в 1972 г. (Serebrov et al., 2007). Видовая идентификация гриба проведена на основе секвенирования региона гена фактора элонгации EF1α (Kryukov et al., 2017).

В лабораторных условиях проводили оценку антагонистической активности Metarhizium robertsii в отношении фитопатогенного гриба Rhizoctonia solani по методике совместного культивирования (Sobowale et al., 2010) на картофельно-глюкозном агаре (КГА). Агаровые блоки (диаметр 10 мм) c пятидневной культурой Metarhizium robertsii размещали на расстоянии 3 см от края чашек Петри (диаметр 90 мм). Через 2 сут на противоположную сторону чашек Петри помещали аналогичные блоки Rhizoctonia solani. Контроль содержал только R. solani. Чашки инкубировали при 25°С в темноте. Ингибирование формирования склероциев оценивали по плотности мицелиальных зачатков склероциев при одиночном росте фитопатогена и его совместном культивировании с M. robertsii с фиксацией параметров на 10, 20 и 50-е сут. Плотность мицелия оценивали по интенсивности окраски с помощью программы ImageJ (Abramoff et al., 2004). Эксперимент проводили дважды в шести повторностях.

Производственные испытания прототипа препарата на основе конидий Metarhizium robertsii проводили в ЗАО “Приобское” Новосибирской обл. на участке производства семенного картофеля.

Производственный эксперимент включал три варианта: 1) обработку клубней водой (контроль); 2) обработку клубней грибом M. robertsii; 3) обработку клубней химическим препаратом Эместо квантум (эталон).

Обработку клубней картофеля сорта Ред Скарлет конидиями M. robertsii проводили непосредственно перед посадкой. Использовали малообъемное опрыскивание клубней в производственных контейнерах (расход экспериментального прототипа препарата с титром 5 × 10⁹ кондий/г составил 0.6 кг/т, расход рабочей суспензии – 12 л/т клубней), в контрольном варианте проводили обработку водой (12 л/т), обработку системным инсекто-фунгицидным препаратом Эместо квантум осуществляли в рекомендованной дозе 0.3 л/т с расходом рабочей жидкости 12 л/т. Площадь каждой делянки – 0.5 га. Посадку осуществляли 14.05.2021 механизированным способом с использованием картофелесажалки Grimme GL 34 KG. Посадку клубней проводили на глубину 6–8 см, схема посадки 75 × 20 см. Фрезерование гребней осуществляли Grimme GF 75-4 через 5 сут после посадки для создания прочного рыхлого гребня вокруг клубня.

Перед закладкой эксперимента провели анализ заселенности почвы грибом Rhizoctonia solani методом множественных почвенных таблеток (Henis et al., 1978) с использованием селективной среды (Ko and Hora, 1971). Согласно этому методу, почву просеивали через сито с мешем 2 мм и хранили в картонных коробках. Непосредственно перед работой уровень влажности почвы доводили до 18–22%. Почву запрессовывали в трубки пробоотборника и выкладывали почвенные таблетки (по 15 шт.) на агаризованную среду в чашки Петри в 10-кратной повторности на вариант. Средняя масса таблеток 104–115 ± 1.77 мг. Чашки с таблетками инкубировали при 20–24°С в течение 18–24 ч и просматривали визуально и под микроскопом на присутствие типичного мицелия R. solani.

Пораженность картофеля ризоктониозом учитывали в два этапа (первый учет 15.06.2021 – через пять недель после посадки, фаза всходов; второй учет 08.07.2021 – через семь недель после посадки, фаза бутонизации–цветения). Анализировали по 15 растений в четырехкратной повторности (60 растений на вариант) по методике Франка (Frank, Leach, Webb, 1976) по следующей шкале: 0 баллов – нет поражений; 1 балл – наличие одного поражения длиной менее 25 мм; 2 балла – одно поражение длиной 26–50 мм или несколько мелких поражений длиной менее 50 мм; 3 балла – одно или несколько поражений более 50 мм, но не окольцовывающих стебель; 4 балла – одно или несколько поражений менее 25 мм, окольцовывающих стебель; 5 баллов – одно или несколько поражений длиной более 25 мм, окольцовывающих стебель.

Для каждого растения рассчитывали индекс развития болезни по общепринятой формуле путем суммирования произведений количества стеблей (ростков) на соответствующий балл шкалы и деления на произведение суммы количества стеблей на высший балл шкалы, выраженное в процентах.

На том же материале определяли процент погибших ростков, а также опавших и поврежденных столонов от общего их числа.

Оценку пораженности клубней ризоктониозом проводили с определением склероциального индекса (Shaldyaeva, Pilipova, 1999) по вариантам опыта (урожай с 25 растений в четырехкратной повторности). Склероциальный индекс подсчитывали по формуле: Si = (hу + 3.5l + 5m + 6h)/(с + + hу + 1 + m + h), где с, hу, l, m, h – масса клубней; с – клубни, свободные от ризоктониоза; hу – клубни с мицелиальной формой (в форме сетчатого некроза, углубленной пятнистости); l – клубни поражены в слабой степени (склероции от единичных и занимающих 10% поверхности клубня); m – клубни поражены в средней степени (склероции занимают 25% поверхности клубня); h – клубни поражены в сильной степени (склероции занимают 50% и более поверхности клубня); 3.5, 5, 6 – цифровые коэффициенты формулы, отражающие степень вредоносности отдельных форм проявления ризоктониоза.

В процессе анализа образцов картофеля клубни (не менее 100 шт. на повторность) распределяли по группам (с, hу, 1, m, h), а затем каждую из них взвешивали по отдельности и их массу использовали для подсчета склероциального индекса.

Изучение жизнеспособности склероциев с клубней нового урожая проводили на картофельно-глюкозном агаре (КГА), помещая пять склероциев в чашку Петри по вариантам производственного опыта (контроль, Metarhizium robertsii химический эталон) в 10-кратной повторности. Склероции отделяли с 50 клубней среднего образца из четырех повторностей. Чашки инкубировали при 22–24°С в темноте в течение 5 сут. Жизнеспособность возбудителя оценивали по количеству проросших склероциев и диаметру колоний.

Анализ данных проводили с использованием Statistica 8 (StatSoft Inc., США) и PAST 3 (Hammer et al., 2001). Нормально распределенные данные были проанализированы с помощью однофакторной ANOVA с последующим тестом Тьюки, ненормально распределенные данные – с использованием анализа Крускал–Уоллиса с последующим тестом Данна.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Перед закладкой эксперимента был выполнен анализ фитосанитарного состояния почвы и посадочного материала картофеля. Установлено, что уровень почвенной инфекции был ниже порога вредоносности, однако отмечен высокий уровень пораженности клубней ризоктониозом (распространенность форм ризоктониоза на клубнях составляла 78%, склероциальный индекс – 2.24, табл. 2). Таким образом, исследования проводили на высоком естественном инфекционном фоне пораженности ризоктониозом семенного материала.

При оценке выпадов всходов отмечено значительное снижение количества погибших от ризоктониоза ростков после применения M. robertsii и в варианте с химическим эталоном, различия достоверны в сравнении с контролем (Тест Данна, Р = 0.005). В этот же период отмечено существенное снижение индекса развития болезни (ИРБ) на стеблях в 3.8 раза после обработки M. robertsii по сравнению с контролем (табл. 1).

В фазу цветения (семь недель) максимальный эффект по снижению ИРБ получен после обработки клубней M. robertsii, различия по снижению пораженности стеблей достоверны как по сравнению с контролем, так и с химическим протравителем (Р ≤ 0.0009). Впервые отмечено достоверное снижение количества пораженных (в 3.6 раза) и опавших столонов (в 23 раза) после обработки M. robertsii по сравнению с контролем (Р ≤ 0.003). Применение химического эталона обеспечило достоверное снижение только опавших столонов по сравнению с контролем (в 4.4 раза, Р = 0.004).

Предпосадочная обработка грибом M. robertsii положительно влияла на качество клубней нового урожая. Отмечено существенное увеличение количества здоровых клубней на участке с применением M. robertsii как в сравнении с контролем (Р = = 0.002), так и с химическим препаратом (Р = 0.049). Значения склероциального индекса (Si) как обобщенного показателя пораженности клубней всеми формами ризоктониоза были достоверно ниже контрольных как после химической, так и после обработки грибом (Р ≤ 0.004, (табл. 2). Установлено, что в варианте с M. robertsii количество здоровых клубней увеличилось в 2.5 раза, а количество клубней со склероциями снизилось в 2.8 раза по сравнению с контролем, что в итоге привело к существенному снижению склероциального индекса в 2.4 раза.

Биологическая эффективность применения M. robertsii для снижения ризоктониоза (%) была высокой на всех этапах онтогенеза картофеля и составляла:

Кроме того, в лабораторных экспериментах установлено, что применение M. robertsii снижало жизнеспособность и размеры склероциев Rhioctonia solani, сформированных на клубнях нового урожая. Так, в контрольном варианте количество проросших склероциев составляло 62%, в то время как после применения Metarhizium robertsii только 12% склероциев образовали колонии на агаре с добавлением антибиотиков, рост гриба был слабым, диаметр колоний в 7 раз меньше контрольных. Размеры склероциев, формирующихся на клубнях после обработки энтомопатогенным грибом, были в 1.65 раза меньше контрольных значений.

Результаты дополнительных лабораторных экспериментов показали, что при совместном культивировании М. robertsii вызывал задержку образования склероциев Rhizoctonia solani (рис. 1, 2). При сравнении плотности мицелиальных зачатков склероциев при одиночном росте фитопатогена (рис. 2, а) и его совместном культивировании с Metarhizium robertsii (рис. 2, в) установлено достоверное ингибирование формирования склероциев Rhizoctonia solani в присутствии Мetarhizium robertsii на протяжении всего периода наблюдений (Т-тест, Р ≤ 0.015).

Рис. 1.

Плотность мицелиальных зачатков склероциев Rhizoctonia solani при одиночном росте и совместном культивировании с Metarhizium robertsii. Плотность мицелия измерена по интенсивности окраски колонии (под блоком Rhizoctonia solani) в программе ImageJ. Различные буквы указывают на существенные различия между вариантами (P < 0.05, Т-тест).

Рис. 2.

Сравнительная морфология культуры Rhizictonia solani (а) и совместной культуры фитопатогена с Metarhizium robertsii (б). Плотность мицелия измеряли по интенсивности окраски в области под блоком Rhizoctonia solani с помощью программы ImageJ (10-е сут культивирования).

ОБСУЖДЕНИЕ

Возбудитель ризоктониоза картофеля формирует обильную популяцию склероциев на клубнях (от 9 до 180 на один клубень) и в почве, достигая численности в агроэкосистемах картофеля более 50 пропагул на 100 г (Shaldyaeva et al., 2006). Энтомопатогенный гриб M. robertsii способен колонизировать подземные органы растений, в результате чего происходит стимулирование ряда биохимических процессов в растениях, сопряженных с повышением иммунитета. Многие авторы предполагают ключевую роль метаболитов энтомопатогенных грибов в ингибировании фитопатогенов. Причем влияние грибов на растение может быть опосредовано как воздействием непосредственно метаболитов гриба, так и собственно взаимодействием между грибом и растением (паттерн-распознающие структуры гриба могут выступать в качестве своеобразных элиситоров). Эти предположения были подтверждены в экспериментах с использованием бесклеточных фильтратов культур (Renwick et al., 1991; Bark et al., 1996; Sasan, Bidochka, 2013; Lozano-Tovar et al., 2017).

Для пояснения механизмов полифункционального действия энтомопатогенных грибов ряд авторов выдвигают следующие гипотезы: конкуренцию за субстрат (Ownley et al., 2004, 2008), антагонизм (Collemare et al., 2014; Ríos-Moreno et al., 2016; Garrido-Jurado et al., 2017) и активацию защитных систем растений в результате стресса (Ownley et al., 2010; Maksimov et al., 2015).

Предварительные лабораторные исследования антагонистических свойств штамма M. robertsii свидетельствовали об активном подавлении им гриба Rhizoctonia solani. Так, при длительном совместном культивировании энтомопатогена с R. solani отмечен эффект оплетания гиф и некротизации поверхностного мицелия возбудителя ризоктониоза (Tomilova et al., 2020). Проведенная нами количественная оценка плотности мицелиальных зачатков склероциев R. solani показала достоверное ингибирование формирования склероциев фитопатогена в присутствии Мetarhizium robertsii на протяжении 50-ти суток культивирования.

Впервые в условиях производственных экспериментов установлено, что обработка клубней методом малообъемного опрыскивания суспензией конидий M. robertsii перед посадкой существенно сдерживает развитие ризоктониоза в течение всего вегетационного периода. На фазе полных всходов нами установлено достоверное снижение гибели ростков и индекса развития ризоктониоза на стеблях в результате обработки M. robertsii. В проведенных ранее исследованиях нами было отмечено, что начало колонизации растений грибами сопровождалось достоверным ростом активности защитных ферментов: пероксидазы в тканях корней (в 1.5 раза) и полифенолоксидазы в листьях (Tomilova et al., 2020), что свидетельствует об изменении иммунного статуса колонизируемых растений и соотносится с данными других исследователей (Hirano et al., 2008; Maksimov et al., 2015). Возможно, защитный эффект от ризоктониоза, обусловленный применением M. robertsii, сочетает как антагонистические свойства, так и активизацию защитной системы растения-хозяина.

Инокуляция картофеля энтомопатогенным грибом M. robertsii обеспечивала значительное улучшение семенных качеств полученных клубней в условиях Западной Сибири. Обобщенный показатель проявления заболевания (склероциальный индекс) снижался в 2.4 раза, а распространенность клубней со склероциями – в 2.8 раза по сравнению с контролем (табл. 2). Таким образом, обработка клубней M. robertsii позволит не только снизить ризоктониоз картофеля, но и контролировать распространение фитопатогенного гриба Rhizoctonia solani.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ № 19-14-00138.