Онтогенез, 2020, T. 51, № 2, стр. 96-112

ПОЗВОНОЧНЫЕ: МОЛЕКУЛЯРНЫЕ АСПЕКТЫ УСТАНОВЛЕНИЯ АСИММЕТРИИ ПЛАНА СТРОЕНИЯ

Установление лево-правой асимметрии у всех изученных позвоночных животных происходит благодаря работе сигнального каскада Nodal. Его наличие и роль в установлении асимметрии показаны у представителей млекопитающих – домовых мышей Mus musculus, кроликов Oryctolagus cuniculus, свиней Sus scrofa domesticus, коров Bos taurus (Blum et al., 2007; Schröder et al., 2016); у курицы Gallus gallus (Levin et al., 1995); у представителей амфибий – шпорцевых лягушек Xenopus laevis и X. tropicalis, аксолотля Ambystoma mexicanum (Schweickert et al., 2007; Yu et al., 2002); костистых рыб – Danio rerio, медаки Oryzias latipes (Essner et al., 2005; Hojo et al., 2007). Более того, гены, гомологичные генам сигнального каскада Nodal у позвоночных, участвуют в установлении лево-правой асимметрии у вторичноротых беспозвоночных: ланцетника Amphioxus sp., оболочников – асцидий Ciona intestinalis и Halocynthia roretzi (Morokuma et al., 2002), иглокожих – морских ежей Paracentrotus lividus и Strongylocentrotus pallidus (Duboc et al., 2005; Tisler et al., 2016), что свидетельствует об его высокой эволюционной консервативности.

Сигнальный каскад Nodal у позвоночных функционирует на стадиях нейруляции и сомитогенеза. Ключевым звеном этого каскада является ген nodal, принадлежащий к суперсемейству TGF-β. Nodal экспрессируется на левой стороне тела эмбриона вблизи средней линии и обусловливает дальнейшее развитие левой стороны тела по “левому” сценарию: если там не произойдет вспышки его экспрессии, у эмбриона сформируются две правые стороны (Saijoh et al., 2003). Далее белок Nodal по внеклеточному матриксу диффундирует в мезодермальные клетки на левой стороне тела (Oki et al., 2007) и там запускает экспрессию гомеобоксного гена pitx2, который будет постоянно экспрессироваться в клетках мезодермы боковой пластинки на левой стороне, управляя дальнейшим установлением асимметрии органов (Logan et al., 1998). Вспышка экспрессии белка Nodal на левой стороне тела длится недолго (6–7 ч у мыши) (Shiratori, Hamada, 2006), поскольку он активирует несколько генов, продукты которых подавляют экспрессию и распространение Nodal. В клетках боковой мезодермальной пластинки он индуцирует экспрессию белка Lefty2. Диффундировав в область средней линии эмбриона, он запускает экспрессию Lefty1. Lefty1 подавляет экспрессию Nodal вблизи средней линии и тем самым не позволяет ему распространиться на правую сторону эмбриона (Meno et al., 1998), а Lefty2 подавляет его экспрессию в боковой мезодерме (рис. 1), таким образом экспрессия Nodal ограничивается с двух сторон. Помимо того, на правой стороне эмбриона экспрессируется ген cerl2 (cerberus-like 2), продукт которого блокирует диффузию белка Nodal, связываясь с ним в комплексы. По-видимому, именно этот ген, вначале экспрессирующийся на обеих сторонах тела, принимает первичный сигнал к установлению асимметрии на левой стороне, прекращает работать, за счет этого белок Nodal высвобождается и усиливает экспрессию собственного гена на левой стороне тела (Schweickert et al., 2010; Shinohara et al., 2012). В отсутствие любого из генов-репрессоров Nodal происходит его неконтролируемое просачивание на правую сторону, что приводит к ошибкам асимметризации и частичному или полному развитию правой стороны по “левому” сценарию.

Рис. 1.

Схема биохимического сигнального каскада Nodal, запускающего асимметричное развитие левой стороны тела эмбриона мыши. На врезке условная схема эмбриона мыши во время гаструляции, вид с вентральной стороны. А и Р – передняя и задняя стороны тела эмбриона, L и R – левая и правая стороны. По данным Lee, Anderson, 2008.

ПОЗВОНОЧНЫЕ: СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИИ ОРГАНИЗАТОРОВ ЛЕВО-ПРАВОЙ АСИММЕТРИИ

Асимметричная экспрессия Nodal у большинства позвоночных животных (мыши M. musculus, кролика O. cuniculus, коровы B. taurus, амфибий X. laevis и X. tropicalis, A. mexicanum, костистых рыб D. rerio и O. latipes, осетровой рыбы A. transmontanus) возникает в результате работы так называемого лево-правого организатора. Это участок мезодермы, имеющий эпителиальное строение и покрытый подвижными ресничками, недолгое время существующий на стадиях гаструлы и нейрулы и создающий ток жидкости во внеклеточном прстранстве, который запускает сигнальный каскад в мезодерме левой стороны тела эмбриона. Лучше всего строение и работа лево-правого организатора изучены у мыши.

Мышь: лево-правый организатор – узелок

Лево-правым организатором домовой мыши является вентральная часть узелка, появляющегося во время гаструляции и являющегося гомологом дорзальной губы бластопора. Узелок закладывается к седьмому дню развития в эпибласте в области будущего головного конца эмбриона (рис. 2а). Важно отметить, что у мыши гипобласт, подстилающий эпибласт, не является сплошным слоем. Именно под узелком он расходится в стороны и образует отверстие. Таким образом, зрелый узелок выглядит как ямка на вентральной стороне эмбриона длиной около 70 мкм и состоит примерно из 250 клеток (Sulik et al., 1994) (рис. 2б). Узелок окружен 20–30 более плоскими клетками, т.н. парахордальными. На поперечном разрезе узелка можно различить два слоя: слой хордомезодермы и слой эктодермальных клеток, которые впоследствии образуют нервную пластинку (Sulik et al., 1994; Blum et al., 2007) (рис. 2в).

Рис. 2.

(а) Общий вид эмбриона мыши на стадии гаструляции. (б) Узелок эмбриона мыши, вид с вентральной стороны. (в) Поперечный срез через узелок эмбриона мыши. (г). Реснички на клетках узелка. А и Р – передняя и задняя стороны тела эмбриона, L и R – левая и правая стороны; (в) используется с разрешения Schröder et al., 2016. Финальная, опубликованная версия статьи доступна на http://www.karger.com/?doi=10.1159/000440951; (а, б, г) адаптировано из Hamada, 2016 согласно условиям Creative Commons Attribution-NonCommercial 2.5 International License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/2.5/).

Итак, апикальная сторона мезодермальных клеток узелка (обращенная на вентральную сторону эмбриона) направлена в полость желточного мешка и не прикрыта гипобластом. Это обстоятельство чрезвычайно важно для установления лево-правой асимметрии.

Каждая из мезодермальных клеток узелка несет на апикальной стороне по одной ресничке (рис. 2г), причем эти реснички совершают вращательные движения по часовой стрелке со скоростью около 600 оборотов в минуту (Okada et al., 1999). При потере ресничек (например, при выключении генов моторных белков KIF3A и KIF3B из суперсемейства кинезинов, необходимых для формирования ресничек) лево-правая ось вовсе не формируется, и латерализация органов происходит случайным образом, при этом эмбрионы оказываются нежизнеспособными (Nonaka et al., 1998). Не столько важно, впрочем, наличие ресничек само по себе, сколько их подвижность: показано, что неподвижность ресничек из-за поломки гена аксонемного динеина (lrd) приводит к таким же нарушениям, что и их полное отсутствие (Supp et al., 1997; Okada et al., 1999).

Суммарное вращение ресничек создает в области узелка ток жидкости справа налево, причем достаточно быстрый: около 20 мкм/с (Okada et al., 1999; Shiratori, Hamada, 2006). Именно асимметрично направленный ток является ключевым моментом, определяющим дальнейшую асимметризацию правой и левой сторон тела эмбриона (Blum et al., 2009). Гипотеза о важности асимметричного тока жидкости получила название Nodal flow, то есть узелковый ток. Показано, что при создании в узелке мыши искусственного потока жидкости справа налево (то есть в обратном направлении), если он достаточно сильный, чтобы нивелировать эффект биения ресничек, все эмбрионы приобретают состояние situs inversus. Искусственный поток также позволяет произвольно задавать situs inversus или situs solitus у мышей с неподвижными ресничками, в зависимости от направления тока (Nonaka et al., 2002).

На первый взгляд, круговые движения ресничек должны создавать круговой ток, и никакого направленного тока не получится. Тем не менее, наблюдаемый in vivo ток в самом узелке отчетливо левонаправленный. Биофизическое моделирование показало, что левонаправленный ток возможен в том случае, если все реснички отклонены назад минимум на 5°–25° (Cartwright et al., 2004). При последующих наблюдениях оказалось, что апикальная поверхность каждой клетки имеет куполообразную форму; базальное тело каждой реснички смещено в постериорном направлении и из-за куполообразной формы клетки оказывается отклонено кзади в среднем на 26.6° (Nonaka et al., 2005). В результате над поверхностью клеток ток становится более-менее однонаправленным. Обратный ток, по-видимому, проходит между ресничками и поверхностью клеток ниже и постериорнее прямого тока, выражен слабее и не влияет на направление главного потока, проходящего над ресничками (рис. 3).

Рис. 3.

Модель результирующего тока жидкости в узелке мыши. А и Р – передняя и задняя стороны тела эмбриона, L и R – левая и правая стороны.

Важную роль в расположении базальных тел ресничек играет цитоскелет, а именно сеть актиновых микрофиламентов. При мутациях белков Cofilin1, Vangl2, отвечающих за перестройки актинового цитоскелета, базальные тела ресничек остаются в центре клетки, и это приводит к нарушениям в определении лево-правой оси (Mahaffey et al., 2013).

Парахордальные клетки, расположенные по бокам от узелка, несут каждая по одной неподвижной ресничке (McGrath et al., 2003). По-видимому, именно парахордальные клетки отвечают за восприятие тока жидкости, созданного биением ресничек. На данный момент сосуществуют две гипотезы о механизмах восприятия этого тока. Первая – химическая, или гипотеза переноса морфогена – утверждает, что клетки узелка выделяют везикулы с ретиноевой кислотой и белком Sonic hedgehog, которые с током жидкости направляются на левую сторону и там сливаются с мембранами парахордальных клеток, запуская в них каскад Nodal (Nonaka et al., 1998; Tanaka et al., 2005) (рис. 4а). Вторая гипотеза – биомеханическая – постулирует, что передача сигнала от асимметричного тока жидкости осуществляется за счет восприятия механического воздействия тока (рис. 4б). Согласно этой гипотезе, неподвижные реснички играют роль антенн, непосредственно воспринимая давление тока жидкости в узелке. Механический сигнал от реснички передается через трансмембранный сенсорный белок Polycystin-1 (Pkd1) на кальциевые каналы Polycystin-2 (Pkd2) (Field et al., 2011), открытие которых приводит к кальциевому пику в парахордальных клетках левой стороны эмбриона и дальнейшей активации молекулярного каскада (McGrath et al., 2003). В пользу второй гипотезы говорит то, что белок Pkd2 действительно необходим для запуска каскада реализации асимметрии в парахордальных клетках, так же как наличие неподвижных ресничек и способность клеток создавать волну Са²⁺ в цитоплазме (McGrath et al., 2003; Yoshiba et al., 2012).

Рис. 4.

(а) Иллюстрация гипотезы переноса морфогена. (б) Иллюстрация биомеханической гипотезы. L и R – левая и правая стороны тела, зеленые стрелки – направление тока жидкости, звездочки – частицы морфогена. Адаптировано из Hamada, 2016 согласно условиям Creative Commons Attribution-NonCommercial 2.5 International License (http://creativecommons.org/ licenses/by-nc/2.5/).

Кролик: лево-правый организатор – хордальная пластинка

Лево-правый организатор кролика функционально идентичен организатору мыши и в значительной степени морфологически сходен с ним. Организатор кролика – это тоже эпителиальный участок мезодермы на вентральной стороне эмбриона, свободный от гипобласта и несущий подвижные реснички. Основное различие состоит в том, что гипобласт кролика прорывается не под узелком, а под прилегающей к нему с головного конца хордальной пластинкой. Поэтому именно апексы клеток хордальной пластинки оказываются экспонированными в полость желточного мешка и формируют реснички. Соответственно, биение ресничек и ток жидкости у кролика происходит не в области узелка, а в области хордальной пластинки (Blum et al., 2007) (рис. 5).

Рис. 5.

Схема эмбриона кролика, вид с вентральной стороны. По данным Blum et al., 2007.

Кроме того, узелок мыши прикрыт так называемой мембраной Рейхардта, состоящей из одного слоя клеток (Lee, Anderson, 2008), и под ней формируется небольшое пространство для циркуляции жидкости. Поэтому у мыши обратный ток жидкости, направленный вправо, “прижат” к поверхности ресничных клеток и протекает непосредственно под левонаправленным током. У кролика же жидкость в лево-правом организаторе свободно сообщается с жидкостью желточного мешка, и пространство для циркуляции намного больше. Вследствие этого обратный ток проходит не под левонаправленным током, а несколько каудальнее, вдоль задней границы хордальной пластинки. Возможно, это свидетельствует о том, что угол наклона ресничек в хордальной пластинке кролика меньше, чем в узелке мыши.

Лягушки: лево-правый организатор – участок крыши гастроцеля

Аналогичный мыши и кролику механизм ресничного тока представлен в лево-правом организаторе асимметрии шпорцевой лягушки. У лягушки этим организатором является мезодермальный участок крыши гастроцеля – так называемая gastrocoel roof plate (GRP), то есть буквально пластинка крыши гастроцеля (Schweickert et al., 2007). На стадии нейрулы область GRP представляет собой вытянутую треугольную пластинку на внутренней поверхности крыши гастроцеля, сложенную мезодермальными клетками презумптивной хорды и сомитов. GRP со всех сторон окружена энтодермальным эпителием, от которого отличается меньшим размером клеток (Schweickert et al., 2007) (рис. 6). Важно отметить, что в таком виде GRP существует недолго, и уже к началу стадии хвостовой почки клетки области GRP уходят с внутренней поверхности первичной кишки, энтодерма крыши гастроцеля смыкается, и поверхность гастроцеля оказывается выстланной только энтодермальными клетками (Shook et al., 2004).

Рис. 6.

Морфология лево-правого организатора в крыше гастроцеля шпорцевой лягушки на стадии нейрулы. hy/nGRP – гипохорд и поверхностная презумптивная мезодерма хорды, sGRP – поверхностная презумптивная мезодерма сомитов, LEC – латеральные энтодермальные клетки, End – энтодерма, bp – бластопор. А и Р – передняя и задняя стороны тела эмбриона, L и R – левая и правая стороны. Схема зародыша адаптирована из Nieuwkoop, Faber, 1994, с изменениями.

Как и в случае лево-правого организатора у мыши и кролика, клетки GRP несут по одной подвижной ресничке. Показано, что для успешного формирования и позиционирования ресничек необходима работа генов myosin1d и vangl2, отвечающих за планарную полярность клеток (Tingler et al., 2018). Реснички на клетках GRP вращаются по часовой стрелке с частотой 20–25 биений в секунду, их суммарное вращение создает над областью GRP ток жидкости справа налево. Как и в случае мыши, для шпорцевой лягушки показано, что наличие левонаправленного тока чрезвычайно важно для установления асимметрии тела эмбриона: в условиях экспериментального блокирования тока жидкости эмбрионы развивались с нарушениями асимметрии (Schweickert et al., 2007). Потеря аксонемного динеина (гомологичного таковому у мыши) вызывала также неподвижность ресничек и далее нарушения установления асимметрии. Кроме того, у эмбриона лягушки было показано наличие на клетках GRP ионного канала Polycystin-2 и его необходимость для правильной латерализации зародыша (Schweickert et al., 2007; Tingler et al., 2018).

Костистые рыбы: лево-правый организатор – купферов пузырек

У костистых рыб (D. rerio, O. latipes) лево-правым организатором асимметрии является купферов пузырек (Essner et al., 2005). Это специфичная для костистых рыб структура, формирующаяся в конце гаструляции в заднем отделе тела, вентральнее хорды. Купферов пузырек образован потомками так называемых клеток-лидеров, которые составляют фронт инволюирующей дорзальной бластодермы во время гаструляции. В конце гаструляции эти клетки эпителизуются и образуют большую сферическую структуру. Во время начальных стадий сомитогенеза в центре этой сферы появляется полость, а на обращенных к ней апикальных поверхностях клеток начинают формироваться реснички (Lin et al., 2017). В образовании полости купферова пузырька задействован ген myosin1d, при его мутации полость не формируется нормально, и лево-правая асимметрия нарушается (Saydmohammed et al., 2018). Клетки купферова пузырька несут по одной ресничке, обращенной в полость пузырька и отклоненной назад. Было показано, что эти реснички подвижны и вращаются по часовой стрелке, как и реснички эмбриона мыши, кролика и лягушки. Несмотря на то, что пузырек имеет сферическую форму, в нем удается создать левонаправленный ток за счет того, что 80% ресничек сосредоточены на крыше пузырька (Lee, Anderson, 2008). Левонаправленный ток приводит к асимметричной экспрессии генов сигнального каскада Nodal – например, у японской медаки ген charon, гомологичный cerl2 (репрессору nodal) у мыши, экспрессируется справа и, по-видимому, тоже является репрессором гомолога nodal (Hojo et al., 2007). У D. rerio экспрессия гена spaw, гомологичного гену nodal мыши, также зависит от тока жидкости в купферовом пузырьке: при правильной работе ресничек он экспрессируется на левой стороне тела, и его активация запускает работу остальных компонентов сигнального каскада Nodal (lefty1, lefty2, pitx2) (Long et al., 2003). При блокировании экспрессии spaw нарушается экспрессия этих генов. В активации сигнального каскада Nodal у данио-рерио, как и у мыши, участвуют кальциевые каналы, кодируемые геном pkd2 (Yuan et al., 2015).

Разнообразие способов установления асимметрии среди позвоночных

Несмотря на то, что механизмы установления асимметрии за счет активности ресничных клеток мезодермальных структур эмбриона, создающих ток жидкости, обнаружены у представителей разных классов позвоночных (рис. 7), экстраполировать их на любого представителя позвоночных следует с осторожностью. Среди позвоночных встречаются и иные механизмы установления асимметрии, не связанные с созданием направленного тока жидкости.

Рис. 7.

Строение лево-правых организаторов у отдельных представителей позвоночных животных. Эктодерма показана оранжевым цветом, боковая мезодерма – желтым, энтодерма/гипобласт – голубым, организатор асимметрии – фиолетовый с зелеными ресничками. © 2008 Wiley. Используется с разрешения Lee, Anderson. Morphogenesis of the node and notochord: the cellular basis for the establishment and maintenance of left-right asymmetry in the mouse // Developmental Dynamics, John Wiley & Sons.

У эмбриона курицы, в отличие от мыши, энтодерма, подстилающая первичный узелок и сопутствующие структуры, сплошная и не имеет разрывов. Мезодерма эмбриона курицы оказывается перекрытой сплошным энтодермальным слоем, и никакая ее часть не экспонируется на вентральной стороне эмбриона. Таким образом, мезодерма не может образовывать реснички и запускать ток жидкости, как это наблюдается у мыши (Schröder et al., 2016; Tsikolia et al., 2012).

Основным механизмом установления асимметрии у эмбриона курицы является клеточная перестройка в районе первичного узелка. На стадии гаструляции, во время которой длина первичной полоски максимальна, происходит быстрое (3–4 ч) перемещение клеток, окружающих узелок, на левую сторону, а сам узелок немного изгибается (рис. 8).

Рис. 8.

Схема движения клеток вокруг первичного узелка эмбриона курицы во время гаструляции, четыре стадии процесса, вид с дорсальной стороны. На третьей стадии видно массовое перемещение клеток на левую сторону эмбриона. Из Gros et al. Cell movements at Hensen’s node establish left/right asymmetric gene expression in the chick // Science. 2009. V. 324. № 5929. P. 941–944. Используется с разрешения AAAS.

В результате гены shh (sonic hedgehog) и fgf8 (fibroblast growth factor 8), ранее экспрессировавшиеся одинаково с обеих сторон от узелка, увеличивают интенсивность экспрессии на левой стороне зародыша. Shh запускает экспрессию nodal в мезодерме на левой стороне тела зародыша с помощью гена-посредника caronte (Esteban et al., 1999), что приводит к активации характерного для всех позвоночных сигнального каскада Nodal (Pagán-Westphal, Tabin, 1998). Экспериментально показано, что при нарушении миграции клеток вокруг узелка сам узелок принимает более симметричную форму, а гены shh и fgf8 продолжают экспрессироваться одинаково по обе стороны от узелка (Gros et al., 2009). Причины этих клеточных движений на данный момент неизвестны.

Интересно, что, как и у курицы, у свиньи не найдено ничего похожего на ресничный организатор асимметрии, и запуск каскада Nodal на левой стороне эмбриона свиньи также вызывается миграциями клеток справа налево вокруг первичного узелка (Schröder et al., 2016).

Консервативность роли гена nodal и биения ресничек в установлении асимметрии

Несмотря на вариабельность (возможно, вторичную) механизмов установления асимметрии у позвоночных, механизм, связанный с биением ресничек и током жидкости, имеет, по-видимому, глубокие эволюционные корни. Схожие способы установления лево-правой асимметрии обнаружены у низших хордовых и даже в пределах родственного хордовым типа иглокожих, которые также относятся к группе вторичноротых животных.

Асцидии: роль эктодермальных ресничек в установлении асимметрии

У личинок асцидий C. intestinalis и H. roretzi на стадии нейрулы на левой стороне тела наблюдается экспрессия гена nodal, который к стадии хвостовой почки запускает экспрессию гена pitx (Morokuma et al., 2002). Оба гена гомологичны таковым у позвоночных, хотя и экспрессируются не в мезодерме, а в эктодерме. Более того, стимулом для запуска сигнального каскада Nodal, как и у многих позвоночных, служит работа ресничек. На личинках четырех видов видов асцидий (H. roretzi, C. intestinalis, P. mammillata, C. inflata) показано, что к стадии нейрулы эктодермальные клетки по всей поверхности тела, кроме нервной борозды, отращивают по одной ресничке на клетку. Эти реснички совершают медленные волнообразные движения с частотой 1/7 Герц (Yamada et al., 2018), за счет их работы вся личинка целиком поворачивается внутри вителлиновой оболочки против часовой стрелки (при взгляде сзади) (рис. 9а) и прекращает вращение, когда левая сторона тела оказывается внизу. Дальнейшему повороту физически препятствует выпуклая нервная трубка (рис. 9б).

Рис. 9.

Схема вращения нейрулы асцидии в вителлиновой оболочке, вид сзади. (а) Начало вращения эмбриона. (б) Конец вращения эмбриона, длительный контакт левой стороны тела с вителлиновой оболочкой запускает экспрессию Nodal в эктодерме. Х – хорда, нт – нервная трубка, экт – эктодерма, мез – мезодерма сомитов и боковой пластинки, энт – энтодерма. D и V – спинная и брюшная стороны тела эмбриона, L и R – левая и правая стороны. По данным Nishide et al., 2012.

За счет того, что вителлиновая оболочка вдвое больше самой личинки (560 мкм против 280 мкм), только левая сторона нейрулы непосредственно контактирует с вителлиновой оболочкой. Этот контакт и запускает экспрессию nodal на левой стороне тела личинки и ее дальнейшую асимметризацию: в случае искусственно вызванного (центрифугированием или сжатием) контакта вителлиновой оболочки с правой стороной тела эмбриона экспрессия nodal возникает также и справа (Nishide et al., 2012). Запуск каскада Nodal вызывается белками, локализованными на внутренней поверхности вителлиновой оболочки, а реснички не участвуют в этом процессе (Tanaka et al., 2019).

Морские ежи: лево-правый организатор асимметрии, расположенный в первичной кишке

Лево-правая асимметрия у билатерально-симметричной личинки морского ежа проявляется в формировании зачатка тела взрослого животного: левый целомический мешок прорывается на поверхность тела личинки отверстием-гидропорой, а в дальнейшем образует так называемый рудимент, закладку, из которой разовьется взрослое животное (Duboc et al., 2005). У личинок морских ежей P. lividus и S. pallidus обнаружена асимметричная экспрессия гена nodal, вначале в вентральной эндомезодерме архентерона личинки, а затем и в эктодерме. В отличие от хордовых, у которых nodal экспрессируется слева, у иглокожих nodal маркирует правую сторону тела, не позволяя ей развиваться по левостороннему сценарию и образовывать эктопическую закладку рудимента (Duboc et al., 2005). При этом важно отметить, что исходная область экспрессии nodal находится на вентральной стороне личинки, а не на дорзальной, как у хордовых. Это служит дополнительным аргументом в пользу гомологии дорзальной стороны хордовых и вентральной стороны иглокожих (Blum et al., 2009). Помимо nodal, у морского ежа найден его репрессор lefty, который не позволяет сигналу nodal распространяться на левую сторону тела личинки (Molina et al., 2013), и ген pitx2, который находится под контролем nodal и вовлечен в регуляцию развития асимметрии тела (рис. 10) (Su, 2014).

Рис. 10.

Сигнальный каскад Nodal и асимметричное развитие личинки морского ежа. © 2014 Wiley. Используется с разрешения Su Y.H. Telling left from right: Left-right asymmetric controls in sea urchins // Genesis, John Wiley & Sons.

На роль лево-правого организатора у морских ежей претендует участок архентерона. У личинок морских ежей на стадии гаструлы обнаружены реснички, расположенные на мезэнтодермальных клетках переднего конца архентерона и обращенные в его полость (рис. 11б). Каждая клетка несет на апикальной поверхности по одной ресничке, смещенной к заднему краю клетки (рис. 11г), и эти реснички совершают вращательные движения. В случае удаления ресничек с клеток архентерона нарушается правильная экспрессия nodal (Tisler et al., 2016). Все это позволяет предположить наличие у морского ежа механизма запуска сигнального каскада Nodal при помощи подвижных ресничек и тока жидкости, схожего с таковым механизмом у позвоночных.

Рис. 11.

Лево-правый организатор личинки морского ежа. (а) Срез через бластопор гаструлы. (б) Срез через переднюю область архентерона, стрелками указаны реснички. (в) Схема гаструлы морского ежа. (г) Заднее положение ресничек на апикальных поверхностях клеток передней области архентерона. Адаптировано из Tisler et al., 2016, согласно условиям Creative Commons Attribution 4.0 International License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

СПОСОБЫ УСТАНОВЛЕНИЯ АСИММЕТРИЗАЦИИ У ПЕРВИЧНОРОТЫХ ЖИВОТНЫХ

В группу двустороннесимметричных животных Bilateria, помимо таксона вторичноротых – Deuterostomia, входит обширная и разнообразнейшая группа первичноротых – Protostomia. Среди ее представителей также распространена внешняя и внутренняя асимметрия тела, чрезвычайно интересная для изучения. Protostomia делятся на группы Lophotrochozoa и Ecdysozoa, в каждой из которых представлены свои способы установления лево-правой асимметрии.

Моллюски Gastropoda: спиральное дробление и ген с материнским эффектом

Говоря о лево-правой асимметрии таксона Lophotrochozoa, следует в первую очередь рассмотреть брюхоногих моллюсков. Именно с них началось изучение асимметрии у животных (Boycott, Diver, 1923). Существуют виды с правозакрученной или левозакрученной раковиной, а также виды, у которых закрученность раковины индивидуально изменчива. Помимо спиральной раковины, внутренние органы гастропод тоже асимметричны. Декстральные и синистральные особи являются зеркальным отражением друг друга, хотя зеркальность процессов эмбриогенеза оспаривается некоторыми авторами (Shibazaki et al., 2004). Показано, что хиральность улитки Lymnaea stagnalis обусловлена одним геном с материнским эффектом, причем декстральный аллель является доминантным. Таким образом, если в геноме матери хотя бы один аллель из двух декстральный, ее потомки будут правозакрученными, даже если их собственные аллели этого гена оба синистральны. Если в синистральную яйцеклетку ввести немного цитоплазмы из декстральной, то яйцеклетка сменит хиральность на декстральную, в то время как обратная операция не приведет к изменению хиральности (Coutelis et al., 2014).

На роль искомого фактора хиральности выдвигаются два гена, кодирующие формины – белки, участвующие в построении актинового цитоскелета (Kuroda et al., 2016). В пользу этой гипотезы говорит то, что разрушение микротрубочек на стадии 4 бластомеров не влияет на установление лево-правой оси, а разрушение актиновых микрофиламентов нарушает формирование этой оси (Shibazaki et al., 2004). По последним данным, полученным с помощью технологии CRISPR/Cas9, нокаут гена формина lsdia1 у декстральных улиток приводит к появлению у них строго синистрального потомства, наследующего это изменение. Таким образом, именно lsdia1 является искомым “геном хиральности”. Это ген с материнским эффектом: белковый продукт присутствует в яйцеклетке и определяет будущую хиральность эмбриона уже на стадии зиготы на внутриклеточном уровне (Abe, Kuroda, 2019).

Внешние признаки лево-правой асимметрии у гастропод проявляются при третьем делении дробления, когда митотические веретена четырех бластомеров отклоняются от вертикальной оси. Это приводит к визуальному повороту отделившегося квартета микромеров относительно макромеров – по или против часовой стрелки. Такое дробление называют спиральным, и оно характерно для группы Spiralia. Показано, что путем аккуратного искусственного поворота квартета микромеров можно добиться полного изменения хиральности улитки, причем полученные животные были здоровы и фертильны, однако подобные изменения хиральности не наследуются (Kuroda et al., 2009).

У моллюсков отмечены гомологи генов nodal и pitx, которые у хордовых отвечают за асимметрию. В результате дробления зародыша гомологи nodal и pitx тоже экспрессируются асимметрично: на правой стороне у декстральных особей и на левой – у синистральных (рис. 12). В дальнейшем эти белки обусловливают всю асимметрию взрослого организма, вероятно, через посредничество морфогена Dpp. При введении ингибитора, специфичного к суперсемейству TGF-β (к которому относятся Nodal и Dpp), асимметрия пропадала, и раковины улиток имели конусовидную незакрученную форму (Grande, Patel, 2009).

Рис. 12.

Зеркальное развитие декстрального и синистрального фенотипов у гастропод. © 2014 Wiley. Используется с разрешения Coutelis et al. Diversity and convergence in the mechanisms establishing L/R asymmetry in metazoa // EMBO Reports, John Wiley & Sons.

Характерный для брюхоногих моллюсков торсионный поворот (то есть разворот внутренностного мешка на 180° в ходе онтогенеза), являющийся одним из проявлений морфологической асимметрии, долгое время считался результатом мышечного усилия личинки, однако показано (Kurita, Wada, 2011), что он происходит из-за интенсивной пролиферации потомков клеток, экспрессировавших nodal на более ранних этапах эмбриогенеза. Воздействие на личинку морского блюдечка Nipponacmea fuscoviridis ингибитора к белкам суперсемейства TGF-β приводило к подавлению пролиферации этих клеток, и торсионного поворота не происходило.

NEMATODA: ПОВОРОТЫ БЛАСТОМЕРОВ И НЕКАНОНИЧЕСКИЙ Wnt-ПУТЬ

Среди группы Ecdysozoa излюбленным модельным объектом биологов является нематода Caenorhabditis elegans. Нематоды относятся к организмам с хорошо выраженными клеточными линиями, и в многочисленных исследованиях прослежена судьба каждой клетки C. elegans. Несмотря на это, первичный стимул к нарушению билатеральной симметрии точно не известен. Первое проявление асимметрии приходится на стадию четырех клеток. При подготовке к делению передний и задний дорсальные бластомеры немного поворачиваются направо, и митотическая ось в каждом из них перестает быть перпендикулярной антерио-постериорной оси. В результате после деления этих бластомеров оказывается, что левый бластомер в каждой паре расположен ближе к будущей голове, чем правый (Pohl, 2011). В движениях бластомеров задействована система актиновых микрофиламентов и система микротрубочек: разрушение любой из них прекращает поворот бластомеров и асимметризацию эмбриона нематоды (Naganathan et al., 2014).

В движениях бластомеров участвуют PAR-белки и G-белки, совместное действие которых вызывает направленные смещения кортикального слоя клетки и митотического веретена (Pohl, Bao, 2010). Хиральные повороты кортикального слоя цитоплазмы отмечены у эмбриона C. elegans уже на стадии зиготы (рис. 13а). Показано, что взаимодействия миозина с актином в кортикальном слое вызывают механические напряжения и вращательные смещения актиновой сети по часовой стрелке (кортикальный ток). На стадии четырех бластомеров эти же хиральные вращательные моменты в кортикальном слое приводят к смещению веретена деления (Naganathan et al., 2014) (рис. 13б).

Рис. 13.

Эмбрион нематоды на стадии зиготы (а) и шести клеток (б). А и Р – передняя и задние стороны тела эмбриона, L и R – левая и правая стороны. Стрелками показано направление потока кортикального актинового слоя. Адаптировано из Naganathan et al., 2014, согласно условиям Creative Commons Attribution 4.0 International License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

У Ecdysozoa не найдено гомологов гена nodal. Запуск поворота дорсальных бластомеров осуществляется через неканонический Wnt-путь. Закрепление ранее установленной морфологической лево-правой асимметрии и однозначное определение судьбы клеток происходит начиная со стадии 12 клеток, когда между парными бластомерами возникают различия в работе сигнального пути Notch (Pohl, 2011).

ПРЕДСТАВИТЕЛЬ ARTHROPODA: МИОЗИН И НАТЯЖЕНИЯ МЕМБРАН КЛЕТОК

Во всех рассмотренных выше случаях асимметрия организма устанавливалась в ходе эмбриогенеза раз и навсегда, обусловливая определенный сценарий развития органов. Тем удивительнее случай дрозофилы D. melanogaster (членистоногие, как и нематоды, относятся к группе Ecdysozoa), у которой отдельные органы (кишечник, семенные протоки) приобретают асимметричное строение независимо друг от друга и на разных этапах онтогенеза. Их развитие контролируется одним геном myosin1d (гомологичным гену позвоночных), эффекты которого приводят к “декстральному” фенотипу мух. Интересно, что выключение этого гена в конкретном органе приводит не к рандомизации асимметрии органа, как можно было бы ожидать, а к развитию локального “синистрального” фенотипа (Spéder et al., 2006). Сам ген myosin1d контролируется одним из Hox-генов abd-B, и при выключении этого гена асимметрия вовсе не развивается (Coutelis et al., 2013). Подобные эффекты воздействия на сигнальный каскад позволяют предположить наличие еще не открытого “синистрального” пути, который активируется продуктом гена abd-B и ингибируется параллельным “декстральным” путем через myosin1d, а в его отсутствие направляет орган по синистральному пути развития (рис. 14а).

Рис. 14.

Установление асимметрии у D. melanogaster. (а) Генетический путь определения асимметрии. (б) Взаимодействия белка Myosin1d с актиновым цитоскелетом. © 2014 Wiley. Используется с разрешения Coutelis et al. Diversity and convergence in the mechanisms establishing L/R asymmetry in metazoa // EMBO Reports, John Wiley & Sons.

Продукт гена myosin1d – белок из семейства миозинов, способный перемещать грузы вдоль нити актина за счет энергии АТФ. Для установления асимметрии той или иной структуры в организме дрозофилы этот белок в клетках данной структуры связывается с клеточной мембраной через DE-кадгерин и β-катенин (рис. 14б). Также показана передача сигнала на мембрану через атипичный кадгерин Ds (González-Morales et al., 2015). За счет перемещения миозина вдоль актиновых микрофиламентов возникает асимметричное натяжение мембраны, которое, по-видимому, и определяет дальнейшую латерализацию. Интересно, что в отсутствие миозина натяжения мембраны все равно наблюдаются, что указывает на сходную с миозином природу пока неизвестного “синистрального” фактора (Coutelis et al., 2014).

CNIDARIA: ЭКСПРЕССИЯ КОМПОНЕНТОВ СИГНАЛЬНОГО КАСКАДА NODAL ПРИ ПОЧКОВАНИИ

До сих пор асимметрию в строении тела было принято рассматривать у билатерий. Однако недавно было показано (Watanabe et al., 2014), что предпосылки к лево-правой асимметрии имеются и у сестринской с Bilateria группы – радиальносимметричных Cnidaria. Так, пресноводные полипы рода Hydra временно приобретают черты двусторонней симметрии при почковании. Было показано, что в зачатке почки дочернего полипа экспрессируется ген ndr, имеющий значительное сходство с nodal у билатерий. Более того, этот ген запускает экспрессию гена pitx (рис. 15). Помимо этого, в геноме гидры найдены гены-репрессоры nodal, принадлежащие семействам Cerberus и Dan, и smad2/3, задействованные в передаче сигнала от nodal. Таким образом, уже у гидры присутствует как минимум часть сигнального каскада Nodal.

Рис. 15.

Экспрессия Ndr и Pitx в зачатках боковых почек гидры. По данным Watanabe et al., 2014.