Онтогенез, 2019, T. 50, № 5, стр. 332-339

ВВЕДЕНИЕ

Трансплантация ткани яичников рассматривается как один из возможных способов восстановления гормонального и репродуктивного статуса у женщин, подвергшихся противоопухолевой терапии (Bedaiwy et al., 2008). Современные клинические протоколы аллогенной трансплантации и новейшие иммуносупрессорные препараты позволяют продлить срок жизни трансплантата, однако не предотвращают полностью индукцию иммунных процессов в организме реципиента, направленных на отторжение (Gourishankar et al., 2010). Кроме того, потенциально опасные побочные эффекты долговременной иммуносупрессии снижают качество жизни пациентов. В связи с этим проблема развития донорспецифической толерантности (ДСТ), позволяющей организму реципиента “принимать” пересаженные органы или ткани при сохранении компетентности иммунной системы, остается ключевой. В настоящее время разрабатывается стратегия индукции ДСТ трансфузией клеток донора с последующей (или одновременной) пересадкой органа от того же донора (Brennan et al., 1995; Божок и др., 2009; Leventhal et al., 2013). Вместе с тем, механизм развития ДСТ во многом остается неясным, что определяет актуальность исследований в данном направлении.

Ранее нами было показано, что индукция ДСТ у крыс линии Август путем введения в воротную вену клеток селезенки доноров-крыс Вистар увеличивает жизнеспособность аллотрансплантатов ткани яичников и активирует экспрессию иммунных протеасом с субъединицей LMP2 в печени и ткани яичников к 30 сут после трансплантации (Карпова и др., 2012). Кроме того, было показано влияние генетически детерминированных донор-реципиентных различий на экспрессию иммунных протеасом в клетках печени крыс-реципиентов и выявлено два важных факта. Во-первых, как у крыс Вистар, так и у крыс Август приживление гетеротопических аллотрансплантатов ткани яичников связано с увеличением числа мононуклеарных клеток печени, экспрессирующих иммунные протеасомы с субъединицей LMP2, но не LMP7. Во-вторых, у реципиентов-крыс Вистар эта разница была более выражена, чем у реципиентов-крыс Август (Карпова и др., 2018), что можно объяснить повышенным содержанием моноаминов и белка теплового шока 70 в головном мозге крыс Август (Erokhov et al., 2017). Поскольку клетки печени обеспечивают развитие толерантности к чужеродным антигенам (Карпова и др., 2017), неслучайно влияние различных факторов на этот процесс. Вместе с тем, остается неясным, существует зависимость экспрессии иммунных протеасом в аллотрансплантате от комбинаций пар “донор-реципиент” или не существует. В связи с различным влиянием активаторов протеасом на образование паттерна эпитопов при расщеплении аллоантигенов важно также иметь информацию об их экспрессии в аллотрансплантатах у разных пар “донор-реципиент”.

Цель настоящей работы – исследовать динамику приживления ткани яичников крыс инбредной линии Август, трансплантированной аутбредным крысам Вистар, и наоборот, на фоне индукции донорспецифической толерантности, и выявить особенности пулов протеасом в прижившихся трансплантатах и ткани, замещающей отторгнутые трансплантаты, у животных обеих групп.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные. Эксперименты проводили на 5–6-месячных самках крыс инбредной линии Август и аутбредных крыс Вистар в соответствии с положениями Комиссии по биоэтике ФГБУН Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. Животных группировали в разных комбинациях пар “донор-реципиент”: 1 группа – крысы Август доноры, крысы Вистар реципиенты (n = 25); 2 группа – крысы Вистар доноры, крысы Август реципиенты (n = 30).

Индукция ДСТ и трансплантация. ДСТ индуцировали путем введения клеток селезенки донорского происхождения в воротную вену печени крысам реципиентам, как описано ранее (Карпова и др., 2012). Яичники от неонатальных крыс трансплантировали реципиентам через 7 сут после индукции ДСТ под капсулу почки в соответствии с опубликованным протоколом (Карпова и др., 2012) за исключением того, что реципиентам не проводили овариэктомию с целью сохранения физиологического уровня репродуктивных гормонов и их воздействия на трансплантат.

Оценка приживления трансплантатов. Ткань яичников исследовали на 7, 14, 30 и 37 сут после трансплантации (по 5 животных для каждой точки). Почки с аллотрансплантатами фиксировали в 4% параформальдегиде. Для морфологической диагностики отторжения/приживления из ткани трансплантатов, собранной на разных сроках после операции, готовили криостатные срезы и окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике. Площадь сохранившейся ткани яичника оценивали в 7–8 серийных срезах трансплантатов, полученных от каждого животного, с помощью программы AxioVision Rel. 4.8. Результат нормировали на общую площадь трансплантата и выражали в процентах.

Антитела. Для иммуногистохимии и Вестерн-блоттинга использовали моноклональные антитела мыши к субъединицам α1,2,3,5,6,7 протеасом, иммунным субъединицам LMP2 и LMP7 протеасом, субъединице Rpt6 активатора РА700 протеасом, поликлональные антитела кролика к субъединице РА28α активатора РА28αβ протеасом (Enzo Life Sciences, США), моноклональные антитела мыши к β актину (Santa Cruz Biotechnology, США), антитела осла к IgG мыши, меченные Alexa 594 (Invitrogen, США), антитела козы к IgG мыши и кролика, конъюгированные с пероксидазой (Amersham Biosciences, Великобритания).

Иммуногистохимия. Криостатные срезы интактной ткани яичников доноров, прижившихся аллотрансплантатов яичников и ткани, замещающей трансплантат при его отторжении, обрабатывали первыми антителами мыши к субъединицам LMP2 и LMP7 (1 : 500) и вторыми антителами к IgG мыши, меченными Alexa 594 (1 : 700), в соответствии с процедурой, описанной ранее (Erokhov et al., 2017). Иммунофлуоресценцию исследовали с помощью конфокального лазерного микроскопа Carl Zeiss Axio Observer Z1 (Германия). Для обработки изображения использовали программу LSM Image Examiner (Carl Zeiss, Германия).

Вестерн-блоттинг. Осветленные гомогенаты тканей получали в соответствии с опубликованным протоколом (Карпова и др., 2012). После электрофореза осветленных гомогенатов в 13%-ном ПААГ в присутствии SDS (5 мкл на дорожку) полипептиды переносили с помощью мокрого блоттинга на нитроцеллюлозную мембрану. Обработку мембраны антителами к β актину (1 : 1000), субъединицам протеасом (1 : 1000) и активаторов протеасом (1 : 1500) осуществляли стандартным методом (Erokhov et al., 2017). Оптическую плотность полос на рентгеновской пленке анализировали с помощью стандартной программы ImageJ.

Статистический анализ. Статистическую обработку данных проводили с помощью программ Excel и Statistica 7.0. Значимость различий между выборками оценивали с помощью непараметрического критерия Манна–Уитни. Приживление трансплантатов анализировали с помощью метода Каплана–Майера, сравнение кривых приживления производили с использованием логарифмического рангового критерия.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Приживление аллотрансплантатов яичников. Незначительная разница в приживлении аллотрансплантатов яичников при их гетеротопической пересадке под капсулу почки крысам Вистар и Август на фоне индукции ДСТ выявлена на 14 сут после операции (рис. 1а). Эта разница увеличивалась к 30 сут, а на 37 сут доля аллотрансплантатов ткани яичников с хорошо сохранившейся структурой и значительной васкуляризацией у крыс Вистар в 2.6 раз превышала таковую у крыс Август. Обнаруженный факт, очевидно, связан с особым состоянием центральной нервной системы крыс Август, обусловленным повышенным содержанием моноаминов и белка теплового шока 70 (Erokhov et al., 2017). Следует отметить, что при гетеротопической пересадке ткани яичников под капсулу почки в отсутствие индукции ДСТ происходит ее отторжение и полное замещение соединительной тканью вследствие развития иммунного ответа на 22–25 сут после операции у 100% реципиентов (Божок и др., 2009).

Рис. 1.

Приживление гетеротопических аллотрансплантатов яичников у крыс Вистар и Август после индукции донорспецифической толерантности (а). Кривые приживления представлены для двух комбинаций пар “донор-реципиент”. Отличие от приживления трансплантата в тот же период у крыс Август при * р < 0.05, ** р < 0.01. Гистологические препараты аллотрансплантата яичника (б) и ткани, замещающей отторгнутый трансплантат (в), на 37 сут после трансплантации крысам Вистар. Шкала, 50 мкм.

Прижившиеся трансплантаты на фоне индукции ДСТ у обеих групп реципиентов на 37 сут содержали фолликулы различных стадий зрелости, а также небольшие очаги лимфоцитарно-макрофагальной инфильтрации и незначительные участки формирования соединительной ткани (рис. 1б). Образцы ткани, замещающей отторгнутые трансплантаты яичников у животных обеих групп, представляли собой преимущественно рыхлую волокнистую соединительную ткань (рис. 1в). Фолликулы в этих образцах не обнаруживались, однако выявлялись обширные зоны лимфоцитарно-макрофагальной инфильтрации в толще ткани и на границе с паренхимой почки. В дальнейших экспериментах использовали собранные на 37 сут образцы трансплантатов с целью выявления возможных различий в протеасомных механизмах, обеспечивающих приживление или отторжение ткани яичников у крыс Вистар и Август.

Экспрессия иммунных протеасом в трансплантатах. Общий уровень протеасом оценивали Вестерн-блоттингом по экспрессии субъединиц α1,2,3,5,6,7, входящих в состав всех форм протеасом. К 37 сут после трансплантации общий уровень протеасом был одинаков в интактной донорской ткани яичников, прижившихся трансплантатах и ткани, замещающей отторгнутые трансплантаты, и не зависел от донор-реципиентных различий (рис. 2а). Однако картина экспрессии иммунных протеасом в этих тканях была иной. Отметим низкий базовый уровень иммунных протеасом в интактной донорской ткани яичников. Это касается как субтипов, содержащих иммунную субъединицу LMP7, так и субтипов, содержащих иммунную субъединицу LMP2 (рис. 2а), а, следовательно, и субтипов с иммунной субъединицей LMP10 (MECL-1), встраивающейся во вновь образующиеся протеасомы, главным образом, в связке с субъединицей LMP2 (Groettrup et al., 1997). Низкое содержание иммунных протеасом в железистой ткани объяснимо, так как в норме ее функции не связаны с развитием иммунных реакций. Вместе с тем, в прижившихся трансплантатах и замещающей ткани обнаружена увеличенная экспрессия иммунных протеасом по сравнению с интактной донорской тканью яичников (рис. 2а, 2б). При этом прижившиеся трансплантаты были обогащены протеасомами с иммунной субъединицей LMP2, а замещающая ткань – протеасомами с иммунной субъединицей LMP7 в равной степени у крыс Август и Вистар.

Рис. 2.

Содержание субъединиц протеасом в интактной донорской ткани яичников (1), прижившихся гетеротопических аллотрансплантатах яичников (2) и ткани, замещающей отторгнутые трансплантаты, на 37-е сут после трансплантации (3). (а) – крысы Август реципиенты, (в) – крысы Вистар реципиенты. (а) Вестерн блоты с использованием соответствующих антител, (б, в) – относительное содержание субъединиц протеасом в прижившихся аллотрансплантатах и замещающей ткани по отношению к интактной донорской ткани яичников. Данные нормализованы на содержание β актина и представлены как среднее ± стандартное отклонение. Отличие от соответствующего значения у крыс с отторгнутыми трансплантатами при * р < 0.01 и ** р < 0.005.

С помощью иммунофлуоресцентного анализа в прижившемся трансплантате у крыс Август и Вистар обнаружены протеасомы с иммунной субъединицей LMP2 в фолликулах и клетках стромы ткани яичников, а также в единичных клетках, локализующихся возле сосудов и, возможно, представляющих собой макрофаги (рис. 3а). При этом протеасомы с субъединицей LMP7 выявлялись по всей площади трансплантата гораздо слабее (рис. 3б). В замещающей ткани у крыс обеих групп обнаружены обширные очаги лимфоцитарно-макрофагальной инфильтрации, обогащенные иммунными протеасомами с субъединицей LMP7. Менее выраженная экспрессия протеасом с субъединицей LMP2 обнаружена также в очагах инфильтрации в ткани, замещающей отторгнутые трансплантаты, у крыс Август и Вистар. Данные представлены для реципиентов-крыс Вистар (рис. 3в, 3г). В интактной ткани яичников доноров иммунная субъединица LMP2 практически не выявлялась (рис. 3д). Вместе с тем, в мозговом слое присутствовали единичные клетки, экспрессирующие протеасомы с иммунной субъединицей LMP7 (рис. 3е). Они расположены, в основном, в строме яичника рядом с кровеносными сосудами. В кортикальном слое яичников LMP7-позитивные клетки практически отсутствовали. Экспрессия протеасом с субъединицей LMP7 в строме интактной ткани яичников, связана, вероятнее всего, с тканевыми макрофагами, которые осуществляют регуляторную связь между иммунной и репродуктивной системами, а также участвуют в процессах ремоделирования ткани в фазах созревания фолликула, овуляции и образования желтого тела (Wu et al., 2004). В целом, результаты, полученные с помощью метода иммуногистохимии, совпадают с результатами Вестерн-блоттинга по интенсивности экспрессии иммунных субъединиц протеасом.

Рис. 3.

Иммунофлуоресцентное мечение клеток на срезах прижившихся гетеротопических аллотрансплантатов яичников (а, б), ткани, замещающей отторгнутые трансплантаты (в, г), и интактной донорской ткани яичников (д, е) антителами к субъединицам LMP2 (а, в, д) и LMP7 (б, г, е). Шкала, 50 мкм. Доноры – крысы Август, реципиенты – крысы Вистар.

Инфильтрация клеток иммунной системы, обогащенных иммунными протеасомами, в ткань трансплантата при его отторжении объясняется классическим протеканием иммунных процессов, направленных на уничтожение чужеродных клеток (Sharova, 2006; Morozov, Karpov, 2018). Ведущая роль в этом процессе, очевидно, принадлежит субтипу протеасом с иммунной субъединицей LMP7, которая важна не только для образования антигенных эпитопов, но и для контролирования пролиферации Т-лимфоцитов (Caudill et al., 2006).

Однако высокая экспрессия протеасом с иммунной субъединицей LMP2, присущая клеткам прижившейся ткани яичников, не может быть связана с образованием антигенных эпитопов для представления клеток-мишеней цитотоксическим Т-лимфоцитам. В данном случае функции субтипа протеасом с субъединицей LMP2 не соответствуют сложившимся представлениям об иммунных протеасомах как участниках иммунных процессов против чужеродной ткани. Напротив, этот субтип иммунных протеасом, по-видимому, образует пептиды, функции которых направлены на поддержание жизнеспособности фолликулов чужеродных яичников. Активация экспрессии субъединицы LMP2, возможно, осуществляется под действием комплекса сигналов от макрофагов печени, где при индукции ДСТ происходит “первая встреча” чужеродных антигенов донора с организмом реципиента.

Экспрессия активаторов протеасом в трансплантатах. В донорской интактной ткани яичников крыс Август и Вистар выявлены субъединицы Rpt6 и РА28α, входящие в состав активаторов РА700 и РА28αβ протеасом соответственно (рис. 2а). В прижившихся трансплантатах яичников и ткани, замещающей отторгнутые трансплантаты, у крыс обеих групп экспрессия субъединицы Rpt6, а, следовательно, активатора РА700 была снижена, в то время как экспрессия субъединицы РА28α и, следовательно, активатора РА28αβ была значительно повышена по сравнению с донорской тканью (рис. 2а, 2в). Прижившиеся трансплантаты у крыс Август и Вистар отличалась самым высоким содержанием активатора РА28αβ.

Очевидно, рутинное расщепление убиквитинированных белков комплексом конститутивных протеасом и активатора РА700, свойственное интактной ткани яичников, отступает на второстепенный план в активном процессе ее приживления. Главная роль в этом процессе, по-видимому, принадлежит биологически активным пептидам, образующимся иммунными протеасомами с субъединицей LMP2 в связке с активатором РА28αβ. В пользу данного предположения служит факт преимущественного “нарезания” пептидов малой длины (менее 8 аминокислотных остатков) под действием активатора РА28αβ по сравнению с активатором РА700 (Cascio, 2014). Функция образующихся в трансплантате пептидов может быть связана с их участием в межклеточных взаимодействиях, обеспечивающих приживление.

Ранее нами опубликованы результаты, указывающие на участие субтипа иммунных протеасом LMP2−РА28αβ в адаптации головного мозга крыс Август к повышенному содержанию моноаминов (Erokhov et al., 2017). Нельзя исключить наличие универсальной функции у данного субтипа протеасом в различных адаптивных процессах, включая адаптацию аллотрансплантатов к организму реципиента.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе впервые проанализированы пулы протеасом прижившихся аллотрансплантатов яичников и ткани, замещающей отторгнутые трансплантаты, на фоне индукции ДСТ в зависимости от генетически детерминированных различий в организации адаптационных реакций организма крыс-реципиентов. Протеасомы аллотрансплантатов яичников, содержащие иммунную субъединицу LMP2, и, вероятно, связанные с активатором РА28αβ, служат одним из ключевых факторов, которые обеспечивают их приживление независимо от этих особенностей реципиентов.

Полученные в настоящей работе результаты вносят вклад в понимание молекулярных механизмов развития толерантности у животных с различной генетической основой и указывают на новую функцию иммунных протеасом с субъединицей LMP2 в процессе, направленном на приживление чужеродной ткани, а не на ее уничтожение.

Работа выполнена в рамках Государственного задания (№ 0108-2019-0002) и проекта РФФИ (№ 16-34-60083 мол_а_дк).