Российские нанотехнологии, 2022, T. 17, № 6, стр. 823-828

ВВЕДЕНИЕ

Производные фуллерена C₆₀ являются перспективными наноматериалами с широким спектром биомедицинских приложений [1–4]. Пентааминокислотные производные фуллерена С₆₀ (ППФ) имеют амфифильную природу, обладают высокой растворимостью в воде, а также проявляют умеренную или низкую токсичность [2, 5]. Ранее было показано, что соединения ряда ППФ обладают мембранотропными свойствами [6], оказывают эффективное действие на мишени сахарного диабета 2 типа (СД2): на каталитическую активность ферментов полиольного пути метаболизма глюкозы альдозоредуктазу и сорбитолдегидрогеназу [7, 8]. Для калиевой соли фуллеренилпента-N-3-гидрокси-L-тирозина (ППФ-5) было изучено антидиабетическое действие на крысах с экспериментальным СД2 in vivo: введение данного соединения вызывало снижение уровня глюкозы в крови животных и восстановление морфологической структуры поджелудочной железы и печени [8]. Таким образом, показана перспективность исследования ППФ в качестве потенциальных антидиабетических средств.

В развитии СД2 важную роль играет окислительный стресс [9–11]. Дисфункция митохондрий и связанная с ней гиперпродукция супероксидных радикалов, которые наблюдаются при гипергликемии, объясняют один из основных механизмов активации повреждения тканей при сахарном диабете [10]. Клеточный редокс-дисбаланс является движущей силой генерации активных форм кислорода (АФК) и развития окислительного стресса при диабете [12]. Окислительный стресс и АФК повсеместно опосредуют повреждение тканей, вызванное гипергликемией и глюколипотоксичностью [13]. При СД2 значительно снижаются содержание и активность антиоксидантных ферментов, а также восстановленной формы глутатиона, тогда как уровень свободных радикалов значительно увеличивается [14]. Показано, что АФК и окислительный стресс входят в число основных факторов, отвечающих за развитие инсулинорезистентности, дисфункции β-клеток поджелудочной железы, повышение производства глюкозы в печени и ее утилизации [15, 16].

Важным механизмом, связанным с патогенезом СД2, является неферментативное гликирование белков свободными сахарами, которое возрастает при гипергликемии, вызывает нарушение структуры и функций белков и накопление конечных продуктов гликирования (КПГ) [17–20]. Ингибиторы процесса образования КПГ оказывают положительный эффект при терапии СД2 и его осложнений [21], в связи с чем активно ведется создание и поиск ингибиторов неферментативного гликирования белков.

Окислительный стресс и гликирование тесно связаны между собой. Неферментативное гликирование белков сопровождается увеличением свободнорадикальной активности [22]. На стадии формирования интермедиатов гликирования образуются АФК (пероксид водорода и гидроксильный радикал), что служит триггером окислительного стресса [12]. При этом окислительный стресс, развивающийся при длительной гипергликемии, также индуцирует процесс гликирования белков [23].

Таким образом, способность одновременно ингибировать процессы перекисного окисления липидов и неферментативного гликирования белков важна для соединений, направленных на терапию СД2 [24]. В связи с этим изучение антиоксидантных и антигликирующих свойств ППФ как потенциальных препаратов для терапии СД2 является актуальной задачей.

МЕТОДЫ

Исследуемые соединения. Пентааминокислотные производные С₆₀ – калиевые соли фуллеренилпентааминоуксусной кислоты (ППФ-1), фуллеренилпента-N-пирролидин-α-карбоновой (ППФ-2), фуллеренилпента-2-амино-3-гидроксипропановой (ППФ-3), фуллеренилпента-N-аминоянтарной (ППФ-4) кислот и фуллеренилпента-N-3-гидрокси-l-тирозина (ППФ-5) синтезировали согласно опубликованной ранее методике [25, 26]. Структуры показаны на рис. 1. Состав и строение полученных соединений были доказаны с использованием физико-химических методов исследования, спектральные данные сообщались в [5, 8, 25].

Метод хемилюминесценции люминола. Влияние исследуемых соединений на процесс перекисного окисления липидов (ПОЛ) определяли в гомогенате головного мозга мышей in vitro методом хемилюминесценции (ХЛ). Метод основан на определении изменения люминесценции люминола (5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндиона), опосредованной взаимодействием хромофора со свободными радикалами, образование которых инициируется трет-бутилгидропероксидом (ТБГП) [27, 28].

Пробы (2 мл) содержали 0.5 мкМ люминола, 10 мкМ исследуемого соединения и гомогенат головного мозга мышей с концентрацией белка 1 мг/мл в трис-HCl буфере (0.1 М, pH = 7.4). В контрольные пробы вместо исследуемых соединений добавляли трис-HCl буфер. Реакцию инициировали добавлением ТБГП (0.073 М). Кинетику изменения ХЛ люминола регистрировали на хемилюминометре Luminometr-1250 (LKB Wallak, Швеция) в течение 15 мин. Измерения проводили при термостатировании (37°С) и барботировании пробы воздухом. Содержание свободных радикалов в системе оценивали по изменению светосуммы: площади под кинетической кривой зависимости интенсивности ХЛ люминола от времени при взаимодействии его со свободными радикалами и определяли по формуле

где S – площадь под кривой ХЛ, A_i – текущее значение интенсивности ХЛ в момент времени t. Результаты оценивали в процентах относительно контрольных проб.

Определение содержания малонового диальдегида по ТБК-активному тесту. Интенсивность ПОЛ в гомогенате головного мозга мышей оценивали по содержанию в образцах малонового диальдегида (МДА) – одного из конечных продуктов окисления липидов [29]. Метод основан на реакции тиобарбитуровой кислоты (ТБК) с продуктами ПОЛ. Опытные пробы (2 мл) содержали 10 мкМ исследуемых соединений и 1 мл гомогената головного мозга мышей (1 г мозга : 7 мл буфера) в K–Na-фосфатном буферном растворе (0.1 М, pH = 7.2). В контрольные пробы вместо исследуемых соединений добавляли K–Na-фосфатный буфер. Пробы термостатировали 30 мин при 37°С, реакцию приостанавливали добавлением 17%-ного раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Далее пробы центрифугировали 10 мин при 4000 об./мин на центрифуге Ohaus Frontier 5515R (Ohaus, США). Отбирали супернатант, добавляли 1 мл ТБК (0.8%). Пробы помещали на водяную баню (30 мин, 100°С). Оптическую плотность регистрировали на спектрофотометре Agilent Cary 60 (Agilent Technologies, США) при λ = = 532 нм. Концентрацию белка в гомогенатах определяли по методу Лоури [30].

Концентрацию МДА рассчитывали по формуле

где C – концентрация МДА, мкМ; D – оптическая плотность образца; ε – молярный коэффициент экстинкции, равный 1.56 × 10⁵ М^–1 см^–1; б – содержание белка в пробе (мг). Результаты выражали в виде мкМ/мг белка, а также оценивали в процентах относительно контрольных проб.

Для оценки кинетики накопления МДА определяли содержание МДА в пробах в пяти кинетических точках с временным интервалом 15 мин (0–60 мин) при термостатировании (37°С).

Антигликирующая активность соединений. Влияние на процесс гликирования бычьего сывороточного альбумина (БСА) изучали по изменению специфической флуоресценции, характерной для конечных КПГ (λ_ex = 370 нм, λ_max/em = = 440 нм). Реакцию гликирования воспроизводили по методу [31]. Проба (1 мл) содержала 0.5 мл БСА (4 мг/мл), 0.4 мл D-глюкозы (0.4 М) в Na-фосфатном буфере (pH = 7.4, содержание азида натрия – 0.02%) и 0.1 мл исследуемого соединения. В контрольные пробы вместо соединений добавляли буфер. В качестве позитивного контроля использовали аминогуанидин [32]. Пробы инкубировали в термостате 48 ч при 60°С. После проведения инкубирования ППФ удаляли из проб путем осаждения белка ТХУ (100%) с последующим центрифугированием на центрифуге Ohaus Frontier 5515R (4 мин, 4°С, 13 500 об./мин). Супернатант сливали, а осадок растворяли в 1 мл PBS (pH = 10). Интенсивность специфической флуоресценции гликированного БСА оценивали на спектрофлуориметре (Cary Eclipse, США) λ_ex = = 370 нм, λ_em = 440 нм [31]. Для каждого вещества рассчитывали IC₅₀ (концентрацию полумаксимального ингибирования процесса).

Статистическую обработку результатов проводили при помощи статистического пакета программы Microsoft Office. Результаты представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего. Достоверность различий определяли по t-критерию Стьюдента. Различия между средними значениями считали достоверными при уровне значимости 95% (p < 0.05).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ППФ являются перспективными соединениями, проявляющими антидиабетическую активность [6–8].

Антиоксиданты способны защищать β-клетки поджелудочной железы от окислительного повреждения, предупреждать и снижать развитие патологических процессов, сопровождающих СД2 [16, 23]. В связи с этим для соединений, направленных на лечение СД2, важным свойством является способность ингибировать процессы ПОЛ [33]. В настоящем исследовании оценивали антиоксидантную активность нового класса ППФ.

Влияние ППФ на процесс индуцированного ПОЛ оценивали методом ХЛ в модельной системе гомогената головного мозга мышей. Количество выделившихся квантов света в процессе ХЛ люминола пропорционально количеству свободных радикалов, образовавшихся в реакциях ПОЛ. В присутствии антиоксидантов количество свободных радикалов снижается и, соответственно, уменьшается интенсивность ХЛ люминола [34].

Установлено, что при действии исследуемых ППФ уменьшается светосумма ХЛ люминола (рис. 2). Это свидетельствует о снижении интенсивности ХЛ люминола, а следовательно, об уменьшении содержания свободных радикалов в системе. Таким образом, наблюдаем ингибирование процесса ПОЛ в присутствии исследуемых ППФ. Снижение светосуммы в пробах при действии ППФ в концентрации 10 мкМ варьирует от 46 до 87% ингибирования относительно контроля. Наиболее эффективными антиоксидантами являются ППФ-4 и ППФ-5, снижающие светосумму, а следовательно, и содержание свободных радикалов в образцах на 87 и 79% соответственно. ППФ-1 также проявило выраженное антиоксидантное действие, ингибируя процесс ПОЛ на 63% по сравнению с контролем. Таким образом, методом ХЛ показано, все исследуемые ППФ обладают способностью перехватывать свободные радикалы с различной степенью эффективности. Максимальную активность проявили соединения ППФ-4 и ППФ-5.

Антиоксидантную активность соединений также оценивали с помощью метода определения ТБК-активных продуктов спонтанного ПОЛ в гомогенате головного мозга мышей in vitro [35]. Как показано на рис. 2, исследуемые ППФ в концентрации 10 мкМ ингибировали образование МДА – одного из конечных продуктов ПОЛ. ППФ-4 и ППФ-5 проявили наиболее сильное антиоксидантное действие, ингибируя накопление МДА на 74 и 73% относительно контроля (проб, в которых определяли содержание МДА при спонтанном ПОЛ). ППФ-1 снижает содержание МДА на 60% относительно контроля и также является хорошим ингибитором процесса ПОЛ.

Кинетические кривые накопления МДА в гомогенате головного мозга мышей при спонтанном ПОЛ (контроль) и в присутствии ППФ в концентрации 10 мкМ представлены на рис. 3. Как видно из графика, под влиянием ряда ППФ снижалась скорость накопления МДА. Наиболее эффективно снижали процесс накопление продуктов ПОЛ в течение 60 мин ППФ-4 и ППФ-5. В присутствии ППФ-4 накопление МДА достоверно снижалось на 86 и 87% по сравнению с контролем при τ = 45 и 60 мин соответственно. ППФ-5 ингибировало накопление МДА на 88 и 90% при τ = 45 и 60 мин относительно контроля.

Аддендом ППФ-4 является производное янтарной кислоты, которая является известным антиоксидантом [36]. Адденд ППФ-5 – L-допа (L-3,4-дигидроксифенилаланин) также проявляет антиоксидантные свойства в тестах in vitro [37]. Исходя из этого, антиоксидантные свойства ППФ-4 и ППФ-5 можно объяснить не только акцепторными свойствами сфероида фуллерена, но и активностью аддендов [38].

Антиоксидантные свойства исследуемых ППФ подтверждают перспективность их дальнейшего изучения в качестве антидиабетических средств. Можно предположить, что антиоксидантная активность является одним из механизмов, благодаря которому наблюдали эффект восстановления морфологической структуры поджелудочной железы у крыс с экспериментальной моделью СД2, получавших инъекции ППФ-5.

Неферментативное гликирование белков многократно усиливается при СД2 вследствие гипергликемии и развитии окислительного стресса и является одним из основных процессов патогенеза диабета, приводящих к развитию диабетических осложнений. Именно исследование влияния способности ингибировать процесс образования КПГ является актуальным при изучении потенциальных антидиабетических средств.

Влияние ППФ на процесс неферментативного гликирования БСА изучали in vitro по изменению специфической флуоресценции КПГ [31]. Концентрации ППФ, вызывающие ингибирование процесса гликирования БСА на 50% (IC₅₀) представлены в табл. 1. Показано, что все изучаемые ППФ проявляют антигликирующую активность in vitro. Самым эффективным ингибитором гликирования БСА оказался ППФ-5 c IC₅₀ = = 15.1 мкМ. Другие исследуемые соединения (ППФ-1, ППФ-2, ППФ-4) проявили значительную антигликирующую активность с IC₅₀ от 30 до 63.5 мкМ. Наиболее слабые антигликирующие свойства показало соединение ППФ-3 (IC₅₀ = = 419.9 мкМ). При этом все изучаемые ППФ превышают по эффективности аминогуанидин (IC₅₀ = 1294.4 мкМ), известный стандартный ингибитор гликирования, который используется в экспериментах in vitro в качестве позитивного контроля [39–41]. ППФ-5 в 86 раз эффективнее ингибирует процесс гликирования, чем аминогуанидин.

Ингибиторы образования КПГ, обладающие антиоксидантной активностью, рассматривают как перспективные синергические средства против диабетических осложнений, связанных с усилением процесса гликирования [31, 42]. Среди исследованных ППФ сильное антигликирующее действие проявляют соединения, которые также обладают выраженными антиоксидантными свойствами: ППФ-1, ППФ-4 и ППФ-5. Исходя из этого, данные ППФ можно рекомендовать для дальнейшего исследования их антидиабетических свойств как in vitro, так и на экспериментальных моделях in vivo.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Впервые показано, что пентааминокислотные производные фуллерена С₆₀ обладают антиоксидантной и антигликирующей активностью. Способность ППФ ингибировать процесс перекисного окисления липидов была исследована in vitro двумя методами: методом хемилюминесценции люминола по влиянию на инициированный ТБГП процесс ПОЛ; методом определения содержания МДА по ТБК-активному тесту при спонтанном ПОЛ. Показано, что исследуемые ППФ проявляют выраженные антиоксидантные свойства. Наиболее эффективными антиоксидантами являются калиевая соль фуллеренилпента-N-аминоянтарной (ППФ-4) кислоты и калиевая соль фуллеренилпента-N-3-гидрокси-L-тирозина (ППФ-5). Влияние ППФ на процесс гликирования изучено по изменению специфической флуоресценции, характерной для конечных продуктов гликирования. Показано, что исследуемые ППФ демонстрируют выраженное антигликирующие действие, значительно превышающее (для ППФ-5 – в 86 раз) эффективность стандартного ингибитора аминогуанидина.

Полученный результат указывает на перспективность дальнейшего изучения ППФ с целью создания на их основе лекарственных препаратов для терапии сахарного диабета 2 типа.

Работа выполнена по теме Государственного задания, № государственной регистрации АААА-А19-119071890015-6. Работы по синтезу водорастворимых производных фуллеренов выполнены при поддержке Российского научного фонда (проект № 22-43-08005). В работе использовано научное оборудование Научно-образовательного центра МГОУ в г. Черноголовка.