Российские нанотехнологии, 2021, T. 16, № 1, стр. 141-146

ВВЕДЕНИЕ

Эффективное функционирование природных экосистем определяется их разнообразием на биосферном, популяционном и видовом уровнях [1]. В настоящее время одними из приоритетных задач являются изучение и практическое использование адаптивной изменчивости и популяционной структуры видов в природоохранной и хозяйственной деятельности человека. В связи с этим большой интерес представляют виды, имеющие значительный географический ареал, широкую экологическую амплитуду условий произрастания, значительную хозяйственную ценность для человека. Сосна обыкновенная (Pinus sylvestris L.), распространенная на большей части территории России, имеет приоритетное значение в природоохранной и хозяйственной деятельности человека [2]. В условиях Оренбургской области проходит южная граница вида, в связи с контрастными геоботаническими, почвенно-геологическими районами произрастания данного вида становится актуальным изучить адаптивные реакции различных популяций одного вида к действию наночастиц, в частности Fe и Cu [3–10].

Особую популярность в сельском и лесном хозяйстве получили препараты на основе нанометаллов Fe и Cu. Медь используют для протравливания семян и стимуляции роста растений [11–15]. Однако медь в избытке оказывает токсическое действие, при этом корневой барьер играет заметную роль в формировании толерантности к избытку данного металла [16, 17]. Предпосевная обработка семян нанопорошком Сu оказывает положительное влияние на всходы травянистых растений, данные о влиянии наноформ Cu на древесные растения единичны. Влияние нанопорошков на рост и развитие древесных растений изучено не на всех стадиях онтогенетического развития в связи с продолжительным периодом развития (сто и более лет) и невозможностью постановки эксперимента в условиях in vitro.

Гипотеза исследования основывается на том, что в условиях сложной структурной организации природных ландшафтов Оренбургской области P. sylvestris характеризуется высоким разнообразием генетических признаков, которые сформировались в конкретных зонально-климатических, эдафических и ценотических условиях, что подтверждается данными [18]. Совокупность и разнообразие факторов среды определили высокое генетическое разнообразие внутри исследуемых популяций P. sylvestris. При этом наблюдается значительный для данного вида набор адаптивных вариаций, которые проявляются морфобиологически и могут влиять на выраженность реакции этих растений на действие наноформ тяжелых металлов, в частности Fe и Cu [1, 4, 7].

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объектом исследования являлись сеянцы P. sylvestris, полученные из семян, собранных с модельных деревьев на контрольных участках Кваркенского (группа А) и Бузулукского (группа Б) районов Оренбургской области и прошедших предварительную стратификацию [19]. Модельные площади закладывали в пределах естественных массивов P. sylvestris. Площади исследования выбрали с учетом полярности условий районов произрастания реликтовых сосен.

Согласно физико-географическому районированию [20] площади исследования находятся в пределах двух физико-географических стран – Восточно-Европейской равнины, которая представлена Бузулукским бором, и Тургайской равнинной страны, которая представлена островными борами: Аландский, Болотовский и Адрианопольский.

Районы исследования различались почвенными условиями. Бузулукский бор расположен в пределах Самаро-Малокинельском сыртово-плакорно-увалистого района Заволжско-Общесыртовской северно-степной возвышенной провинции. В соответствии с широтно-климатическим зонированием территория входит в подзону северной степи (гидротермический коэффициент составляет 0.7). Основу почвенного покрова составляют черноземы обыкновенные с разнотравно-ковыльной степью. Песчаные бугристые террасы реки Боровки, заполнившие обширную котловину Бузулукского бора, представлены дерново-боровыми псевдо-оподзоленными песчаными почвами (псаммоземами) [21].

Аландский, Болотовский и Адрианопольский боры расположены на территории Урало-Суундукского плакорно-останцово-увалистого района Урало-Тобольской высокоравнинной степной провинции. Сосновые боры расположены на небольших ровных площадках и понижениях, для которых характерны темно-серые лесные почвы на продуктах выветривания гранитоидов и пестроцветных глин древних кор выветривания, выстилающих понижения в рельефе [21].

Насаждения характеризовались высоким генетическим разнообразием и, по данным кластерного анализа (UPGMA), основанного на степени сходства популяций по ISSR-маркерным признакам, принадлежали к разным генетическим группам. Результаты исследования подтверждаются анализом главных компонент в программном комплексе “R” [18].

Культивирование сеянцев P. sylvestris проводили с использованием наночастиц Cu (103 ± 2 нм покрытые тонкой оксидной пленкой CuO) и наночастиц Fe (80 ± 15 нм) [22]. Наночастицы были получены в институте энергетических проблем химической физики РАН (Москва) на установке МиГен при помощи метода высокотемпературной конденсации.

На первом этапе исследования навески исследуемых веществ (100 ммоль/л каждого вещества) разводили дистиллированной водой (10 мл) и диспергировали путем обработки ультразвуком частотой 35 кГц в источнике ванного типа “Сапфир ТТЦ” 30 мин, после чего готовили четырехкратные разведения.

В качестве субстрата для проращивания использовали кварцевый песок, предварительно обработанный. Биотестирование проводили в соответствии с ГОСТ 15150 в лабораторных условиях [23]. Эксперимент проводили по следующей схеме: в контейнеры помещали предварительно подготовленный субстрат, семена P. sylvestris заглубляли и проводили орошение заранее приготовленными суспензиями или растворами. Орошение контрольных образцов проводили дистиллированной водой. После чего контейнеры помещали в термостат с оптимальным режимом проращивания на срок 14 дней, при необходимости проводили увлажнение субстрата исследуемыми растворами. Диагностическими признаками служили всхожесть семян, морфометрические показатели сеянцев и концентрация Cu и Fe в их осевых органах [24].

Измерения массовой концентрации химических элементов проводили с использованием рентгенофлуоресцентного анализа (спектрометр универсальный рентгенофлуоресцентный СУР-02 “РЕНОМ ФВ” (Россия)).

Статистическую обработку результатов выполняли в программе Microsoft Excel 2007. Из каждой выборки исключали значения параметров, выходящие за рамки ±3σ. Итоговые значения, представленные в табл. 1 и 2, являются средней арифметической величиной ± основная ошибка средней арифметической величины. Оценку существенности различий средних величин проводили с использованием t-критерия Стьюдента.

Анализ роста сеянцев P. sylvestris в среде с модельным содержанием наночастиц Cu и Fe выявил значимые изменения морфометрических признаков по сравнению с контролем. Присутствующие в среде наночастицы Cu изменяли всхожесть семян при максимальной концентрации (100 ммоль/л).

Наночастицы Cu оказывали токсическое воздействие на рост сеянцев P. sylvestris. При концентрациях 100 и 25 ммоль/л образования надземного побега не происходило. Достоверно отмечена большая устойчивость сеянцев группы А. Длина главного корня сеянцев данной группы была выше, чем у сеянцев группы Б, на 2.1–4.9%. Количество придаточных корней было выше у сеянцев популяции Бузулукского района (до 10.2%), длина придаточных корней также была выше (0.84–7.61%). При этом в контроле сеянцы популяции Бузулукского района были равными или превышали по длине главного и придаточных корней (до 0.9%) (табл. 2).

Наночастицы Fe оказывали стимулирующее действие на рост сеянцев. Максимальный эффект проявлялся при концентрации 25 ммоль/л. При максимальной опытной концентрации наночастицы Fe снижали длину побега и подавляли формирование корневой системы. Морфобиологическая реакция сеянцев P. sylvestris на присутствие в среде наночастиц Fe менее выражена по сравнению с реакцией на присутствие в среде наночастиц Cu. Устойчивость сеянцев группы А была также выше. Длина главного корня сеянцев данной популяции была выше, чем у сеянцев группы Б, на 0.39–2.23%. Количество придаточных корней было выше у сеянцев группы Б (до 3.1%), их длина также была выше (0.55–1.04%).

Анализ содержания наноформ Cu и Fe в контрольной группе сеянцев свидетельствует о достаточной обеспеченности ими растения и преимущественном накоплении в корневой системе (табл. 3).

Увеличение концентрации наночастиц Cu в среде сопровождалось ростом его содержания и в осевых органах сеянцев. При этом характер увеличения не зависел от генетической принадлежности семян. Так, воздействие 100 ммоль Cu приводило к увеличению содержания этого металла в корневой системе сеянцев группы А в 3.13 раза по сравнению с контролем, группы Б – в 3.19 раза, а в стволиках – в 2.85 и 2.87 раза соответственно.

Изменение концентрации наночастиц Fe во всех экспериментальных растениях было на одном уровне и отличалось в стволиках сеянцев группы А в 1.06–1.42 раза по сравнению с контролем, группы Б – 1.06–1.36 раза, в корневой системе сеянцев в 1.55–1.60 и 1.48–1.55 раза соответственно. Содержание Fe в корневой системе сеянцев популяции Б превышало данный показатель у сеянцев группы А.

Проведенный анализ морфбиологических показателей сеянцев, культивированных в среде с присутствием наночастиц Сu, не позволил выявить значимых различий в изменении частоты прорастания семян. Угнетение роста корневой системы происходило при концентрации наночастиц Cu 6.25 ммоль/л и выше. При максимальных концентрациях (100 ммоль/л) происходило подавление роста побега. Что касается влияния наночастиц Fe, то при всех концентрациях значимых различий морфобиологических реакций сеянцев групп А и Б не обнаружено (табл. 4). Изменение всех исследуемых параметров происходило при максимальной концентрации наночастиц Fe (100 ммоль/л).

Полученные результаты исследования подтверждаются данными отечественных ученых, которые также отмечают фитотоксичность наночастиц Cu [2, 19, 25]. Общемировые исследования подтверждают, что основное действие наночастицы металлов оказывают именно на корневую систему растений [13, 17].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Естественные массивы P. sylvestris в пределах юго-западной границы ареала на стыке геоморфологических районов и флористических областей в пределах Оренбургской области характеризуются высоким генетическим разнообразием. В результате анализа главных компонент и проведенных ранее исследований [18] выборка реликтовых сосен поделилась на две генетически различные группы: европейскую и азиатскую. Морфобиологическая реакция сеянцев P. sylvestris, полученных из семян, собранных в популяциях из указанных выше групп (европейской – Бузулукский бор, азиатской – реликтовые сосны Кваркенского района), и уровень накопления в осевых органах наночастиц Cu и Fe имеют различия. Так, морфобиологическая реакция сеянцев P. sylvestris группы А менее выражена по сравнению с сеянцами группы Б. Причиной тому может служить генетически заложенная адаптация сосен Кваркенского района к повышенному геохимическому фону Cu и Fe [21].

В ходе исследований была выявлена низкая толерантность рассматриваемых популяций P. sylvestris к действию наночастиц Cu. Проведенные исследования проростков in vitro с присутствием наночастиц Сu выявили значительные морфобиологические изменения корневой системы. Установлено, что присутствие в среде наночастиц Cu не изменяло всхожесть семян, однако при максимальной опытной концентрации (100 ммоль/л) снижало длину побега и подавляло формирование корневой системы.

Еще одним фактором, свидетельствующим о низкой толерантности P. sylvestris к воздействию Cu, является определенное подавление частоты всхожести, длины побега и корней в эксперименте с присутствием в среде Cu. При наличии в среде наночастиц Cu было выявлено незначительное подавление роста корневой системы.

Был выявлен достоверный эффект подавления роста P. sylvestris при культивировании в среде, содержащей наночастицы Fe. В диапазоне 6.25–25 ммоль/л отмечалось увеличение придаточных корней, что может рассматриваться в качестве компенсаторной реакции на подавление роста главного корня. Полученные данные согласуются с данными отечественных и зарубежных авторов о влиянии наночастиц Cu и Fe на травянистые виды и водоросли [26–37].

Таким образом, морфобиологическая реакция сеянцев P. sylvestris взаимосвязана с генотипом популяции. При одинаковых условиях культивирования из семян генетически различных популяций более толерантными к действию наночастиц Cu и Fe оказались сеянцы популяций Кваркенского района, в котором отмечается геохимическая аномалия по этим элементам в почвах. Данный факт указывает на генетическую адаптацию к действию Cu и Fe, присутствующих в окружающей среде.

Результаты исследования определяют целесообразность рекомендовать лесным питомникам и лесничествам при проведении предпосевной обработке семян препаратами, содержащими наноформы Cu и Fe, учитывать их действие в различных концентрациях на рост и развитие сеянцев P. sylvestris. Проводить генетический контроль посевного материала различных популяций с учетом фактора морфобиологических реакций на действие наночастиц Cu и Fe.