Российские нанотехнологии, 2023, T. 18, № 1, стр. 129-134

ВВЕДЕНИЕ

C-фикоцианин (С-ФЦ) – это белковый комплекс с ковалентно присоединенным к нему хромофором фикоцианобилином, выполняющий светособирательную функцию в фотосинтетическом аппарате цианобактерий [1, 2].

С-фикоцианин является эффективным антиоксидантом и противовоспалительным агентом [2–4], часто используется в медицинских исследованиях разного рода [5–8]. Фикоцианин сам по себе или содержащий его экстракт цианобактерии Arthrospira platensis безопасны при употреблении в пищу человеком, что делает их применимыми с терапевтической точки зрения [1, 8–10].

С-ФЦ проявлял антиоксидантные свойства и восстанавливал связанное со старением снижение активности ферментов антиоксидантной защиты у мышей, получавших D-галактозу [5]. Благодаря своей антиоксидантной активности С-ФЦ снижал уровень запрограммированного некроза в клеточной линии GC-1 spg (иммортализованная модель клеток Лейдига мыши), что позволяет предполагать его возможный терапевтический эффект при потере фертильности [6]. Кроме того, у самок мышей с индуцированным диетой ожирением добавление С-ФЦ в пищу приводило к увеличению количества и выживаемости потомства [11].

С-ФЦ предотвращал индуцированные доксорубицином когнитивные нарушения у мышей, снижал нейровоспаление и митохондриальную дисфункцию в клетках мозга мышей [4], а также улучшал клинические показатели мышей со множественным склерозом, снижая экспрессию маркеров воспаления [3] и впоследствии приводя к частичной ремиелинизации нейронов [12]. Известны попытки применения С-ФЦ для снижения эффектов, связанных с патогенезом болезни Альцгеймера [9].

При индуцированной введением CCl₄ печеночной [13] или HgCl₂ почечной недостаточности [14] длительное употребление С-ФЦ мышами приводило к улучшению биохимических показателей крови и частично предотвращало патологическую деформацию тканей. Такие эффекты связывают с антиоксидантным действием С-ФЦ [15]. При терапии С-ФЦ в течение недели до и после рентгеновского облучения печени мышей удавалось уменьшить дисфункцию печени, вызванную облучением [16].

Несмотря на множество оптимистичных результатов применения С-ФЦ при исследовании развития различных патологий in vivo, внутриклеточный механизм действия С-ФЦ изучен довольно скудно [17]. Возможно, исследования на лабораторных животных или клеточных линиях млекопитающих не дают точной информации о механизмах действия физиологически активных веществ в силу сложности самих моделей (большую роль играют как межклеточные взаимодействия, так и физиологические реакции на уровне организма) [18]. Выводы об антиоксидантной активности С-ФЦ были сделаны в основном опосредованно, по снижению уровня активных форм кислорода (АФК) в клетках, тканях и органах. Тем не менее в указанных условиях трудно определить, является ли С-ФЦ классическим антиоксидантом, т.е. снижает продукцию клеткой АФК, или этот эффект является опосредованным.

При изучении внутриклеточного действия физиологически активных веществ одними из наиболее перспективных моделей являются дрожжи [19] благодаря простоте своего строения, одноклеточному образу жизни, способности расти на множестве сред простого состава и большому количеству методик для генетических манипуляций [20]. Однако традиционно используемые дрожжи Saccharomyces cerevisiae в случае с С-ФЦ, для которого предполагается антиоксидантное действие, а значит, определенное влияние на биоэнергетику, не являются оптимальной моделью, поскольку это факультативные анаэробы, не имеющие комплекса I в дыхательной цепи и с точки зрения биоэнергетики плохо воспроизводящие события в клетках млекопитающих [21]. Поэтому в работе были использованы уникальные дрожжи аэробного типа обмена Yarrowia lipolytica, имеющие все преимущества дрожжевых моделей и вдобавок обладающие разветвленной сетью полностью функциональных митохондрий с полноценной дыхательной цепью “животного типа” [22], содержащей комплекс I. Дрожжи Y. lipolytica успешно применялись в исследованиях действия физиологически активных веществ про- и антиоксидантной природы на окислительный стресс и выживаемость эукариотических клеток [23, 24], а также на энергетические параметры выделенных из дрожжей митохондрий [25–28]. В данной работе показано действие С-ФЦ на изменение уровня индуцированного прооксидантом окислительного стресса в дрожжах Y. lipolytica и выживаемость дрожжевых клеток под окислительным стрессом, а также выявлен диапазон концентраций, при которых С-ФЦ проявлял физиологическое действие на суспензию клеток.

МЕТОДЫ

Культивирование микроорганизмов. Экстракты С-ФЦ получали из биомассы цианобактерии Arthrospira platensis В-12619 из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ). Культивирование цианобактерий проводили на модифицированной среде Заррука [29] в колбах Эрленмейера рабочим объемом 2000 мл с 1000 мл питательной среды (начальное значение pH 9.50 ± 0.05) в шейкере-инкубаторе Innova 42R (New Brunswick, США) при температуре 30°С, 140 об./мин и круглосуточном освещении с плотностью потока фотонов 14–16 мкмоль/(м² с) .

Дрожжи Yarrowia lipolytica, штамм W39, были получены из ВКПМ. Дрожжи выращивали при 28°С в перемешиваемых (220 об./мин) в 500 мл колбах Эрленмейера в 50 мл полусинтетической среды [21], содержащей 1.3%-ный сукцинат в качестве источника углерода и энергии. Клетки собирали в экспоненциальной фазе роста (ОП₆₀₀ = 1.0).

Выделение фикоцианина. Сбор биомассы цианобактерии A. platensis проводили центрифугированием (12 500 g, 10 мин) на центрифуге SL40R (Thermo Scientific, США), дважды промывали дистиллированной водой. Исчерпывающую экстракцию С-ФЦ из предварительно обработанной (трехкратный цикл замораживания при –20 °C и оттаивания при комнатной температуре) влажной биомассы проводили при 4°C 0.1 М натрий-фосфатным буфером (pH 7.00 ± 0.02). Осаждение биомассы осуществляли центрифугированием (20 500 g, 30 мин). Далее первичный экстракт С-ФЦ ступенчато осаждали сульфатом аммония (20, 40, 60%), диализовали против деионизованной воды (мембрана CelluSep T3 25 мм, MWCO 12 000–14 000 Да, 24 ч, 4°C), замораживали при –70°C и лиофильно высушивали на лиофильной сушилке FreeZone 2.5 (Labconco, США). Растворы С-ФЦ получали перед проведением эксперимента растворением порошка в деионизованной воде.

Количественное определение содержания и чистоты С-фикоцианина. Концентрацию в растворе (мг/мл) и чистоту C-ФЦ рассчитывали с использованием уравнений (1) [30] и (2), снимая спектры поглощения в диапазоне 190–700 нм (спектрофотометр Genesys 10S UV-Vis):

Оценка накопления С-фикоцианина в клетках дрожжей. О накоплении С-ФЦ в дрожжевых клетках судили по флуоресценции клеток в канале APC на проточном цитометре FACSAria Fusion (Becton Dickinson, США). Данные получали минимум для 20 000 клеток и обрабатывали с помощью программного пакета FlowJo (FlowJo LLC, США).

Генерация АФК в клетках дрожжей и их измерение. Окислительный стресс в клетках дрожжей индуцировали прооксидантом трет-бутилгидропероксидом (t-BHP, Sigma, Германия). Генерацию АФК клетками оценивали, используя краситель диацетат дигидродихлорфлуоресцеина (H₂DCF-DA, Thermo, США). Краситель проникает в дрожжевые клетки, где ацетильные группы удаляются внутриклеточными эстеразами, после чего дигидродихлорфлуоресцеина (H₂DCF) теряет возможность выходить из клетки. H₂DCF окисляется АФК до флуоресцентного дихлорфлуоресцеина (DCF), чья флуоресценция зависит от уровня окислительного стресса в клетке [31]. Флуоресценцию DCF детектировали на проточном цитометре FACSAria Fusion (Becton Dickinson, США). Данные получали минимум для 20 000 клеток и обрабатывали с помощью программного пакета FlowJo (FlowJo LLC, США).

Измерение уровня клеточной гибели. Гибель клеток дрожжей детектировали окраской пропидий йодидом (PI), флуоресцентным красителем, проникающим только в клетки с поврежденной цитоплазматической мембраной. Флуоресценцию PI детектировали на проточном цитометре FACSAria Fusion (Becton Dickinson, США). Данные получали минимум для 20 000 клеток и обрабатывали с помощью программного пакета FlowJo (FlowJo LLC, США).

Статистический анализ проводили посредством однофакторного ANOVA-теста с апостериорным тестом Тьюки. Данные представлены в виде среднего ± стандартное отклонение минимум из трех независимых экспериментов.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Концентрация выделенного из биомассы цианобактерий A. platensis С-ФЦ составила 4.5 ± ± 0.1 мг/мл, а чистота – 2.5 ± 0.1. Далее раствор С-ФЦ использовали для оценки уровня окислительного стресса и гибели клеток дрожжей Y. lipolytica.

О накоплении С-ФЦ в клетках дрожжей Y. lipolytica судили по изменению медианы флуоресценции клеток в канале APC на проточном цитометре (рис. 1). Показано, что медиана флуоресценции клеток при увеличении количества С-ФЦ в среде инкубации также возрастает.

Рис. 1.

Накопление С-ФЦ в клетках дрожжей Y. lipolytica.

Для выявления возможного про- или антиоксидантного эффекта С-ФЦ суспензию клеток дрожжей в среде выращивания преинкубировали с различными концентрациями С-ФЦ в течение 1 ч. В качестве контроля дрожжи инкубировали с 800 нМ SkQ1 – мембранотропным митохондриально-направленным катионом, для которого ранее было показано сильное антиоксидантное действие на суспензию дрожжей Y. lipolytica [23].

Окислительный стресс в суспензии клеток Y. lipolytica индуцировали добавлением 750 мкМ t-BHP в среду выращивания клеток в течение 2 ч, предварительно отмыв клетки от среды с С-ФЦ и SkQ1. При дальнейшем окрашивании суспензии дрожжей парой красителей H₂DCF-DA и PI и анализе методом проточной цитометрии клетки дрожжей разделялись на четыре популяции по уровню флуоресценции красителей (рис. 2). Популяция Q1 с низким уровнем флуоресценции обоих красителей соответствовала нормальным живым клеткам без окислительного стресса. Популяция Q2 с высоким уровнем флуоресценции DCF и низким уровнем PI соответствовала живым клеткам, подверженным окислительному стрессу. Популяции Q3 + Q4, где наблюдали высокий уровень флуоресценции PI, соответствовали мертвым клеткам.

Рис. 2.

Прооксидантное действие t-BHP на суспензию дрожжей Y. lipolytica. Типичный график распределения популяций дрожжей, окрашенных красителями H₂DCF-DA и PI. Q1 – популяция живых нормальных клеток, Q2 – популяция живых клеток с окислительным стрессом, Q3 + Q4 – популяция мертвых клеток.

На рис. 3 показано распределение по описанным популяциям клеток, преинкубированных с различными концентрациями С-ФЦ и подвергнутых действию прооксиданта t-BHP. На рис. 3а показано действие С-ФЦ на дрожжевые клетки без последующего добавления прооксиданта. Наиболее высокие концентрации С-ФЦ из исследованных сами по себе проявляли цитотоксический эффект, вызывая окислительный стресс и снижая выживаемость клеток дрожжей в суспензии. Как и ожидалось, инкубация контрольных клеток с 750 мкМ t-BHP снижала количество нормальных клеток, увеличивала уровень клеточной смерти и количество клеток, подверженных окислительному стрессу (рис. 3б). Если дрожжи преинкубировали с SkQ1, негативный эффект от прооксиданта достоверно снижался. Похожее, но в большинстве случаев менее выраженное действие оказывала преинкубация с различными концентрациями С-ФЦ, что говорит о его прямом антиоксидантном действии на клетки. Показано, что низкие концентрации С-ФЦ (10–100 мкг/мл) снижали уровень клеточной смерти, вызванной прооксидантом, преинкубация с 20 и 50 мкг/мл С-ФЦ также достоверно снижала размер популяции клеток с окислительным стрессом. Наиболее выраженное антиоксидантное действие проявлялось С-ФЦ в концентрации 20 мкг/мл. При данной концентрации действие С-ФЦ сопоставимо с антиоксидантным эффектом митохондриально-направленного катиона SKQ1. Действующая концентрация SkQ1 была приблизительно на 2 порядка ниже (~0.5 мкг/мл), что объясняется его митохондриальной направленностью и тем фактом, что С-ФЦ является белковым комплексом и содержит достаточно много структурообразующих элементов, не вовлеченных в антиоксидантную активность. Интересно, что С-ФЦ в концентрации 20 мкг/мл в присутствии прооксиданта более эффективно снижал уровень клеточной смерти дрожжей, чем SkQ1, что говорит о его сильном прямом антиоксидантном действии.

Рис. 3.

Действие С-ФЦ, SkQ1 и t-BHP на окислительный стресс и гибель клеток дрожжей Y. lipolytica: а – клетки без инкубации с прооксидантом; б – клетки, подвергшиеся действию 750 мкМ t-BHP в течение 2 ч. Статистический анализ проводился посредством однофакторного ANOVA-теста. * – значимость разницы распределения среднего против соответствующего контроля (контрольные клетки (а), клетки, инкубированные с 750 мкМ t-BHP (б)). ***: p < 0.001; ∗∗: 0.001 < p < 0:01; ∗: 0.01 < p < 0.05. # – значимость разницы распределения среднего между контрольными клетками и клетками, экспонированными 750 мкМ t-BHP. ###: p < 0.001.

ОБСУЖДЕНИЕ

Митохондрии являются основными источниками избыточных количеств АФК в большинстве клеток [32]. Окислительный стресс, вызываемый избыточной продукцией АФК и часто являющийся следствием дисфункции митохондрий, лежит в основе или является симптомом большого количества системных хронических метаболических заболеваний, затрагивающих большинство систем органов [23, 33, 34]. Данные заболевания нередко классифицируются как возрастные, а значит, в условиях увеличения средней продолжительности жизни их социальная значимость возрастает [35]. В таких условиях наиболее перспективными терапевтическими средствами против заболеваний, связанных с окислительным стрессом, становятся антиоксиданты, особенно направленного действия [36]. Поскольку С-ФЦ является относительно легко доступным физиологически активным веществом с показанным антиоксидантным действием, с точки зрения его применения в терапевтических целях возникает вопрос о механизме его работы, допустимых концентрациях, а также о побочных эффектах.

В работе показано, что наиболее выраженный антиоксидантный эффект in situ С-ФЦ проявляет в концентрации 20–50 мкг/мл, а при концентрациях выше 100 мкг/мл наблюдался собственный цитотоксический эффект. Таким образом, существует довольно широкое “окно” в концентрациях (10–100 мкг/мл), когда С-ФЦ проявляет антиоксидантный эффект.

В качестве прооксиданта в экспериментах был выбран t-BHP. В отличие от традиционно используемого пероксида водорода, чью концентрацию трудно измерить из-за того, что он сам производится клеткой и утилизируется системами антиоксидантной защиты, t-BHP не имеет выявленных механизмов воздействия на клетку, не связанных с прооксидантным эффектом, хорошо проникает в клетки. При этом сильный прооксидантный эффект t-BHP объясняется прежде всего ускорением перекисного окисления липидов в митохондриях [37], что является наиболее опасным с точки зрения клеточной биоэнергетики [38]. Кроме того, t-BHP не является разобщителем и не ингибирует ни комплексы дыхательной цепи митохондрий, ни АТФ-синтазу, что могло бы исказить наблюдаемые эффекты [21]. В [39] было показано, что окислительный стресс, индуцируемый t-BHP, прежде всего наблюдался в митохондриях и только через некоторое время генерализовался по всей клетке. В связи с этим в качестве контрольного антиоксиданта был выбран митохондриально-направленный катион SkQ1, эффективно снижавший уровень митохондриального окислительного стресса и его генерализации. Таким образом, результаты, показанные на рис. 3б, свидетельствуют именно о дозозависимом прямом антиоксидантном действии С-ФЦ.

Интересно, что окислительный стресс, вызванный высокими концентрациями С-ФЦ, при инкубации с t-BHP номинально снижался. Это объясняется возросшим уровнем клеточной смерти в образцах, которые после преинкубации с С-ФЦ подвергались действию прооксиданта. По-видимому, клетки, которые могли бы выжить с окислительным стрессом при инкубации с С-ФЦ, при дополнительном стрессе погибали.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Противовоспалительное и антиоксидантное действие С-фикоцианина в купе с его безопасностью и природным происхождением делают его перспективным веществом для терапии заболеваний, связанных с дисфункцией митохондрий и окислительным стрессом. На продвинутой клеточной модели на основе дрожжей аэробного типа обмена Y. lipolytica показано, что С-фикоцианин обладает прямым внутриклеточным антиоксидантным действием и частично предотвращает окислительный стресс в дрожжах, индуцированный прооксидантом трет-бутилгидропероксидом, а также увеличивает выживаемость дрожжевых клеток. Тем не менее значительное увеличение концентрации С-фикоцианина само по себе приводит к окислительному стрессу, что говорит о его цитотоксическом действии в больших дозах и существовании определенного диапазона концентраций, где можно ожидать наибольшего терапевтического эффекта. На основе полученных результатов можно также заключить, что дрожжи аэробного типа обмена Y. lipolytica являются отличной системой для оценки действия физиологически активных веществ про- и антиоксидантного действия на клетки и митохондрии.

Авторы выражают благодарность Д.С. Есипову за предоставление SkQ1.

Работа выполнена при поддержке НИЦ “Курчатовский институт” (Тематический план исследований 1.8. “Изучение процессов генерации, передачи и распределения энергии в живых организмах”).