Высокомолекулярные соединения (серия Б), 2022, T. 64, № 5, стр. 383-390

ВВЕДЕНИЕ

В последнее десятилетие динамическую ковалентную химию широко применяют для получения стимулчувствительных и самозалечивающихся гидрогелей биомедицинского назначения [1–5]. Один из возможных вариантов реализации этого подхода заключается в сшивке хитозана и его производных ароматическими альдегидами [6–9], причем за счет гидрофобного упорядочения ароматических фрагментов в основаниях Шиффа гелеобразование наблюдается и в результате взаимодействия с моноальдегидами, когда межмолекулярные ковалентные сшивки не образуются [6, 7]. В отличие от гидрогелей хитозана, полученных сшивкой глутаровым альдегидом и другими алифатическими диальдегидами, динамическая природа иминной связи с ароматическими альдегидами определяет рН-чувствительность таких систем: в кислой и щелочной среде равновесие смещается в сторону исходных веществ (полиамина и альдегида), вследствие чего надмолекулярная структура гидрогелей или пленок, стабилизированная гидрофобными взаимодействиями, разрушается. Поскольку многие ароматические альдегиды обладают высокой биологической активностью, их высвобождение из пленок и гидрогелей хитозана обеспечивает фунгицидные [7, 10] и антимикробные [6] свойства материалов. В случае производных хитозана, растворимых в нейтральной и щелочной среде, рН-чувствительные гидрогели могут быть использованы как средство доставки инкапсулированных лекарственных средств при физиологических значениях рН [8].

Интерес к применению ванилина (4-гидрокси-3-метоксибензальдегида) для получения гидрогелей хитозана связан с доступностью ванилина, низкой токсичностью [11] и широким спектром биологической активности, в том числе нейропротекторной, противоопухолевой, антиоксидантной и антимикробной [12]. Однако в отличие от салицилового альдегида гидроксигруппа в ванилине находится в пара-положении относительно альдегидной группы и не обеспечивает формирование “иминного замка” [13] – водородной связи между орто-гидроксильной группой альдегида и аминогруппой полимера, значительно улучшающего устойчивость иминной связи в салицилимине хитозана. Ниже показаны возможные структурные фрагменты при сшивке N-(2-карбоксиэтил)хитозана (КЭХ) ванилином и салициловым альдегидом (схема 1).

При взаимодействии хитозана с ванилином в растворе образуются очень слабые гидрогели, механические свойства которых повышают путем введения неорганических частиц [14] или использования дополнительных сшивающих агентов, например триполифосфата натрия [15]. В пленках хитозана [16, 17], полученных испарением растворителя (воды), степень конверсии ванилина при образовании основания Шиффа увеличивается до 80% по сравнению с конверсией 7–12% в растворе [16]. В результате эффективность гидрофобных взаимодействий повышается, а скорость растворения полученных пленок в слабокислой среде заметно понижается.

Поскольку при взаимодействии с салициловым альдегидом карбоксиалкилхитозаны формировали гидрогели при значительно более низких мольных отношениях альдегид : полимер, чем хитозан [18], но проявляли достаточно высокую цитотоксичность даже при низких содержаниях салицилового альдегида, в настоящей работе рассмотрена возможность применения менее токсичного ванилина для формирования стимулчувствительных гидрогелей биомедицинского назначения.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовали низкомолекулярный хитозан с молекулярной массой 30 × 10³ и степенью дезацетилирования 0.9 (“BioLogHeppe GmbH”, Германия); N-(2-карбоксиэтил)хитозан (КЭХ) со степенью карбоксиэтилирования 0.38, синтезированный из низкомолекулярного хитозана по методике [19]; мочевину (99%,“ Sigma-Aldrich”, США) и ванилин (99%, “Sigma-Aldrich”).

3%-ный раствор хитозана готовили растворением сухого полимера в 1%-ном растворе уксусной кислоты, рН доводили до 4.9 ед. добавлением 0.1 М раствора NaOH. 3%-ный раствор КЭХ приготавливали растворением натриевой формы полимера в водном растворе, рН доводили до 8.3 ед. добавлением 0.1 М раствора HCl.

Гидрогели хитозана и КЭХ получали смешиванием растворов ванилина в ДМСО и полимеров при мольном отношении ванилин : хитозан, равном 1 : 1, 1 : 2.5, 1 : 5, 1 : 10. Во всех случаях объемное отношение ДМСО : вода в гидрогеле составляло 1 : 10.

Реологические исследования гидрогелей проводили при температуре 25 ± 0.05°C в осцилляционном (динамическом) режиме в диапазоне частот колебаний 0.2–100 Гц c использованием реометра “Physica MCR 301” (“Anton Paar GmbH”, Австрия) с измерительным модулем плоскость–плоскость диаметром 25 мм.

Растворимость гидрогелей КЭХ в зависимости от рН исследовали при 25°C в фосфатных буферах (“PanEco Ltd.”, Россия), определяя количество полимера, перешедшего из гидрогеля в раствор, методом коллоидного титрования [18]. Для этого около 300 мг гидрогеля КЭХ помещали в 3 мл буфера через 72 ч после добавления ванилина и осторожно перемешивали при 25°C в течение 24 ч на орбитальном шейкере“ PSU-20i” (“Biosan”, Латвия) со скоростью 30 об/мин, после чего отбирали аликвоту раствора над гелем объемом 0.2 мл и титровали при рН 10.5 стандартным раствором полидиаллилдиметиламмоний хлорида с содержанием катионных групп 0.001 моль/л. Для сравнения в аналогичных условиях титровали раствор после полного растворения гидрогеля при рН 11. Коллоидное титрование проводили до точки нулевого заряда в автоматической компьютеризированной установке, включающей титратор “Mütek PCD-T3” и детектор заряда частиц “Mütek PCD-04” (“BTG Instruments GmbH”, Германия). Растворимость Р гидрогелей рассчитывали по формуле

где СТ_pH и СТ₀ – объемы титранта, ушедшие на титрование аликвоты раствора над гидрогелем после растворения при выбранном значении рН и раствора после полного растворения гидрогеля при рН 11 соответственно; m_pH и m₀ – массы гидрогелей, растворяемых при выбранном значении рН и рН 11 соответственно.

Кинетику растворения гидрогелей КЭХ, полученных при мольном отношении ванилин : полимер = 1 : 2.5, исследовали при 37°C в фосфатном буфере с рН 8 и в питательной среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM, кат. номер #12800017, Gibco™, “Thermo Fisher Scientific”, Великобритания), используемой для культивирования клеток, с добавлением 10 об. % (эмбриональной телячьей сыворотки (“HyClone”, США). Изменение массы гидрогеля оценивали гравиметрически. Ввиду того, что растворение и набухание гидрогелей с динамической ковалентной связью происходит одновременно, положительные значения соответствовали преобладанию процесса набухания над растворением.

Для определения степени модификации (ИК-фурье и ЯМР ¹³С спектров) гидрогели КЭХ тщательно промывали этанолом и сушили на воздухе через 72 ч после добавления ванилина. Содержание C, N, H в воздушно-сухих образцах находили методом высокотемпературного сжигания на элементном анализаторе “EuroEA3000” (“Eurovector”, Италия). Для КЭХ с естественной влажностью 19% средние значения составили: С – 36.48%, N – 5.78%, Н – 7.42%, атомное отношение С : N равно 7.37.

Степень модификации α рассчитывали по формуле

где C/N_КЭХ-В и C/N_КЭХ – атомные отношения углерод/азот в модифицированном ванилином и исходном полимере соответственно, n – число атомов углерода в ванилине (n = 8).

Спектры ЯМР ¹³С записывали на спектрометре “Bruker Avance AV-300” (ФРГ) с частотой протонного резонанса 300 МГц. Для регистрации спектров использовали методику кросс-поляризации с вращением образца под магическим углом (CP-MAS). Частота вращения образца составляла 7 кГц. Внешним стандартом химического сдвига служил тетраметилсилан, ошибка измерения сдвига составляла 0.3 м.д.

Инфракрасные спектры с преобразованием Фурье регистрировали на ИК-спектрометре “Affinity-1” с приставкой “MIRacle 10 FTIR” (“Shimadzu”, Япония).

Для анализа цитотоксичности раствор ванилина в ДМСО добавляли в концентрациях, соответствующих мольным отношениям ванилин : : хитозан, равным 1 : 2.5 (11.2 мг/мл), 1 : 5 (5.6 мг/мл) и 1 : 10 (2.8 мг/мл) к клеткам HCT 116 (“Sigma-Aldrich” США), культивируемым в 24-луночных планшетах (TPP, Швейцария) при плотности 100 × 10³ клеток/лун в 1 мл питательной среды DMEM с добавлением 10% (об/об) эмбриональной телячьей сыворотки, 3.7 мг/мл бикарбоната натрия (“Sigma-Aldrich”), однократной смеси заменимых аминокислот, 100 ед.ак./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (все “Gibco”). Для анализа цитотоксичности гидрогелей к 330 мкл гидрогеля добавляли 1170 мкл суспензии клеток (20 × 10³ клеток) в питательной среде DMEM.

Через 24 ч культивирования при +37°C, 5% CO₂ и относительной влажности 90% в присутствии ванилина и через 1, 2 и 3 суток в присутствии гидрогелей жизнеспособность и функциональную активность клеток анализировали с помощью окрашивания флуоресцентными красителями с последующей проточной цитометрией, как описано ранее [9].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее мы показали, что важным преимуществом использования карбоксиалкилхитозанов для получения стимул-чувствительных гидрогелей в присутствии салицилового альдегида является возможность гелеобразования при физиологическом значении рН и при более низких мольных отношениях альдегид : полимер, чем в растворах хитозана [18]. Это в первую очередь связано с низкой стабильностью Шиффовых оснований при рН < 5 и соответственно быстрым разупорядочением гидрофобных ассоциатов, обеспечивающих формирование трехмерной гелевой сетки в слабо кислых растворах хитозана в отличие от слабо щелочных растворов карбоксиалкилхитозанов. В случае салицилимина хитозана стабильные гидрогели хитозана с ванилином (модуль накоплений более 80 кПа) удалось получить только в растворах с высокой концентрацией высокомолекулярного хитозана [20].

В соответствии с литературными данными в наших экспериментах не наблюдали начала гелеобразования в 3%-ном растворе низкомолекулярного хитозана при мольных отношениях ванилин : полимер от 1 : 10 до 1 : 1 в течение 7 суток. Однако введение ванилина в раствор низкомолекулярного КЭХ в эквимолярном отношении приводило к мгновенному образованию геля и его быстрому синерезису. Время гелеобразования увеличивалось с 2 мин до 3 суток при отношении ванилин : КЭХ = 1 : 2.5 и 1 : 10 соответственно. Гелеобразование проходило равномерно во всем объеме с образованием прозрачных гидрогелей, хотя и более слабых по сравнению с гидрогелями салицилимина КЭХ, описанными нами ранее [18] (рис. 1).

Согласно данным элементного анализа (табл. 1) степень модификации КЭХ при отношении ванилин : полимер = 1 : 1 близка к значению 0.19, ранее установленному для салицилимина КЭХ [18], в растворе которого не наблюдали мгновенного формирования гидрогеля и его синерезиса. Ранее авторы работы [11] предположили, что при взаимодействии ванилина и хитозана помимо иминной и водородной связей между гидроксильными группами ванилина и хитозана может образовываться дополнительная ковалентная ацетальная/полуацетальная связь, примеры такой сшивки имеются в литературе и для других полисахаридов [22, 23]. Однако в спектре ЯМР ¹³C гидрогеля КЭХ с ванилином новые сигналы, которые можно было бы отнести к образованию ацеталей и полуацеталей (хим. сдвиг в области 94–108 м.д. [23]), отсутствовали (рис. 2). Относительно исходного полимера идентифицировали только сигналы, относящиеся к атомам углерода в ванилине и углероду при иминной связи.

Наиболее вероятно, что в гидрогелях КЭХ с ванилином значительную роль играют не дополнительные ковалентные связи, а межмолекулярные водородные связи между свободными и связанными с полимером молекулами ванилина, что способствует образованию гидрофобных доменов, и соответственно вытеснению воды из полимерной сетки (схема 1). Косвенно это подтверждается тем, что при очень незначительных отличиях в величинах степени модификации для гидрогелей, полученных при мольных отношениях ванилин : КЭХ = 1 : 1 и 1 : 2.5 (табл. 1), в последнем случае синерезис не наблюдали.

Заметные различия в реологических свойствах гидрогелей КЭХ с ванилином и салициловым альдегидом, полученных при мольном отношении альдегид: КЭХ = 1 : 2.5 в 3 М растворе мочевины, также подтверждают большую роль водородных связей на начальных этапах формирования гидрогелей с ванилином (рис. 3). Через 24 ч, т.е. после завершения основного этапа гидрофобного упорядочения, присутствие мочевины влияло только на реологические свойства гидрогеля с салициловым альдегидом, в котором внутримолекулярная водородная связь определяет повышенную стабильность динамической иминной связи и, следовательно, эффективность формирования трехмерной структуры геля за счет гидрофобных взаимодействий между звеньями полимера с привитыми ароматическими заместителями. Вместе с тем, стоит отметить, что с уменьшением мольного отношения альдегид : КЭХ (1 : 5) влияние мочевины на реологические свойства гидрогелей наблюдали через 72 ч после добавления как ванилина, так и салицилового альдегида (данные не приводятся). Наиболее заметные изменения в ИК-спектрах продуктов взаимодействия КЭХ с ванилином (рис. 4) заключаются в появлении новой полосы при 1280 см^–1, которую можно отнести к валентным колебаниям С–O в фенольном гидроксиле ванилина, а также перераспределении интенсивностей полос в области 2700–3700 см^–1, в которой проявляются водородные связи [24]. Таким образом, наряду с гидрофобными взаимодействиями межмолекулярные и внутримолекулярные водородные связи действительно играют важную роль в формировании надмолекулярных структур в этих системах.

Динамическая природа связи в основаниях Шиффа хитозана с ароматическими аминами определяет рН-чувствительность таких гидрогелей и высвобождение альдегидов в раствор в кислой или щелочной среде [25]. Однако, в случае хитозана, который растворяется только в кислой среде, разрушение трехмерной структуры гидрогелей оснований Шиффа возможно только в кислой среде при pH < 4 [24], что ограничивает применение таких материалов как стимулчувствительных в физиологических условиях. Растворимость карбоксиалкилхитозанов в нейтральной и слабощелочной среде, где устойчивость иминной связи максимальна, позволяет не только получить более стабильные гидрогели, но и обеспечить возможность их диссоциации при физиологическом значении рН. Описанные ранее гидрогели высокомолекулярного хитозана с ванилином, полученные при мольном отношении ванилин : хитозан = 2 : 1 [20] и имеющие модуль накоплений более, чем на порядок выше, по сравнению с гидрогелями низкомолекулярного КЭХ с ванилином (рис. 1), полностью растворялись за 15 и 5 ч при температуре 23 и 45°С соответственно (рис. 5). Как видно на рис. 5, в диапазоне рН 4–8 растворимость гидрогелей КЭХ с ванилином, полученных при мольных отношениях ванилин : КЭХ = 1 : 2.5 и 1 : 5, в течение 24 ч при температуре 25°С не превышала 20%.

Обычно исследования набухания и растворимости гидрогелей для биомедицинского применения ограничиваются испытаниями в фосфатном буферном растворе при физиологическом значении рН. Однако установленное нами ранее значительное влияние аминокислот и белков на скорость растворения гидрогелей салицилиминов вследствие протекания реакции трансиминирования [9] свидетельствует о важности оценки стабильности стимулчувствительных гидрогелей в условиях, максимально приближенных к физиологическим условиям для клеток человека. Приведенные на рис. 6 данные по изменению массы гидрогелей при температуре 37°С в фосфатном буфере и среде DMEM для культивирования клеток млекопитающих подтверждают как более высокую стабильность гидрогелей КЭХ с ванилином по сравнению с аналогичными гидрогелями хитозана [20], так и значительно более высокую скорость растворения гидрогеля в присутствии аминокислот и белков. В первые 24 ч, за которые гидрогель КЭХ полностью растворился в среде DMEM, масса гидрогеля в фосфатном буфере увеличилась вдвое за счет набухания (рис. 6), при этом растворимость гидрогеля, определенная по результатам коллоидного титрования, как и при растворении при 25°С (рис. 5), не превышала 20%.

На рис. 7 представлены результаты анализа жизнеспособности и функциональной активности клеток HCT 116 с помощью проточной цитометрии после культивирования в присутствии сшивающих агентов и гидрогелей. Клетки окрашивали с помощью H₂DCFDA для оценки активности митохондрий клеток, TO-PRO-3™ для детекции апоптозных клеток и DAPI для окраски мертвых клеток. Доля функционально активных клеток в контрольной культуре (К) в течение 3 суток была выше 80%, доля апоптозных клеток составляла 2.5–10.5%, а мертвых – 3–8%. Культивирование в течение 24 ч в присутствии ванилина (рис. 7а) приводило к значительному дозозависимому понижению доли активных клеток и резкому увеличению доли мертвых клеток, причем гибель большей части клеток не была связана с запуском апоптоза. Цитотоксичность ванилина была значительно ниже (рис. 7а, область 1) по сравнению с салициловым альдегидом (рис. 7а, область 4) при той же мольной концентрации. Существенно меньшую токсичность для клеток наблюдали для гидрогелей КЭХ с ванилином в течение 3 суток культивирования по сравнению с гидрогелями салицилиминов КЭХ. Через 24 часа культивирования в присутствии гидрогеля КЭХ с ванилином, полученного при мольном отношении ванилин : КЭХ = 1 : 5 (рис. 7б, область 1), активность и жизнеспособность клеток недостоверно отличались от таковых контрольных клеток (рис. 7б, К). В то же время присутствие гидрогеля салицилимина КЭХ с тем же мольным отношением альдегид : полимер приводило к понижению доли активных клеток до 27–40% (рис. 7б, области 3–5) через 24 ч, а через 48 ч таких клеток оставалось всего 6–12% (рис. 7в, области 3–5). В связи с этим анализ состояния клеток через 72 ч культивирования (рис. 7г) был целесообразен только для клеток в гидрогелях ванилина. В гелях, полученных при мольном отношении ванилин : КЭХ = 1 : 5 (рис. 7г, область 1), функционально активными оставались около 40% клеток, а у значительной доли клеток (55%) наблюдали индукцию апоптоза. Несмотря на это, гидрогели КЭХ, полученные с использованием ванилина, в ряде случаев можно рассматривать как более перспективную альтернативу гидрогелям салицилиминов хитозана и КЭХ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование гелеобразования в растворе низкомолекулярного КЭХ со степенью замещения 0.38 в присутствии ванилина показало, что в отличие от хитозана КЭХ с ванилином можно использовать для получения стимулчувствительных гидрогелей с хорошими механическими свойствами. Скорость высвобождения ванилина как биологически активного альдегида из гидрогеля также может быть существенно снижена при использовании вместо хитозана его карбоксиалкилированного производного. Исследование влияния ванилина и гидрогелей КЭХ с ванилином на жизнеспособность опухолевых клеток HCT 116 подтвердило более низкую цитотоксичность полученных материалов по сравнению с гидрогелями, сшитыми салициловым альдегидом. Быстрое образование гидрогелей с малотоксичным ванилином, может быть полезным в 3D-печати для стабилизации структуры гидрогеля КЭХ, когда скорость образования основных ковалентных сшивок, в том числе фотосшивок, недостаточно высока, и ванилин играет роль “жертвенного” сшивающего агента.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект 20-13-00399).