Высокомолекулярные соединения (серия Б), 2023, T. 65, № 1, стр. 20-27

ВВЕДЕНИЕ

К настоящему времени хорошо известно влияние конформационной и надмолекулярной структуры полимеров на скорость протекания тех или иных химических реакций [1], например процессов термической [2, 3], окислительной [4, 5] и ферментативной деструкции полимеров в растворе [6–9].

Получаемые из растворов материалы характеризуются значительной склонностью к образованию неравновесных структур [10, 11], вследствие чего свойства и структура формуемых из растворов пленочных покрытий характеризуются зависимостью от ряда факторов как со стороны используемого растворителя (скорость его удаления, термодинамическое качество, природа и т.д.), так и полимера (молекулярная масса, степень кристалличности, концентрация в исходном растворе и т.д.) [12–16].

Спектр находящихся в растворе надмолекулярных образований обусловлен совокупностью взаимодействия звеньев полимера друг с другом и с растворителем. Фактически в процессе получения полимерного материала из раствора происходит последовательное изменение надмолекулярной структуры, обусловленное постепенным переходом через ряд концентрационных режимов полимера в растворе по мере удаления растворителя, и связанное с этим превращение дискретных агрегатов макромолекул в растворе в бесконечный кластер [18].

В результате появляется возможность целенаправленно использовать отклик в скорости протекания химических реакций на надмолекулярное состояние полимера, например, ферментативной устойчивости полимерных материалов. Ранее в работах [19–21], посвященных изучению гидролиза хитозана как полимерной основы раневых покрытий [22, 23], была выявлена необходимость повышения его устойчивости к действию ферментов. Данная проблема может быть с успехом решена варьированием надмолекулярной структуры полимера в растворе, например за счет введения низкомолекулярных электролитов или коллоидных частиц [21, 24, 25], приводящим к изменению доступности звеньев полимера для взаимодействия с ферментом. При этом, как показано в работе [26], выявленные закономерности ферментативного гидролиза, протекающего в гомогенной среде, сохраняются и для твердых пленочных материалов.

Настоящая работа посвящена изучению проявления надмолекулярного эффекта в реакциях ферментативного гидролиза другого полисахарида – натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (Na-КМЦ). Выбор полимера обусловлен широким применением целлюлозы и ее производных в различных областях медицины как вспомогательного ингредиента в таблетированных лекарственных препаратах, так и в качестве связующей и стабилизирующей основы мазей и гелей [27].

Для регулирования надмолекулярной структуры Na-КМЦ в растворе выбран подход, заключающийся в использовании сорастворителей (модификаторов), в качестве которых использовали ряд спиртов (этанол, пропиленгликоль и глицерин). Ранее для них на примере растворов хитозана и натриевой соли сукцинамида хитозана было выявлено их существенное влияние на конформационное и надмолекулярное состояние полимеров в растворе [28–31]. Поскольку структуры, формирующиеся при взаимодействии полимера и растворителя остаются после удаления растворителей в метастабильных состояниях в твердой фазе, можно ожидать, что наличие со-растворителя (модификатора) повлияет на свойства и структуру формирующихся из раствора пленок.

Таким образом, цель настоящей работы – изучение влияния модифицирующих добавок на конформационное и надмолекулярное состояние Na-КМЦ и процесс ферментативного гидролиза данного полимера в растворе и в пленках.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовали натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы, со степенью замещения γ = 80% и М_w = 2.5 × 10 марки Blanose CMC 7 MFPH производства “Ashland Inc.” (Франция). Растворителем служила дистиллированная вода. Растворы Na-КМЦ в смешанном растворителе готовили при объемном соотношении вода : сорастворитель равном 90 : 10, 80 : 20 и 70 : 30. В качестве сорастворителей использовали этанол, пропиленгликоль и глицерин.

Ферментом служила гиалуронидаза (торговое название “Лираза” производства Закрытого акционерного общества “Микроген”, Москва). Этот фермент относится к β-гликозидазам, присутствующим на раневой поверхности организма человека. В работах [26, 32] было выявлено ее неспецифическое действие на такие полисахариды как хитозан и натриевую соль сукцинамида хитозана, также была разработана методика эксперимента. Концентрация ферментного препарата при проведении процесса гидролиза составляла 1 г/л. Ферментный препарат вносили в раствор полимера, после чего выдерживали в течение определенного времени. О протекании процесса судили по накоплению концентрации восстанавливающих сахаров [33]. Начальную скорость гидролиза определяли как тангенс угла наклона зависимости концентрации восстанавливающих сахаров от времени t при t → 0. Ферментативный гидролиз останавливали путем выдерживания колбы с раствором полимера в кипящей воде в течение 10 мин. Общую β-гликозидазную активность гиалуронидазы определяли согласно работе [34].

Пленки формировали в чашке Петри методом полива раствора полимера на поверхность стекла. Для проведения ферментативной деструкции пленочный образец помещали на подложку, смоченную раствором ферментного препарата, выдерживали в течение определенного времени в термостатируемых условиях. Как и в случае раствора полимера, протекание ферментативной деструкции останавливали путем выдерживания бюкса с пленочным образцом в кипящей воде в течение 10 мин. Затем готовили раствор заданной концентрации и находили концентрацию восстанавливающих сахаров по методике [34].

Характеристическую вязкость определяли с помощью вискозиметра Убеллоде при температуре 25 ± 1°С и рассчитывали, используя метод Баранова [35]. Степень структурирования раствора δ оценивали по тангенсу угла наклона экспериментальных зависимостей удельной вязкости растворов Na-КМЦ от концентрации полимера в растворе в логарифмических координатах [36].

Реологические измерения водных растворов Na-КМЦ проводили на модульном динамическом реометре “Haake Mars III” при 25°С в осцилляционном режиме (с определением комплексной вязкости) и в режиме непрерывного сдвигового деформирования (с определением динамической вязкости).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Факт ферментативного гидролиза Na-КМЦ можно подтвердить прямым определением количества восстанавливающих сахаров, образующихся на концах макромолекул полисахаридов при разрыве гликозидной связи:

Возможность применения данного метода для процессов ферментативного гидролиза полисахаридов была доказана в работе [33].

Выдерживание растворов Na-КМЦ в воде в отсутствии фермента даже в течение длительного времени не сопровождается каким-либо изменением концентрации восстанавливающих сахаров. Напротив, в присутствии ферментного препарата концентрация восстанавливающих сахаров закономерно увеличивается (рис. 1, кривые 2–5). Представленные на рис. 1 кинетические кривые процесса ферментативного гидролиза Na-КМЦ имеют типичный для ферментативных реакций вид – резкое повышение концентрации восстанавливающих сахаров в начальный период времени, соответствующий более быстрому процессу гидролиза, сменяется более пологим участком. При этом обращает на себя внимание тот факт, что начальная скорость и глубина протекания реакции определяется не только временем контакта с ферментом, но и концентрацией полимера в растворе.

Рис. 1.

Зависимость количества восстанавливающих сахаров, содержащихся в 0.1 мл раствора Na-КМЦ с концентрацией 0.1 (1, 2), 0.2 (3), 0.3 (4) и 1.0 г/дл (5) от времени выдержки раствора в отсутствие (1) и присутствии (2–5) ферментного препарата.

На рис. 2 приведена зависимость скорости накопления восстанавливающих сахаров в присутствии ферментного препарата, определенная на начальном участке кинетической кривой, от концентрации Na-КМЦ в растворе. Видно (кривая 1), что после достижения концентрации полимера в растворе ≈0.3 г/дл, скорость процесса практически перестает увеличиваться с ростом концентрации. Это, по всей видимости, может быть связано с возникающими диффузионными затруднениями для взаимодействия полимера с ферментом. Причиной может служить повышение степени структурированности (агрегации) макромолекул в растворе при повышении концентрации полимера. На то, что степень агрегации полимера в растворе δ увеличивается, указывают результаты вискозиметрических измерений (табл. 1). Из данных, представленных в табл. 1 следует, что если раствор Na-КМЦ в интервале концентраций 0.02–0.05 г/дл представляет собой истинный раствор не взаимодействующих между собой макромолекул (о чем свидетельствует значение показателя δ = 1), то в интервале концентраций 0.1–0.3 г/дл раствор Na-КМЦ в воде представляет собой структурированную жидкость (δ > 1).

Рис. 2.

Зависимость от содержания Na-КМЦ в растворе скорости накопления восстанавливающих сахаров, содержащихся в 0.1 мл раствора Na-КМЦ в воде (1) и в присутствии добавки этанола (2), пропиленгликоля (3) и глицерина (4) в объемном соотношении вода : добавка 80 : 20.

На это же указывают и данные реологических измерений. Разбавленный раствор Na-КМЦ ведет себя как типичная ньютоновская жидкость, вязкость которой не зависит от скорости сдвига (рис. 3а, кривая 1) или частоты осцилляции (рис. 3б, кривая 1). Полуразбавленный, а тем более концентрированный раствор полимера, представляет собой псевдопластичную жидкость, в которой вязкость уменьшается с увеличением частоты осцилляции или скорости сдвига (рис. 3, кривые 2).

Рис. 3.

Зависимости динамической (а) и комплексной (б) вязкости раствора Na-КМЦ от скорости сдвига (а) и частоты осцилляции (б). Концентрация Na-КМЦ: а – 0.05 (1) и 0.6 г/дл (2), б – 0.1 (1) и 5 г/дл (2).

При этом концентрация, соответствующая началу формирования флуктуационной сетки зацеплений с_е, определяемая по началу резкого роста вязкости при повышении концентрации полимера в растворе, составляет ≈0.3 г/дл (рис. 4, кривая 1). Интересно, что данная концентрация коррелирует с той, при которой наблюдался перегиб на кривой зависимости скорости ферментативного гидролиза от концентрации полимера в растворе (рис. 2, кривая 1). По всей вероятности, образование агрегатов из макромолекул Na-КМЦ, неизбежно имеющее место при повышении концентрации полимера, приводит к уменьшению доступности звеньев полимера для взаимодействия с ферментом. Очевидно, что фермент взаимодействует только со звеньями на поверхности макромолекулярных клубков и их агрегатов.

Рис. 4.

Зависимость от содержания Na-КМЦ в растворе комплексной вязкости растворов Na-КМЦ, определенной при частоте осцилляции 1 Гц, в воде (1) и в присутствии добавки этанола (2, 3), пропиленгликоля (4) и глицерина (5) в объемном соотношении вода : добавка 80 : 20 (2, 4, 5) и 90 : 10 (3).

Наличие модифицирующих добавок (сорастворителей) в растворе приводит к изменениям в конформационном и надмолекулярном состоянии Na-КМЦ. О том, что макромолекулы полимера в присутствии добавок имеют иную, чем в воде, конформацию, свидетельствуют значения характеристической вязкости. Так, из данных табл. 1 видно, что последовательная замена воды на модифицирующую добавку вызывает закономерное уменьшение значений характеристической вязкости. Из сравнений значений следует, что к наиболее существенному уменьшению значений характеристической вязкости полимера приводит введение этанола, поскольку именно он из трех изучаемых добавок вызывает выделение фазы Na-КМЦ из раствора. В случае использования глицерина и пропиленгликоля размер клубка уменьшается не столь значительно. Снижение характеристической вязкости с ухудшением качества растворителя обусловлено сжатием макромолекулярных клубков. При этом наблюдается не только изменение конформации макромолекул, но и степени структурированности полимера в растворе. В том диапазоне концентраций, в которой макромолекулы Na-КМЦ были не агрегированы при использовании в качестве растворителя воды, в присутствии модифицирующих добавок растворы Na-КМЦ представляют собой структурированные жидкости (даже формально в разбавленной области). При переходе в область более высоких концентраций характеристическая вязкость с ухудшением качества растворителя уменьшается, а динамическая (комплексная) вязкость полуразбавленных и концентрированных растворов увеличивается.

Более того, как видно из сравнений кривых 1 и 2–5 рис. 4, присутствие сорастворителей в растворе способствует тому, что резкий рост вязкости, связанный с формированием сетки зацеплений, начинается при меньших концентрациях Na-КМЦ, чем в их отсутствие. Так, в присутствии этанола концентрация с_е снижается практически на порядок. Важно то, что формирование сетки зацеплений, вызывающее уменьшение доступности звеньев полимера для взаимодействия с ферментом, сказывается на значении скорости ферментативного гидролиза. Как видно из сравнения кривых рис. 2, наличие модифицирующих добавок в растворе приводит к тому, что значение концентрации Na-КМЦ, при которой скорость ферментативного гидролиза практически выходит на предел, смещается в область меньших величин. При этом введение сорастворителя во всех случаях сопровождается уменьшением скорости (на начальном участке) и глубины ферментативного гидролиза. Из рис. 2 следует, что при использовании в качестве модифицирующей добавки глицерина уменьшается скорость ферментативного гидролиза примерно на 20–30%, в то время как добавление этанола – более, чем на 50%. Таким образом, существует взаимосвязь между скоростью ферментативного гидролиза Na-КМЦ и характером изменения его конформационного и надмолекулярного состояния в растворе.

Однако можно предположить, что уменьшение скорости ферментативного гидролиза, может быть обусловлено не только ухудшением термодинамического качества растворителя, повышением степени структурированности раствора и соответствующим уменьшением доступности звеньев полимера для взаимодействия с ферментом, но и влиянием модифицирующих добавок на активность ферментного препарата. Проведенные исследования по определению общей β-гликозидазной активности гиалуронидазы показало, что при введении добавок действительно уменьшается активность фермента. Так, если общая β-гликозидазная активность гиалуронидазы в воде составляла 66 Е/г, то в присутствии глицерина, пропиленгликоля и этанола, взятых в объемном соотношении вода : добавка, равном 80 : 20, она составляет 43, 33 и 20 Е/г соответственно. Обращает на себя внимание тот факт, что влияние модифицирующих добавок на активность ферментного препарата коррелирует с характером изменения скорости процесса: медленнее всего гидролиз происходит именно в присутствии этанола, для которого сильнее всего изменяется как активность фермента, так и конформационно-надмолекулярное состояние полимера в растворе. В связи с этим однозначно нельзя полагать, чем вызвано уменьшение скорости ферментативного гидролиза Na-КМЦ в присутствии модифицирующих добавок – надмолекулярным эффектом или уменьшением активности фермента.

Оценка вклада конформационно-надмолекулярного состояния полимера в растворе на характер протекания процесса ферментативного гидролиза проведена на примере пленочных материалов. Использовали пленки, полученные из растворов в воде и в смеси воды с этанолом, который в процессе сушки пленок полностью удаляется, и, следовательно, не может оказать влияние на активность фермента при ферментативном гидролизе пленочных материалов.

Как и в случае деструкции Na-КМЦ в растворе, при деструкции пленочных образцов накопление восстанавливающих сахаров со временем имело нелинейный характер. Наиболее значительное падение характеристической вязкости происходило в начальном периоде в течение 10–20 мин. Дальнейшая ферментативная экспозиция пленочных образцов, сказывалась на степени повышения концентрации восстанавливающих сахаров в существенно меньшей степени (рис. 5).

Рис. 5.

Зависимость количества восстанавливающих сахаров от времени контакта пленочных образцов Na-КМЦ с раствором ферментного препарата. Пленки получены из раствора полимера в воде (1) и в присутствии добавки этанола (2–4) в объемном соотношении вода : этанол 90 : 10 (2), 80 : 20 (3) и 70 : 30 (4). Содержание ферментного препарата на подложке 1 г/л.

Значение скорости ферментативного гидролиза пленочных образцов, полученных в отсутствие этанола, составляет 0.028 мг/мин. В присутствии добавки этанола в объемном соотношении вода : этанол 90 : 10, 80 : 20 и 70 : 30 скорость гидролиза составляет 0.018, 0.012 и 0.0008 мг/мин соответственно.

Обращают на себя внимание два момента. Во-первых, несмотря на то, что этанола в пленке уже не было и повлиять на активность фермента он не мог, скорость и глубина процесса в пленках, сформированных из смешанного растворителя вода : этанол была меньше, нежели в пленках, полученных из воды. При этом, чем больше этанола находилось в исходном растворе, тем меньше была скорость ферментативной деструкции в полученном пленочном материале. Ранее аналогичные закономерности были обнаружены для пленок, полученных из растворов хитозана в смешанном растворителе 1%-ная уксусная кислота–этанол [29]. Очевидно, что различия в надмолекулярных характеристиках растворов полимеров в индивидуальном и смешанном растворителе сохраняются и при переходе к конденсированным системам (пленкам). В связи с этим, единственной причиной уменьшения скорости процесса ферментативного гидролиза в пленках, полученных из смешанного растворителя вода–этанол, можно считать различие в надмолекулярном состоянии Na-КМЦ в данных пленках.

Во-вторых, переход к гетерогенной системе пленка полимера–раствор фермента мог бы сопровождаться существенным уменьшением степени гидролиза вследствие уменьшения доступности реагентов для взаимодействия друг с другом. Тем не менее, при сравнимом количестве фермента степень накопления восстанавливающих сахаров в растворах Na-КМЦ, полученных путем растворения пленок, больше, чем при проведении ферментативного гидролиза в растворах. Подобного рода факты могут быть объяснены как проявление одного из характерных макромолекулярных эффектов в химических реакциях полимеров – эффекта изменения локальных концентраций.

Таким образом, варьирование надмолекулярной структуры является фактором, безусловно, оказывающим влияние на степень ферментативной устойчивости пленочных образцов Na-КМЦ. В связи с этим за счет варьирования структуры полученного из раствора пленочного материала можно регулировать скорость и степень разложения пленки. Важность данного факта заключается в том, что хоть способность к биоразложению – один из весомых достоинств полисахаридов, низкая ферментативная устойчивость материалов на их основе является фактором, ограничивающим их применение, сокращая срок службы в условиях медицинского использования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Методом определения восстанавливающих сахаров доказан факт протекания гидролиза натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы под действием неспецифического фермента гиалуронидазы. Показано, что введение сорастворителей (модификаторов) глицерина, пропиленгликоля и этанола в систему Na-КМЦ–вода приводит к изменению конформационно-надмолекулярного состояния полимера в растворе – уменьшению размеров макромолекулярных клубков и более раннему формированию сетки зацеплений. Добавление указанных модификаторов понижает активность ферментного препарата. Показана взаимосвязь скорости и глубины ферментативного гидролиза натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы и активности фермента, а также размера макромолекулярного клубка и концентрации формирования сетки зацеплений. Установлено, что закономерности ферментативного гидролиза в растворе сохраняются и при переходе к пленочным образцам.