Онтогенез, 2022, T. 53, № 6, стр. 512-530

Описание эксперимента

Эксперимент по влиянию двух световых режимов – 16С:8Т (16 ч свет : 8 ч темнота) и круглосуточного 24С:0Т (24 ч свет : 0 ч темнота), на рост и экспрессию генов, регулирующих миогенез, у двухлеток (1+) атлантического лосося (Salmo salar L.), проводился на Выгском рыбоводном заводе (пос. Сосновец, Беломорский район, Россия, 64°25′ с.ш. и 34°28′ в.д.). Молодь лосося, содержащаяся на Выгском рыбзаводе, была искусственно выведена из икры, полученной от диких производителей, и подрощена до двухлетнего возраста, после чего был поставлен эксперимент. Продолжительность эксперимента составила 3.5 мес. – с 9 июля по 26 октября. Рыба содержалась в бассейнах размером 2 × 2 метра и объемом воды 720 л. Водоснабжение бассейнов было проточным с использованием воды, поступающей с Маткожненского водохранилища (река Нижний Выг) со скоростью потока 60 л мин^–1. В связи с этим исследование проводилось при естественной сезонной динамике температуры воды, которая является оптимальной для роста и развития молоди атлантического лосося. Колебания температуры за период исследования составили: в июле 14.8–19.9°C, августе 18.2–13.8°C, сентябре 13.8–9.8°C, октябре 9.8–2.4°C (рис. 1).

Рис. 1.

Температура воды в период с июля по октябрь.

Для каждой группы рыб было отведено по два бассейна. Одна группа (№ 1) была контрольной – без дополнительного освещения. Рыбы в контрольной группе содержались в бассейнах при естественном освещении, поступающем из окон, в течение июля и первой половины августа, при этом интенсивность освещения у поверхности воды составляла 12 люкс днем и 2 люкс ночью. Со второй половины августа в цехе, где располагались бассейны, было включено освещение с 5-ти вечера до 8-ми ч утра на 1 мес. Лампы располагались по бокам на стенах здания. Интенсивность освещения на поверхности воды в центральной части бассейнов составляла 10 люкс днем и 8 люкс ночью. Затем, начиная с 10 сентября, свет был включен постоянно, при этом интенсивность освещения у поверхности воды была неравномерной, 8 люкс в центральной части бассейнов. Во второй группе (№ 2) соблюдался режим освещения 16С:8Т (16 ч свет, 8 – темнота). Поддержание цикла свет-темнота в течение суток происходило автоматически с помощью розеток-таймеров (Feron TM-50). В третьей группе (№ 3) освещение было круглосуточным 24С:0Т (24 ч). Экспериментальные бассейны (группы 2 и 3) были оборудованы двумя светодиодными светильниками (Aquaelleddy smart LED sunny, 6W, 6500K), расположенными на стенках бассейнов по диагонали друг к другу, и накрыты черной, не пропускающей свет, пленкой. Интенсивность освещения составляла 760 люкс на поверхности воды под светодиодными светильниками и 400 люкс вокруг них, 45 люкс на противоположной стороне от светильников и 70 люкс в центральной части бассейна.

Все остальные условия содержания рыб во всех бассейнах каждой группы были одинаковыми: плотность посадки (≈1245 особей на бассейн), режим кормления и корм, профилактические меры и уход за бассейнами. Рыбу кормили коммерческим кормом Biomar Inicio 917 (Biomar, Дания) в соответствии с рекомендациями рыбоводного завода, которые зависели от колебаний температуры воды. Рыбу кормили с помощью автоматических кормушек в следующем режиме: каждые 20–30 с с 6-ти ч утра до 22 ч вечера в июле и августе, затем каждые 40–45 с с 9-ти ч утра до 18-ти ч вечера в сентябре и октябре.

В начале исследования рыбы в каждом бассейне (в количестве 160 особей/бассейн) были помечены с помощью чипов (Felixcan SL, Испания). Для этого рыбы были усыплены при помощи гвоздичного масла. После измерения массы и длины (по Смитту) тела, рыбе вводили чип с индивидуальным номером. Чипировали особей среднего размера в пределах массы 7–14 г. Средняя масса рыб, отобранных в начале эксперимента (9 июля), в каждом бассейне была одинаковой и составила 10.20 ± 0.13 г (группа 1 – контроль), 10.25 ± 0.15 г (группа 2 – 16С:8Т), 10.16 ± 0.15 г (группа 3 – 24С:0Т). Далее раз в месяц в день отбора проб (8 августа, 5 сентября, 5 октября, 26 октября) проводили замеры 30–40 чипированных рыб из каждой исследуемой группы. В дальнейшем эти данные использовали для расчета прироста массы и темпов роста рыб. Удельный темп роста определяли как УТР (% · день^–1) = [(ln конечный вес – ln начальный вес)/n дней] × 100.

Образцы эпаксиальных (белых) мышц для молекулярно-генетического анализа отбирали у рыб после измерения их массы и длины тела в начале эксперимента (9 июля) и затем каждый месяц (8 августа, 5 сентября, 5 октября, 26 октября). Образцы замораживали в жидком азоте и хранили при –80°C до начала анализа. Размерно-весовые характеристики рыб, взятых на анализ, представлены в виде M ± SE в табл. 1.

Экспрессия исследуемых генов

Тотальная РНК была выделена из образцов эпаксиальных (белых) скелетных мышц рыб с использованием набора “RNA-extract”, аналога TRIzol (Евроген, Россия), в соответствии с протоколом производителя. Затем суммарную РНК обрабатывали ДНКазой (Силекс, Россия). Целостность и качество РНК оценивали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле и спектрофотометрически при коэффициенте поглощения 260/280 нм (NanoPhotometer С40-Touch, Implen, Германия). РНК подвергали обратной транскрипции с использованием MMLV-обратной транскриптазы и случайных гексонуклеотидов (Евроген, Россия). В дальнейшем синтезированную кДНК использовали в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ).

Уровень экспрессии мРНК исследуемых генов определяли методом ПЦР-РВ (Зорина, 2012). Анализ проводили с использованием системы CFX96 Touch system (BioRad, США). Праймеры для гена тяжелой цепи миозина (MyHC), референсного гена (фактора элонгации-1 (Ef-1α)), генов миогенных регуляторных факторов (миогенина (MyoG), паралогов MyoD1 (MyoD1a, MyoD1b, MyoD1c), Myf5), а также паралогов миостатина (MSTN1a и MSTN1b), подбирали с помощью программы Nucleotide BLAST. Праймеры были синтезированы компанией “Евроген” (Россия). Последовательности праймеров приведены в табл. 2. Амплификацию 2 мкл кДНК (разведение 1 : 5) проводили с использованием 5 мкл набора “5× Реакционная смесь для проведения ПЦР-РВ в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I” (Евроген, Россия). Протокол ПЦР был следующим: денатурация ДНК в течение 5 минут при 95°С; повторяющиеся циклы (42): денатурация ДНК в течение 20 с при 95°С, отжиг праймеров в течение 30 с при 60°С и элонгация ДНК в течение 30 с при 72°С. Каждый образец был загружен в трех повторностях на одной планшете. Специфичность реакции ПЦР и присутствие димеров праймеров проверяли по кривым плавления, полученным в соответствии с протоколом диссоциации от 65°C до 97°C. Стандартные кривые, соответствующие пятикратной серии разведений смеси кДНК всех образцов, позволили рассчитать эффективность ПЦР. Относительные уровни экспрессии исследуемых генов определяли методом порогового цикла (Ct) и нормализовали по уровню экспрессии референсного гена фактора элонгации (Ef-1α) с использованием метода 2^–ΔCt (Livak, Schmittgen, 2001). Данные выражали в единицах относительной экспрессии мРНК исследуемого гена.

Полученные данные были обработаны общепринятыми методами вариационной статистики (Ивантер, Коросов, 2010). Данные были проверены на нормальность распределения с использованием критерия Шапиро–Уилкса. Многофакторный дисперсионный анализ МANOVA был применен для оценки степени влияния факторов (дополнительного освещения и даты отбора проб) на уровни экспрессии исследуемых генов. Для сравнения выборок по исследуемым показателям использовали однофакторный дисперсионный анализ ANOVA, различия оценивали по критериям Манна–Уитни и Тьюки. Различия считали достоверными при p < 0.05 (Коросов, Горбач, 2007). Для изучения взаимосвязи между значениями экспрессии генов использовался корреляционный анализ Пирсона. Для изучения взаимосвязи между уровнем экспрессии генов и размерами особей, а также между уровнем экспрессии генов и темпами роста рыб, использовался регрессионный анализ.

Масса и темпы роста рыб

Согласно результатам проведенного исследования прирост по массе двухлеток лосося за июль-октябрь составил 19.7 ± 1.5 г в 1 группе (контроль), 17.6 ± 1.3 г во 2 группе (16С:8Т) и 18.2 ± 1.1 г в 3 группе (24С:0Т). На конец эксперимента достоверных отличий по массе особей между группами, выращенными в разных условиях освещения, установлено не было. Тем не менее, двухлетки лосося из контрольной группы (1), содержащиеся без дополнительного освещения, были больше по массе по сравнению с особями из двух других групп – с режимами освещения 16С:8Т (2) и 24С:0Т (3), в августе и начале сентября (рис. 2, p < 0.05) (частично данные опубликованы Nemova et al., 2020). Установленные различия между группами наблюдались также и по удельным темпам роста (УТР) в августе (рис. 3, p < 0.05). Кроме того, в начале эксперимента масса и темпы роста у рыб во 2 группе с режимом 16С:8Т были ниже в сравнении с таковыми у рыб из группы с круглосуточным освещением (3) (p < 0.05). Можно предположить, что относительно более низкие значения массы и УТР у рыб из групп с дополнительным освещением в начале эксперимента связаны с реакцией на введение новых условий и необходимостью адаптации к ним. Ранее в исследованиях, проведенных на атлантическом лососе, было показано, что экспериментальное изменение условий фотопериода вызывает у рыб в начальный период своего воздействия стрессовую реакцию, в результате которой у них происходит снижение аппетита и темпов роста (Nordgarden et al., 2003; Oppedal et al., 2003). В работе, проведенной на молоди атлантической трески, которую содержали при постоянном освещении или в условиях естественного фотопериода, достоверные отличия по массе между группами были установлены только на 4-ый месяц исследования (Nagasawa et al., 2012), при этом масса у рыб из группы с постоянным освещением была больше на 13.3%. Вероятно, из-за периода адаптации рыб к новым световым условиям требуется более продолжительный период воздействия дополнительного освещения для проявления подобного стимулирующего рост эффекта. Необходимо отметить, что в аналогичном эксперименте, проведенном нами на сеголетках (0+) атлантического лосося, различия по массе рыб между контрольной группой и группой, содержащейся при постоянном освещении, в пользу последней, наблюдались уже в первый месяц исследования и сохранялись вплоть до конца экспериментального периода (Churova et al., 2020). Это указывает на возрастные особенности пластичности роста рыб при их адаптации к новым условиям освещения. При сравнении результатов настоящей работы с данными нашего предыдущего исследования, проведенного на двухлетках лосося, которых содержали при круглосуточном освещении с мая, обращает на себя внимание то, что рыбы на всем протяжении эксперимента были больше по массе в отличие от особей из контрольной группы без дополнительного освещения (Shulgina et al., 2021). Вероятно, дополнительное освещение, включенное на два месяца раньше, нежели в настоящей работе, оказало более благоприятное воздействие на рост рыб, поскольку такое удлинение светового дня имитировало увеличение количества световых часов в весенне-летний период в естественной среде обитания лосося.

Рис. 2.

Средняя масса двухлеток лосося, содержащихся в группах с разным режимом освещения, M ± SE. Обозначения: Контроль (без дополнительного освещения), 16С:8Т (16 ч/сут – свет, 8 ч/сут – темнота), 24С:0Т (круглосуточное освещение 24 /сут). * – различия достоверны по сравнению с контрольной группой (p < 0.05), – различия достоверны по сравнению с группой 2 с режимом освещения 16С:8Т (p < 0.05), a – различия достоверны по сравнению с данными, полученными в предыдущий месяц (p < 0.05), с – различия в группе с постоянным освещением достоверны по сравнению данными, полученными 5 сентября (p < 0.05).

Рис. 3.

Удельные темпы роста (УТР) (% день^–1) двухлеток лосося, содержащихся в группах с разным режимом освещения, M ± SE. Обозначения как на рис. 2.

На протяжении периода исследования средняя масса рыб во всех трех группах достоверно повышалась вплоть до начала осени (5 сентября) (p < 0.05). В осенний период наблюдалось снижение темпов роста у рыб из всех исследуемых групп (p < 0.05). Тем не менее, в начале сентября рыбы из 2 группы по УТР достоверно превышали особей из двух других групп. У особей лосося из контрольной группы установлено наибольшее снижение темпов роста в течение сентября и октября в отличие от рыб из групп с дополнительным освещением, которые в этот период продолжали расти и достигли той же массы, что и рыбы из первой группы. При этом на конец эксперимента (спустя 3.5 мес.) средняя масса у особей в группе с постоянным освещением (3) была достоверно больше по сравнению с данными на начало сентября (p < 0.05). Полученные результаты можно объяснить с точки зрения влияния на рыб двух факторов. Замедление темпов роста двухлеток лосося в осенний период, вероятно, является результатом снижения аппетита у рыб, вызванного сезонным снижением температуры воды. В то же время различия по темпам роста между группами, а также наибольший прирост массы тела у особей из опытных групп (2 и 3) могут быть связаны с воздействием на рыб дополнительного освещения. Необходимо отметить, что подобные межгрупповые различия относительно прироста массы тела рыб к концу экспериментального периода на фоне замедления их темпов роста в осенний период были получены нами и в других исследованиях, проведенных на сеголетках и двухлетках атлантического лосося (Churova et al., 2020; Shulgina et al., 2021). Как было показано ранее, искусственное увеличение продолжительности периода освещения позволяет продлить период активного питания рыб, а также влияет на нейроэндокринную систему, что стимулирует пищевое поведение и способствует расходованию поступающих ресурсов преимущественно на процессы роста (Handeland et al., 2003; Nordgarden et al., 2003). Экспериментальные исследования, проведенные на лососевых видах рыб, подтверждают стимулирующее рост воздействие как удлиненного фотопериода, так и постоянного режима освещения (Johnston et al., 2003; Noori et al., 2015).

Таким образом, в нашем исследовании дополнительное освещение в группах 2 и 3 повлияло на продолжительность роста рыб в осенний период при снижении температуры воды. Необходимо отметить, что искусственное освещение экспериментальных бассейнов не повлияло на смертность двухлеток лосося за исследуемый период (погибших рыб выявлено не было, также как и в контрольной группе).

Экспрессия генов

Межгрупповые отличия в уровнях экспрессии исследуемых генов. Согласно полученным данным уровни экспрессии всех исследуемых генов в мышцах молоди атлантического лосося имели сезонную динамику и изменялись на протяжении всего эксперимента. Наряду с этим уровни экспрессии генов тяжелой цепи миозина (MyHC), MyoG и MyoD1b менялись в зависимости от используемого режима освещения.

Достоверные различия в уровнях экспрессии генов, регулирующих мышечный рост, между группами рыб, содержащимися в разных условиях освещения, были выявлены уже в первый месяц исследования (август). Так, у двухлеток лосося из группы с постоянным освещением (3) были выявлены достоверно более высокие уровни экспрессии гена MyoG по сравнению с таковыми у рыб в группе с режимом освещения 16С:8Т (2) (рис. 4, p < 0.05), а также генов MyoD1b (рис. 5, p < 0.05) и MyoD1a (рис. 6, p < 0.05) по сравнению с таковыми у особей из контрольной группы (1). Высокие уровни экспрессии этих генов у молоди рыб могут быть связаны с интенсивно идущими процессами гиперплазии и гипертрофии мышечных волокон. Так, ранее было показано (Johansen, Overturf, 2005), что уровень экспрессии генов, регулирующих миогенез (MyoD, Myf5, MyoG и Mrf4), коррелирует с механизмами роста мышц во время развития радужной форели. При этом, на ранних стадиях мышечного роста увеличение уровней экспрессии MyoD и Myf5 в недифференцированных миогенных клетках-предшественниках (МКП) напрямую связано с их интенсивной пролиферацией и последующей клеточной гиперплазией (образованием миотуб и их дифференцировкой в новые мышечные волокна). MyoG и Mrf4 экспрессируются позже и связаны с терминальной дифференцировкой и слиянием миобластов с существующими миофибриллами в процессе гипертрофии мышечных волокон (увеличения числа ядер, способствующих синтезу дополнительных миофибрилл) (Johansen, Overturf, 2005). Экспрессия MyoG индуцирует выход МКП из клеточного цикла, удлинение миофибрилл, сборку саркомеров и образование функциональной сократительной мускулатуры, а отсутствие экспрессии гена этого МРФ, напротив, предотвращает слияние миоцитов и приводит к образованию одноядерных мышечных волокон, как было показано на эмбрионах и личинках данио рерио (Danio rerio) (Ganassi et al., 2018), а также в исследованиях на клеточных культурах миобластов, полученных из мышц радужной форели (Oncorhynchus mykiss) (Rescan et al., 1995), атлантического лосося (Salmo salar) (Bower and Johnston, 2010) и дорады (Sparus aurata) (Codina et al., 2014). Межгрупповые различия в уровнях экспрессии МРФ, выявленные в нашей работе, согласуются с результатами исследования, в котором воздействие непрерывного освещения, в отличие от естественного режима фотопериода, способствовало увеличению экспрессии генов МРФ – pax7, Myf5 и MyoG в мышцах молоди атлантической трески, сопровождающемуся усилением роста рыб (Nagasawa et al., 2012).

Рис. 4.

Относительная экспрессия гена MyoG (ед.) в белых мышцах двухлеток лосося, содержащихся в группах с разным режимом освещения, M ± SE. Обозначения: Контроль (без дополнительного освещения), 16С:8Т (16 ч/сут – свет, 8 ч/сут – темнота), 24С:0Т (круглосуточное освещение 24 ч/сут). * – различия достоверны по сравнению с контрольной группой (p < 0.05), – различия достоверны по сравнению с группой 2 с режимом освещения 16С:8Т (p < 0.05), a – различия достоверны по сравнению с данными, полученными в предыдущий месяц (p < 0.05), b – различия достоверны по сравнению с данными, полученными 9 июля (p < 0.05), c – различия достоверны по сравнению с данными, полученными 8 августа (p <  0.05), d – различия достоверны по сравнению с данными, полученными 5 сентября (p < 0.05).

Рис. 5.

Относительная экспрессия гена MyoD1b (ед.) в белых мышцах двухлеток лосося, содержащихся в группах с разным режимом освещения, M ± SE. Обозначения как на рис. 4.

Рис. 6.

Относительная экспрессия гена MyoD1a (ед.) в белых мышцах двухлеток лосося, содержащихся в группах с разным режимом освещения, M ± SE. Обозначения как на рис. 4.

Установлены достоверные отличия по уровню экспрессии гена MyoG между группами 1 (контроль) и 2 (с режимом 16С:8Т) в пользу контрольной в августе (рис. 4, p < 0.05). Как было показано ранее на эмбрионах и взрослых особях камбалы, сравнительно высокий уровень MyoG может свидетельствовать о том, что большинство мышечных клеток находится на стадии дифференцировки, а не пролиферации (Zhang et al., 2010). Поскольку уровень экспрессии мРНК MyoG положительно коррелировал с массой рыб во всех исследуемых группах (в период с июля по октябрь) (табл. 4, p < 0.05), можно предположить, что наиболее низкие значения экспрессии этого гена у особей лосося, выращенных в условиях режима 16С:8Т, отражают более выраженное снижение прироста мышечной массы у этой группы рыб по сравнению с другими в начале эксперимента.

Таким образом, выявленные межгрупповые отличия в экспрессии исследуемых генов в мышцах особей лосося в начале эксперимента указывают на различия в механизмах мышечного роста у рыб в зависимости от режима освещения. Необходимо отметить, что в опубликованных нами ранее исследованиях, проведенных на сеголетках и двухлетках атлантического лосося, также была показана зависимость уровней экспрессии генов MyoG и MyoD1b от используемого режима освещения (Churova et al., 2020; Shulgina et al., 2021).

На протяжении эксперимента у двухлеток лосося, содержащихся при постоянном освещении (группа 3), наблюдались достоверно более высокие уровни экспрессии гена MyoG (в период с начала сентября и вплоть до конца эксперимента) (рис. 4, p < 0.05), а также гена MyoD1b (в начале сентября и октября) по сравнению с таковыми у рыб из контрольной группы (рис. 5, p < 0.05). Подобные различия по уровню экспрессии гена MyoG между группами с естественным режимом фотопериода и с постоянным освещением в пользу последней наблюдались на протяжении всего эксперимента (до 120 дней), проведенного на молоди атлантической трески, и сопровождались повышением темпов роста рыб (Nagasawa et al., 2012).

Уровни экспрессии мРНК паралогов MyoD1 – MyoD1a, MyoD1b и MyoD1c были выше у особей лосося в группе с режимом освещения 16С:8Т (2) по сравнению с таковыми у рыб из контрольной группы в начале октября (рис. 5, 6, 7, p < 0.05). В исследовании на молоди паку (Piaractus mesopotamicus) было показано, что относительно более высокие уровни экспрессии гена MyoD могут быть связаны с преобладающим гиперпластическим механизмом роста мышц (Almeida et al., 2008). У лососевых в результате двухэтапной дупликации генома образовалось три функциональных паралога гена MyoD1, которые отличаются друг от друга характером экспрессии в процессе развития рыб. Было высказано предположение, что MyoD1c возник в результате дупликации MyoD1b и эти гены в своей структуре имеют сходные регуляторные элементы (Macqueen, Johnston, 2006). На культурах клеток, выделенных из белых скелетных мышц атлантического лосося, было показано, что паралоги MyoD различаются на уровне регуляции транскрипции во время пролиферации и дифференцировки МКП. Так, экспрессируясь последовательно, гены MyoD1c и MyoD1b регулируют клеточный цикл миобластов, тогда как экспрессия MyoD1a сильно коррелирует с MyoG во время формирования миотуб, что говорит о том, что этот паралог участвует в терминальной дифференцировке мышечных клеток (Bower, Johnston, 2010).

Рис. 7.

Относительная экспрессия гена MyoD1c (ед.) в белых мышцах двухлеток лосося, содержащихся в группах с разным режимом освещения, M ± SE. Обозначения как на рис. 4.

Таким образом, установленные в нашей работе различия в уровнях экспрессии исследуемых МРФ в мышцах рыб из экспериментальных и контрольных бассейнов могут указывать на разное состояние мышечных клеток, формирующих новые волокна. Вероятно, относительно более высокие уровни экспрессии генов MyoD1b и MyoG у рыб из группы 3, а также паралогов MyoD1 в мышцах рыб из группы 2, свидетельствуют об интенсификации процессов пролиферации и дифференцировки мышечных клеток, что способствует росту мышц как посредством гиперпластического, так и гипертрофического механизмов.

Уровень экспрессии гена тяжелой цепи миозина (MyHC) был выше (p < 0.05) в мышцах рыб из экспериментальных групп с дополнительным освещением (16С:8Т и 24С) по сравнению с таковыми у особей из контрольной группы в начале октября (рис. 8, p < 0.05). Вероятно, эти различия вызваны более высокими уровнями экспрессии генов МРФ на протяжении эксперимента у двухлеток лосося в группах с дополнительным освещением по сравнению с таковыми у рыб из контрольной группы. Как было показано ранее, последовательная экспрессия миогенных регуляторных факторов приводит к экспрессии генов структурных мышечных белков, включая ген тяжелой цепи миозина (MyHC) (Ahammad et al., 2019). Повышенный уровень транскриптов генов MyoG и Mrf4 на этапе дифференцировки миобластов в присутствии миотуб коррелировал с высокой экспрессией генов тяжелой цепи миозина и десмина в исследовании на культуре клеток мышц дорады Sparus aurata (Codina et al., 2014). Тяжелая цепь миозина является наиболее важным функциональным и структурным доменом молекулы миозина – основного мышечного белка, и, как следствие, ключевым определяющим фактором развития скелетных мышц (Ikeda et al., 2007). В другой работе было показано, что, когда скорость синтеза белка превышает скорость его деградации, это приводит к увеличению размеров мышечных волокон и, как следствие, к гипертрофическому росту мышц (Fuentes et al., 2013). Кроме того, уровень экспрессии гена тяжелой цепи миозина (MyHC) является показателем, отражающем темпы прироста мышечной массы у рыб (Hevroy et al., 2006; Чурова и др., 2015). В нашем исследовании, проведенном на сеголетках лосося, были установлены аналогичные различия в уровне экспрессии MyHC у особей из контрольной группы и группы с постоянным освещением, которые отражали различия по массе рыб (Churova et al., 2020). Кроме того, в предыдущей работе на двухлетках лосося нами была показана положительная взаимосвязь массы рыб с уровнем экспрессии гена тяжелой цепи миозина, который изменялся в зависимости от используемого режима освещения (Shulgina et al., 2021). Учитывая вышесказанное, полученные в настоящей работе результаты по уровню экспрессии гена MyHC могут указывать на то, что дополнительное освещение оказывает положительный эффект на прирост мышечной массы у двухлеток лосося и способствует более продолжительному росту в осенний период при снижении температуры воды, что согласуется с данными по массе рыб в этот период. Отсроченное увеличение массы тела, наблюдаемое у рыб из групп 2 и 3 в начале эксперимента, вероятно, отражает время, необходимое для гипертрофии мышечных волокон, образующихся после адаптации рыб к стрессовому воздействию дополнительного освещения. Подобная задержка ростостимулирующих эффектов непрерывного освещения была отмечена ранее у смолтов атлантического лосося (Johnston et al., 2003). Тем не менее, авторы этого исследования выявили, что непрерывное освещение, в отличие от короткого светового дня, способствует увеличению числа делений МКП и/или уменьшению времени их клеточного цикла, что стимулирует их пролиферацию и впоследствии приводит к увеличению количества мышечных волокон лосося.

Рис. 8.

Относительная экспрессия гена MyHC (ед.) в белых мышцах двухлеток лосося, содержащихся в группах с разным режимом освещения, M ± SE. Обозначения как на рис. 4.

Наряду с установленными межгрупповыми различиями по уровню экспрессии гена MyHC в начале октября были выявлены относительно более высокие уровни экспрессии мРНК MSTN1b в группах 2 и 3 по сравнению с контрольной группой (рис. 9, p < 0.05), что, вероятно, связано с регуляцией роста мышц у рыб из экспериментальных групп в ответ на стимулирующее действие дополнительного освещения. Исследования in vitro показали, что миостатин подавляет развитие и рост скелетных мышц путем ингибирования пролиферации и дифференцировки миобластов и сателлитных клеток (Thomas et al., 2000). Частично это достигается за счет подавления экспрессии генов миогенных регуляторных факторов. Так, было показано, что специфические последовательности в промоторе гена MSTN1b связывают гомо- и гетеродимеры регуляторного фактора MyoD, необходимого для инициации программы миогенеза (Østbye et al., 2007). В другом исследовании, проведенном на молоди учанского леща (Megalobrama amblycephala), экспрессия MSTNa и MSTNb возросла в ответ на усиление дифференцировки и гипертрофии мышечных волокон, что, по мнению авторов, вероятно, связано с подавлением действия миогенина (Zhu et al., 2014). Таким образом, в нашей работе повышенная экспрессия MSTN1b у рыб в группах с дополнительным освещением по сравнению с таковой у особей в контрольной группе, вероятно, связана с механизмами контроля мышечного роста, направленными на ослабление процессов их гиперплазии и гипертрофии. Это предположение согласуется с аналогичными результатами, полученными нами ранее для двухлеток лосося в другом эксперименте, где рыбы содержались при круглосуточном освещении более продолжительное время (Shulgina et al., 2021).

Рис. 9.

Относительная экспрессия гена MSTN1b (ед.) в белых мышцах двухлеток лосося, содержащихся в группах с разным режимом освещения, M ± SE. Обозначения как на рис. 4.

Динамика уровней экспрессии исследуемых генов. Согласно результатам, полученным в нашей работе, динамика экспрессии исследуемых генов у лосося имела сезонный характер. Так, на протяжении эксперимента уровни экспрессии генов MyoD1b, MyoD1c, MyoG, MSTN1a и MSTN1b возрастали у рыб из всех исследуемых групп и осенью были достоверно выше по сравнению с летним периодом (рис. 4, 5, 7, 9, 10, p < 0.05). При этом за период с 9 июля по 5 сентября была выявлена положительная корреляция между массой рыб и уровнями экспрессии генов MyoD1b, MyoD1c в контрольной группе, генов MyoD1c, MyoG, MSTN1a и MSTN1b в группе 2 (16С:8Т), всех вышеуказанных генов в группе 3 (24С) (табл. 3, p < 0.05). За период с 9 июля по 5 октября положительная корреляция с массой была показана для уровней экспрессии генов MyoD1c и MyoG у рыб в контрольной группе, для уровней экспрессии генов MyoG, MSTN1a и MSTN1b у рыб из группы 2, и для уровней экспрессии MyoD1c, MyoG, MSTN1a и MSTN1b у рыб из группы 3 (табл. 4, p < 0.05). Уровень экспрессии мРНК Myf5 постепенно повышался у рыб в группах с дополнительным освещением и положительно коррелировал с их массой в период с 9 июля по 5 сентября (рис. 11, табл. 3, p < 0.05). Вероятно, такое повышение уровней экспрессии генов МРФ, а также паралогов миостатина, связано с усилением процессов гиперплазии и гипертрофии мышечных волокон и отражает прирост мышечной массы у молоди рыб в период их активного роста. Как известно, темпы роста и развития многих видов рыб, обитающих в умеренных широтах северных регионов, в том числе лососевых, подвержены воздействию сезонных колебаний температуры и фотопериода, в связи с чем в весенне-летний период наблюдается более быстрый рост, в отличие от осенне-зимнего (Danzmann et al., 2016). В нашем эксперименте температурный режим был естественным, и температура воды в бассейнах в период с начала июля и до начала сентября была значительно выше, нежели в осенний период. Ранее было показано, что повышение температуры воды способствует увеличению диаметра мышечных волокон, скорости пролиферации и интенсивности гиперплазии у молоди паку (Piaractus mesopotamicus) (de Paula et al., 2014). Более того, в исследованиях на других видах рыб была выявлена зависимость количества мРНК нескольких МРФ от температуры среды (Fernandes et al., 2006; Johnston et al., 2009). Так, у эмбрионов рыбы фугу (Takifugu rubripes), инкубированных при более высоких температурах, наблюдалось увеличение уровня экспрессии гена MyoG (Fernandes et al., 2006).

Рис. 10.

Относительная экспрессия гена MSTN1a (ед.) в белых мышцах двухлеток лосося, содержащихся в группах с разным режимом освещения, M ± SE. Обозначения как на рис. 4.

Рис. 11.

Относительная экспрессия гена Myf5 (ед.) в белых мышцах двухлеток лосося, содержащихся в группах с разным режимом освещения, M ± SE. Обозначения как на рис. 4.

Напротив, при снижении температуры воды в период с начала сентября и вплоть до конца эксперимента у рыб во всех группах было зафиксировано снижение уровней экспрессии исследуемых генов. Так, в конце октября наблюдались достоверно более низкие значения экспрессии мРНК MyHC в группах 1 и 3 (рис. 8, p < 0.05), MyoG – в группе 3 (рис. 4, p < 0.05), MSTN1a – в группах 2 и 3 (рис. 10, p < 0.05), Myf5, MyoD1b и MyoD1c – у рыб во всех исследуемых группах (рис. 5, 7, 11, p < 0.05). При этом у особей лосося во всех группах уровни экспрессии мРНК MSTN1b в конце октября достоверно превышали таковые в начале эксперимента (рис. 9, p < 0.05). В аналогичном эксперименте, проведенном нами на сеголетках (0+) атлантического лосося, было показано подобное одновременное снижение к концу исследования уровней экспрессии генов Myf5, MyoD1b и MyoD1c и повышение экспрессии MSTN1a и MSTN1b во всех группах независимо от условий освещения (Churova et al., 2020). Кроме того, наблюдаемая динамика экспрессии генов Myf5, MyoD1b и MyoD1c соответствует таковой, установленной нами для двухлеток лосося, которые содержались в группах с постоянным освещением и без дополнительного освещения в более продолжительном эксперименте (Shulgina et al., 2021). Полученные результаты согласуются с данными исследования, в котором в мышцах морского леща спустя 30 дней голодания наблюдалась сниженная экспрессия генов Myf5 и MyoD2 и повышенная экспрессия MSTN1, что, по мнению авторов, указывает на снижение активации миобластов и мышечного роста (Codina et al., 2014). В другой работе, было показано, что продолжительное воздействие низкой температуры воды способствует повышению концентрации мРНК MSTN в мышцах канального сома (Weber, Bosworth, 2005). Необходимо отметить, что в нашей работе динамика уровней экспрессии паралогов миостатина (MSTN1a и MSTN1b) была неодинаковой, что может указывать на различия в их функционировании в процессе миогенеза, однако их дифференциальную роль в регуляции этого процесса еще предстоит выяснить. Вероятно, наблюдаемые изменения уровней экспрессии исследуемых генов в конце эксперимента связаны с замедлением процессов гиперплазии и гипертрофии мышечных волокон у особей лосося при снижении их темпов роста в осенний период. Как было показано ранее в исследованиях на постсмолтах атлантического лосося, гиперплазия мышечных волокон заметно снижается по мере уменьшения температуры воды и продолжительности освещения в зимний период (Johnston et al., 2003). Было высказано предположение, что у рыб существует сезонный цикл формирования мышечных волокон, который накладывается на эндогенный ритм роста, зависящий от возраста и стадии жизненного цикла.