Нейрохимия, 2021, T. 38, № 1, стр. 59-66

ВВЕДЕНИЕ

Моделирование дефицита нейротрансмиттеров у животных, фенотипически отличающихся чувствительностью к стрессу, является одним из наиболее часто используемых методов изучения роли моноаминергических систем головного мозга при тревожных состояниях и механизма действия соединений анксиолитического профиля. Основным подходом моделирования дефицита серотонина (5-окситриптамина, 5-ОT) в мозге является ингибирование ключевого фермента синтеза серотонина триптофан-5-гидроксилазы (TPH2) с помощью необратимых ингибиторов пара-хлорфенилаланина (ПХФА) или фенклонина, а также алиментарный приeм смеси аминокислот, лишeнных триптофана, что приводит к быстрому опустошению запасов 5-ОТ в организме и, в конечном итоге, к значительному снижению содержания данного нейротрансмиттера [1]. Мыши линии BALB/C, отличающиеся от животных линии C57BL/6 пассивной реакцией на моделирование стрессовой ситуации в открытом поле [2], имеют мутацию в гене, кодирующем TPH2, что определяет более низкий базовый уровень и скорость синтеза серотонина в мозге этих животных [3–5].

Афобазол (5-этокси-2-[2-(морфолино)-этилтио]-бензимидазола дигидрохлорид), синтезированный в НИИ фармакологии им. В.В. Закусова. обладает высоким анксиолитическим потенциалом. Механизм анксиолитического действия афобазола связывают с его способностью взаимодействовать с σ1 (сигма) рецепторами, рецепторами мелатонина МТ₁ и МТ₃, а также регуляторным участком МАО-А, оказывая модулирующее влияние на основные нейромедиаторные системы мозга [6, 7]. В частности, нами было установлено наличие селективности действия афобазола в отношении различных нейромедиаторных систем мозга мышей указанных линий [8]. Кроме того, в условиях введения ингибитора декарбоксилазы ароматических кислот NSD-1015 афобазол вызывал снижение содержания ДОФУК в гипоталамусе, а также уровня ГВК в стриатуме крыс, что позволяет говорить об ингибирующем влиянии данного соединения на основной фермент биодеградации ДА моноаминоксидазу B (МАО-B) [9]. Несмотря на то, что в последнее время накоплен значительный объем данных о фармакологических эффектах афобазола, остаeтся по-прежнему мало сведений о влиянии данного препарата на серотонинергическую систему, которая, как известно, играет ведущую роль в нейрохимическом механизме развития тревожных и депрессивных расстройств.

В связи со сказанным, целью данной работы было нейрохимическое исследование эффектов афобазола на содержание моноаминов и их метаболитов в структурах мозга линий мышей с различным эмоциональным фенотипом BALB/C и C57BL/6 в норме и в условиях дефицита 5-ОТ, вызванного введением ПХФА.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные. Опыты проведены на самцах мышей линий C57/Bl/6 и BALB/C массой тела 20–24 г. (питомник РАН “Столбовая”), содержавшихся в условиях лабораторного вивария при 12-часовом световом режиме со свободным доступом к воде и стандартному корму. Для исключения влияния суточных биоритмов на скорость биосинтеза и метаболизма нейромедиаторов эксперименты проводили между 10 и 12 ч дня. Организация и проведение работ осуществлялись в соответствии с приказом Минздрава России № 199 от 01.04.2016 г. “Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики”. Животные содержались в соответствии с СП 2.2.1.3218-14 “Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)" от 29.08.2014 г. № 51. Проведение экспериментов одобрено Комиссией по биомедицинской этике ФГБНУ “НИИ фармакологии им. В.В. Закусова” (протокол № 6 от 16.04.2018 г.).

Исследуемые вещества. Афобазол (ФГБНУ “НИИ Фармакологии им. В.В. Закусова”) растворяли в 0.9% NaCl и вводили в дозе 5 мг/кг внутрибрюшинно за 1 ч до декапитации животных. ПХФА (Sigma) вводился внутрибрюшинно в течение трех дней в дозе 150 мг/кг в первый день и 100 мг/кг в последующие дни). По литературным данным, снижение уровня серотонина, вызванное ПХФА, развивается постепенно, достигает максимума через 3 сут и сохраняется в течение 5–6 сут [10].

Схема эксперимента. Животные были разделены на следующие экспериментальные группы (в скобках – количество животных):

1 группа BALB/С – контроль (0.9% NaCl) (n = 9);

2 группа BALB/С – 0.9% NaCl + афобазол (5 мг/кг) (n = 10);

3 группа BALB/С – ПХФА в суммарной дозе 350 мг/кг (n = 10);

4 группа BALB/С – 0.9% NaCl + афобазол + + ПХФА (n = 10);

5 группа C57BL/6 – контроль (0.9% NaCl) (n = = 10);

6 группа C57BL/6 – 0.9% NaCl + афобазол (5 мг/кг) (n = 9);

7 группа C57BL/6 – ПХФА в суммарной дозе 350 мг/кг (n = 10);

8 группа C57BL/6 – 0.9% NaCl + афобазол + + ПХФА (n = 9).

Нейрохимические исследования. Декапитация животных осуществлялась через 60 мин после введения веществ. Структуры мозга (фронтальная кора (ФК), гиппокамп, гипоталамус, стриатум) извлекались на льду, замораживались, взвешивались и хранились в жидком азоте.

Перед экспериментами по определению содержания нейротрансмиттеров пробы размельчали в ручном гомогенизаторе Поттера (тефлон–стекло) в 1 мл 0.1 N HCIО₄ с добавлением 3,4-диоксибензиламина (0.5 нмоль/мл) в качестве внутреннего стандарта. Пробы центрифугировали при 10 000 g в течение 10 мин. Содержание моноаминов и их метаболитов (норадреналина (НА), дофамина (ДА), 3,4-диоксифенилуксусной кислоты (ДОФУК), гомованилиновой кислоты (ГВК), серотонина (5-окситриптамина, 5-ОТ) и 5-оксииндолилуксусной кислоты (5-ОИУК) определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (ВЭЖХ/ЭД) на хроматографе LC-304T (ВАS, West Lafayette, США) с аналитической колонкой ReproSil-Pur ODS (C₁₈, 100 × 4 мм, 3 мкм) (Dr.Maisch, Германия) [11].

Обработку полученных данных о содержании моноаминов в структурах мозга проводили следующим образом: нормальность распределения данных проверяли с помощью критерия Шапиро–Уилка. Так как распределение результатов измерений было близко к нормальному, статистическую значимость различий анализировали с помощью трехфакторного дисперсионного анализа с дальнейшей обработкой методом множественных сравнений по Дункану при критическом уровне значимости α = 0.05. Приведены средние значения и стандартные ошибки среднего (М ± S.E.M.).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В табл. 1 представлено содержание моноаминов и их метаболитов в структурах мозга контрольных интактных групп линий мышей BALB/C и C57Bl/6 (0.9% NaCl), не подвергавшихся внешнему воздействию.

При сравнении нейрохимических показателей двух линий животных установлено, что у мышей линии BALB/С уровень НА в ФК и гиппокампе достоверно ниже соответствующих значений этого параметра у мышей линии C57BL/6. В гипоталамусе, напротив, его содержание было достоверно выше. Уровень метаболитов дофамина ДОФУК и ГВК в гипоталамусе и амигдале чувствительных к стрессу мышей, а также содержание самого нейротрансмиттера в гипоталамусе был значительно выше уровней соответствующих значений мышей C57BL/6. Параметры серотонинергической системы мышей линии BALB/C статистически достоверно отличались от линии C57BL/6 более высоким содержанием 5-ОТ в амигдале, однако в гиппокампе его уровень был ниже (табл. 1).

Афобазол при однократном введении в дозе 5 мг/кг вызывал изменение содержания нейротрансмиттеров в структурах головного мозга мышей обеих линий, при этом большая часть этих эффектов затрагивала преимущественно функционирование серотонин- и норадренергической систем. В гипоталамусе, амигдале и гиппокампе мышей C57BL/6 отмечалось увеличение уровня НА, в то время как у животных BALB/C его концентрация достоверно снижалась в стриатуме и гиппокампе (табл. 2). Афобазол вызывал увеличение содержания 5-ОТ практически во всех исследуемых структурах мозга (за исключением стриатума) мышей линии C57BL/6, при этом содержание метаболита 5-ОИУК и величина показателя скорости метаболизма 5-ОТ (5-ОИУК/5-ОТ) во всех структурах достоверно снижались. Аналогичное замедление метаболизма серотонина наблюдалось в структурах мозга (кроме амигдалы) мышей линии BALB/C, однако оно не сопровождалось накоплением самого нейротрансмиттера, напротив, отмечалось снижение его уровня в стриатуме.

Эффекты афобазола на параметры дофаминергической системы характеризовались значительным (до 264%) увеличением содержания ДА в амигдале мышей с пассивной реакцией на стресс. В той же структуре животных линии C57BL/6 также наблюдалось увеличение уровня ДА, но в существенно меньшей степени (до 145%). Было обнаружено снижение содержания ДОФУК и ГВК в стриатуме мышей с активной (на 47 и 45% соответственно) и пассивной (на 40 и 30% соответственно) реакцией на стресс (табл. 2).

Введение ПХФА в суммарной дозе 350 мг/кг в течение 3-х дней предсказуемо вызвало значительное снижение содержания 5-ОT и 5-ОИУК в исследуемых структурах головного мозга у обеих линий мышей. Следует отметить, что у мышей с пассивной реакцией на стресс (BALB/C) наблюдалось более интенсивное снижение данных показателей – на 70–80% от значений контрольной группы, что в 2–2.5 раза было ниже показателей мышей линии C57BL/6. ПХФА значительно снижал уровень НА в гипоталамусе, амигдале и стриатуме у чувствительных к стрессу мышей, не влияя на данный показатель у мышей линии C57BL/6. Величины параметров дофаминергической передачи при этом практически не изменялись в структурах мозга обеих линий мышей (табл. 2).

Афобазол в условиях моделирования дефицита серотонина путем субхронического введения ПХФА оказывал влияние на параметры дофаминергической нейропередачи. В гипоталамусе и стриатуме мышей BALB/C и C57BL/6 отмечалось снижение содержания ДОФУК и оборота ДА, показателя ДОФУК/ДА. Наибольший интерес представляют данные о влиянии афобазола на содержание 5-ОТ и 5-ОИУК. Показано, что афобазол вызывал увеличение содержания 5-ОТ, сниженного в результате введения ПХФА, в гипоталамусе мышей с пассивной реакцией на стресс (BALB/C) и во ФК, амигдале, гиппокампе у устойчивых к стрессу мышей (C57BL/6). Величина показателей скорости метаболизма 5-ОИУК/5-ОТ снижалась в ФК, гипоталамусе и амигдале обеих линий мышей в сходной степени. Однако уровень восстановления афобазолом дефицита серотонина был выше у мышей линии C57BL/6. Существенное увеличение содержания НА, сниженного ПХФА, отмечалось в амигдале и гиппокампе мышей линии C57BL/6 и гипоталамусе стресс-чувствительных мышей.

Наблюдавшееся нами снижение содержание 5-ОT в структурах головного мозга мышей BALB/C и C57BL/6 (табл. 2) согласуется с данными литературных источников, согласно которым субхроническое введение ПХФА в течение 3-х дней приводило к снижению содержания 5-ОT на 80% от исходных значений. Этот эффект является следствием ингибирования ПХФА триптофан-5-гидроксилазы – основного фермента синтеза 5-ОT [10, 12]. В нашем исследовании ПХФА вызывал более глубокое снижение уровня серотонина (на 80%) и его метаболита в структурах мозга мышей линии BALB/C, что свидетельствуют о нарушении скорости синтеза серотонина у этих животных [13].

Данные о влиянии афобазола на параметры серотонинергической системы согласуются с результатами наших предыдущих исследований. Так, афобазол на модели нарушения синтеза серотонина при введении ингибитора декарбоксилазы ароматических кислот NSD-1015 вызывал увеличение содержания предшественника серотонина 5-окситриптофана (5-ОТФ), самого нейромедиатора и его метаболита 5-ОИУК в гипоталамусе крыс на 50, 60 и 50% соответственно, что позволяет предположить, что данный анксиолитик оказывает влияние на фермент синтеза 5-ОТФ триптофангидроксилазу [9]. В другом исследовании, проведенном нашим коллективом, совместное введение афобазола и антагониста 5-НТ2b/2c рецепторов SB-200646А вызывало увеличение содержания 5-ОТ и 5-ОИУК в гиппокампе мышей BALB/C, что может быть интерпретировано как позитивная модуляция эффекта анксиолитика, обусловленная блокадой серотониновых рецепторов 5-НТ2 типа и, таким образом, свидетельствовать о вовлечении указанных рецепторов в реализацию анксиолитического эффекта афобазола [14]. В настоящем исследовании в условиях дефицита 5-ОТ, вызванного ПХФА, увеличение содержания нейротрансмиттера, вызванное афобазолом, происходило за счет снижения его метаболизма, вызванного, вероятнее всего, ингибированием фермента биодеградации – моноаминоксидазы А (МАО-А) [6]. Важно отметить, что афобазол в наибольшей степени корректировал ПХФА-индуцированный дефицит 5-ОT в структурах мозга мышей устойчивых к стрессу – линии C57BL/6, практически полностью восстанавливая его уровень в ФК, гипоталамусе и амигдале. Более умеренный эффект препарата на чувствительных к стрессу мышей линии BALB/C можно объяснить генетически детерминированным низким содержанием ферментов МАО-В и МАО-А и, возможно, триптофан-5-гидроксилазы [4–6].

Интересно отметить, что афобазол увеличивает концентрацию НА в тех же структурах мозга, в которых отмечалось и увеличение содержания 5‑ОТ. В условиях ПХФА-индуцированного истощения это происходит в амигдале и гиппокампе мышей линии C57BL/6 и в гипоталамусе мышей линии BALB/C, а в условиях нормы – в амигдале, гиппокампе и гипоталамусе стресс-устойчивых мышей. Подобное увеличение концентрации норадреналина и серотонина в синаптической щели вызывают практически все антидепрессанты различной структуры. В частности, антидепрессант миртазапин, блокируя альфа-2 рецепторы норадреналина, по принципу отрицательной обратной связи повышает содержание в синаптической щели НА и 5-ОТ. В нашем эксперименте действие афобазола свидетельствует скорее об ингибировании деградации нейротрансмиттеров за счет угнетения активности фермента МАО-А. Это предположение подтверждают данные, полученные при изучении спектра рецепторного связывания афобазола [6].

Влияние афобазола на показатели дофаминергической нейропередачи согласуется с данными, полученными нами ранее. В частности, было показано, что афобазол в условиях введения ингибитора декарбоксилазы ароматических кислот NSD-1015 вызывает снижение содержания ДОФУК в гипоталамусе, а также уровня ГВК в стриатуме крыс, что может говорить об ингибирующем влиянии первого на основной фермент биодеградации ДА моноаминоксидазу B (МАО-B) [9]. В данной работе эффекты афобазола на содержание метаболитов дофамина ДОФУК и ГВК в гипоталамусе и стриатуме обеих линий мышей также могут объясняться сходным образом – введение афобазола приводит к замедлению утилизации ДА.

Что касается межлинейных отличий поведенческих эффектов афобазола на животных с различным фенотипом эмоционального реагирования, то из литературы известно о влиянии препарата лишь на определенный фенотип – у животных с наследственно детерминированной реакцией страха при эмоционально-стрессовом воздействии (линия BALB/C), у людей с индивидуально-типологическими чертами, характеризующими психическую неустойчивость к стрессорным факторам [15].

Результаты настоящей работы подтверждают полученные нами ранее данные об участии серотонинергических систем мозга в реализации эффектов афобазола и раскрывают роль адренергической системы. В условиях ПХФА-индуцированного дефицита серотонина препарат воздействует как на стрессоустойчивых, так и на эмоционально лабильных животных, что выражается в компенсаторном восстановлении содержания серотонина во фронтальной коре, амигдале и гиппокампе мышей линии C57BL/6 и в гипоталамусе мышей BALB/C. При этом афобазол увеличивает содержание норадреналина в амигдале и гиппокампе мышей C57BL/6 и в гипоталамусе и амигдале мышей BALB/C.