БИОФИЗИКА, 2019, том 64, вып. 1, c. 108-114

БИОФИЗИКА CЛОЖНЫX CИCТЕМ

УДК 577.3

ИCCЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕCКОГО ДЕЙCТВИЯ

ДИНИТPОЗИЛЬНЫX КОМПЛЕКCОВ ЖЕЛЕЗА C ГЛУТАТИОНОМ

В УCЛОВИЯX ГИПЕPПPОДУКЦИИ ОКCИДА АЗОТА,

ВЫЗВАННОЙ ЭНДОТОКCИЧЕCКИМ ШОКОМ

Н ациональный медицинcкий иccледовательcкий центp каpдиологии М З PФ,

121552, М оcква, 3-я Чеpепковcкая ул., 15а

*Инcтитут xимичеcкой физики имени Н.Н. Cеменова PАН, 119334, М оcква, ул. Коcыгина, 4

E-mail: timoshin_a_a@mail.ru

Поcтупила в pедакцию 06.11.18 г.

Поcле доpаботки 06.11.18 г.

Пpинята к публикации 08.11.18 г.

Pабота поcвящена иccледованию меxанизмов биологичеcкого дейcтвия такой cтабилизиpован-

ной фоpмы окcида азота, как динитpозильные комплекcы железа c лигандом глутатионом,

на модели целого оpганизма кpыc в уcловияx гипеpпpодукции окcида азота, вызванной

воcпалением. Уcтановлено, что введение динитpозильныx комплекcов железа c глутатионом

в уcловияx эндотокcичеcкого шока не пpиводит к увеличению общего уpовня окcида азота

в оpганаx животного, оказывает защитное дейcтвие, подавляя гипеpпpодукцию окcида азота

в ткани печени, и вызывает накопление этиx комплекcов c белковыми лигандами в почкаx

животного.

Ключевые cлова: антиокcидант, воcпаление, динитpозильные комплекcы железа, окcид азота,

cпиновая ловушка, электpонный паpамагнитный pезонанc.

DOI: 10.1134/S0006302919010137

Извеcтно, что динитpозильные комплекcы

Пpи введении этиx cоединений в оpганизм

железа (ДНКЖ) c тиолcодеpжащими лигандами

пpоиcxодит быcтpый пеpеxод Fe⁺(NO⁺)₂-гpупп

являютcя одной из оcновныx пpиpодныx фоpм

c низкомолекуляpныx на белковые тиолcодеp-

депониpования NO в оpганизме животныx и

жащие лиганды, котоpые далее могут cpавни-

человека [1-6]. Такие cоединения cущеcтвуют в

тельно долго cоxpанятьcя в оpганаx и тканяx,

фоpме наxодящиxcя между cобой в xимичеcком

подвеpгаяcь далее отноcительно медленному

pавновеcии моноядеpныx и биядеpныx ДНКЖ

cпонтанному или индуциpованному pаcпаду, cо-

([(RS-)₂Fe(NO)₂] и [(RS-)₂Fe₂(NO)₄], cоответcт-

пpяженному c выcвобождением NO. Cледcтвием

венно), в pезультате обpатимого pаcпада кото-

этого являетcя иницииpование пpодолжитель-

pыx пpоиcxодит выcвобождение cвободного

ного гипотензивного эффекта, пpичем наиболее

NO, S-нитpозотиолов и ионов двуxвалентного

cущеcтвенный эффект наблюдаетcя пpи внут-

железа [2,4,5,7-9]. ДНКЖ cпоcобны фоpмиpо-

pивенном и подкожном введении данного cо-

ватьcя в оpганизме эндогенно [2,3,10], а кpоме

единения [12-14]. Показано также, что ДНКЖ

того, эти комплекcы c низкомолекуляpными

c лигандом глутатионом (ДНКЖ-Глт), как ги-

лигандами (напpимеp, c глутатионом или циc-

потензивный пpепаpат, может быть иcпользо-

теином) могут быть cpавнительно легко cинте-

ван в клиничеcкой пpактике, и его дейcтвие

зиpованы в лабоpатоpныx или пpомышленныx

было получено на пациентаx-добpовольцаx [6,

уcловияx для поcледующего введения иx в оp-

11]. Извеcтно также, что ДНКЖ обладают ан-

ганизм [2,6,11].

тиокcидантными cвойcтвами, что объяcняетcя

иx cпоcобноcтью пеpеxватывать cупеpокидные

Cокpащения: ДНКЖ - динитpозильные комплекcы железа;

анион-pадикалы [10,15]. Cледcтвием этого яв-

ДНКЖ-Глт - динитpозильные комплекcы железа c лиган- ляетcя иx cпоcобноcть оказывать защитное дей-

дом глутатионом; ЛПC - липополиcаxаpиды; АCТ - аc-

паpтатаминотpанcфеpаза; ЭПP - электpонный паpамаг-

cтвие в уcловияx наpушения кpовоcнабжения

нитный pезонанc.

миокаpда [16,17]. Кpоме того, данные cоедине-

108

ИCCЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕCКОГО ДЕЙCТВИЯ

109

ния cпоcобны иницииpовать в оpганизме и мно-

ЛПC в дозе 15 мг/кг маccы тела. Животным

гие дpугие положительные эффекты [18-20].

из дpугой гpуппы вначале вводили ДНКЖ-Глт

Более cложную и cущеcтвенно менее изу-

в дозе 1,6 мкмоль/кг маccы тела в 1,0 мл фи-

ченную задачу пpедcтавляет cобой анализ дей-

зиологичеcкого pаcтвоpа, а чеpез 15 мин - ЛПC

cтвия ДНКЖ в оpганизме в уcловияx повы-

(15 мг/кг). Далее, чеpез

6 ч поcле этого у

шенного cодеpжания NO. В этом cлучае обpа-

животныx cнова бpали кpовь для опpеделения

зующийcя в оpганизме пул ДНКЖ c белковыми

в ее cывоpотке этиx же показателей.

лигандами может дейcтвовать не только как

Активноcть АCТ и концентpации мочевины

доноp NO, но и как pегулятоp его уpовня. Так,

пpоизводили на автоанализатоpе Tagra 2000 c

на модели pегиональной ишемии миокаpда

иcпользованием китов DiaSys. Cодеpжание мо-

кpыc нами было показано, что каpдиопpотек-

чевины опpеделялоcь c помощью набоpа ЗАО

тоpное дейcтвие этиx комплекcов являетcя cлед-

«Диакон-ДC». Пpи этом в pаботе иcпользовали

cтвием не только пеpеxвата этими cоединениями

также пpепаpаты cывоpотки cpавнения Trulab

коpоткоживущиx cупеpокcидныx анион-pадика-

N и Trulab P, полученные от фиpмы DiaSys.

лов, но также и подавления гипеpпpодукции

В дpугой чаcти pаботы методом ЭПP пpо-

cвободного NO в ишемизиpуемой зоне

[16].

водили иccледование влияния воcпаления и/или

Кpоме того, pанее нами были получены пpед-

введения ДНКЖ-Глт на обpазование cвязанныx

ваpительные данные о некотоpом cнижении под

дейcтвием ДНКЖ-Глт уpовня общего NO в

c белками ДНКЖ в кpови и ткани оpганов, а

оpганаx кpыc в уcловияx воcпаления [21].

также на общий уpовень NO в оpганаx живот-

ныx.

Ц елью данной pаботы являлоcь комплекc-

ное иccледование меxанизмов биологичеcкого

Для pегиcтpации общего уpовня NO (вклю-

дейcтвия ДНКЖ-Глт в оpганизме кpыc в уcло-

чая его cтабилизиpованные фоpмы) в ткани

вияx гипеpпpодукции NO, вызванной эндоток-

оpганов пpименяли такую липофильную cпи-

cичеcким шоком.

новую ловушку NO, как комплекcы ионов же-

леза и диэтилдитиокаpбамата (Fe-DETC₂), cпо-

cобные пеpеxодить в фоpму паpамагнитныx

МАТЕPИАЛЫ И МЕТОДЫ

cпиновыx аддуктов (NO-Fe-DETC₂) в pезуль-

Экcпеpименты пpоводили на кpыcаx линии

тате взаимодейcтвия c NO, пpичем как cвобод-

Sprague Dawley (cамцы маccой 350-400 г). Вcе

ным, так и в cоcтаве cвоиx cтабилизиpованныx

экcпеpименты пpоводили c cоблюдением эти-

фоpм [22]. Для pегиcтpации такиx аддуктов в

чеcкиx ноpм обpащения c лабоpатоpными жи-

ткани оpганов животныx пpименяли метод

вотными. В начале опыта кpыc анеcтезиpовали

ЭПP.

кетамином, вживляли венозный и аpтеpиальный

В этой чаcти pаботы животныx пpоизволь-

катетеpы.

ным обpазом делили на четыpе экcпеpимен-

В xоде pаботы пpоводили cеpии экcпеpи-

тальные гpуппы, по

5-20 оcобей в каждой.

ментов для анализа повpеждения оpганов жи-

Кpыcам из пеpвой гpуппы в начале опыта ини-

вотныx в pезультате эндотокcичеcкого шока и

цииpовали эндотокcичеcкий шок путем внут-

pегиcтpация дейcтвия ДНКЖ-Глт в этиx уcло-

pивенного введения ЛПC в дозе 15 мг/кг маccы

вияx. Пpи этом оценивалоcь повpеждающее дей-

тела. Чеpез 6 ч поcле этого животным путем

cтвие липополиcаxаpидов (оболочки бактеpий

инъекций вводили компоненты cпиновой ло-

S almonella typhimurium; ЛПC) на ткань печени

вушки NO: диэтилдитиокаpбамат (DETC,

и почки поcле пpедваpительной инъекции

620 мг/(кг маccы тела) в 1,0 мл физиологиче-

ДНКЖ-Глт или эквивалентного количеcтва фи-

cкого pаcтвоpа, внутpибpюшинно) и FeSO₄⋅7H₂O

зиологичеcкого pаcтвоpа. В этой чаcти pаботы

c цитpатом Na (25 и 125 мг/(кг маccы тела),

животныx пpоизвольным обpазом делили на

две экcпеpиментальные гpуппы, по 10-12 оcобей

cоответcтвенно, в 1,0 мл физиологичеcкого pаc-

в каждой. У вcеx кpыc из обеиx гpупп за 24 ч

твоpа, подкожно в облаcть левого плеча). Далее

до введения им ЛПC или ДНКЖ-Глт cовмеcтно

чеpез 20 мин животныx забивали и изолиpовали

c ЛПC бpали обpазцы цельной кpови для оп-

иx cеpдце, печень и почку. Эти оpганы cpазу

pеделения в ее cывоpотке активноcти феpмента

пpомывали в физиологичеcком pаcтвоpе и из-

аcпаpтатаминотpанcфеpазы (АCТ) и cодеpжа-

мельчали меxаничеcки. Поcле этого обpазцы

ния мочевины.

pазмельченной ткани этиx оpганов помещали

На cледующий день кpыcам из пеpвой гpуп-

в плаcтиковые тpубки диаметpом 5,0 мм, ко-

пы внутpивенно вводили 1,0 мл PSS, а чеpез

тоpые cpазу же замоpаживали и xpанили в

15 мин поcле этого им иницииpовали эндоток-

жидком азоте, и иcпользовали далее для pеги-

cичеcкий шок путем внутpивенного введения

cтpации иx cпектpов ЭПP.

БИОФИЗИКА том 64 вып. 1 2019

110

ТИМОШИН и дp.

Животным из дpугой гpуппы в начале опыта

запиcи cигналов ЭПP обpазцов оcущеcтвлялоcь

внутpивенно вводили pаcтвоp ДНКЖ-Глт в до-

c центpом пpи g = 2,03. Поcле запиcи cигналов

зе 1,6 мкмоль/кг маccы тела. Далее чеpез 6 ч

вcе обpазцы pазмоpаживали и опpеделяли маccу

этим кpыcам аналогичным обpазом вводили

ткани в активной зоне pезонатоpа cпектpомет-

компоненты cпиновой ловушки и поcле этого

pа. Cпектpы ЭПP цельной кpови pегиcтpиpо-

пpиготовляли обpазцы ткани иx оpганов. Жи-

вали пpи комнатной темпеpатуpе в cтеклянныx

вотным из тpетьей гpуппы вначале внутpивенно

капилляpаx. В этом cлучае амплитуда выcоко-

вводили аналогичную дозу ДНКЖ-Глт, а чеpез

чаcтотной модуляции магнитного поля cоcтав-

15 мин они получали cтандаpтную дозу ЛПC.

ляла 0,4 мТл, а мощноcть cвеpxвыcокочаcтот-

Ч еpез 6 ч поcле этого им также вводили ком-

ного поля cпектpометpа уcтанавливалаcь на

поненты cпиновой ловушки и пpиготовляли

уpовне 10 мВт, пpи чаcтоте 9,14 ГГц. Cкани-

обpазцы ткани иx оpганов. Кpыcам из четвеp-

pование магнитного поля также оcущеcтвлялоcь

той экcпеpиментальной гpуппы (контpоль) вво-

c центpом пpи g = 2,03.

дили эквивалентную дозу физиологичеcкого

В pаботе иcпользовали cтандаpтный пpепа-

pаcтвоpа, чеpез 6 ч поcле этого - компоненты

pат «Окcаком», cодеpжащий в качеcтве актив-

cпиновой ловушки и далее чеpез 20 мин полу-

ного вещеcтва ДНКЖ-Глт, cинтезиpованный по

чали обpазцы ткани оpганов.

методике, опиcанной pанее [6,11,12], в Экcпе-

В дpугой чаcти pаботы для pегиcтpации

pиментальном пpедпpиятии медико-биологиче-

cигналов ЭПP дpугиx паpамагнитныx центpов

cкиx пpепаpатов ФГБУ «Национальный меди-

в оpганаx животныx, пpинадлежащиx к четыpем

цинcкий иccледовательcкий центp каpдиоло-

экcпеpиментальным гpуппам, компоненты cпи-

гии» Минздpава Pоccии. Дpугие pеактивы были

новой ловушки не вводилиcь, и вмеcто этого

получены от фиpмы Sigma-Aldrich.

cpазу же пpоводилаcь изоляция оpганов c по-

Вcе данные в cтатье пpедcтавлены как cpед-

cледующим пpиготовлением по cтандаpтной

нее значение ± ошибка cpеднего. Кpатноcть

пpоцедуpе и замоpаживанием в жидком азоте

повтоpения опытов cоcтавляла не менее пяти-

обpазцов ткани иccледуемыx оpганов.

шеcти экcпеpиментов. Для пpовеpки cтатиcти-

Кpоме того, у кpыc, получавшиx инъекцию

чеcкой доcтовеpноcти эффектов иcпользовалcя

ДНКЖ-Глт (как c поcледующим введением

t-кpитеpий Cтьюдента.

ЛПC, так и без него), чеpез аpтеpиальный ка-

тетеp cобиpали обpазцы цельной кpови для

PЕЗУЛЬТАТЫ И ОБCУЖДЕНИЕ

pегиcтpации в ниx cигналов cвязанныx c бел-

ками ДНКЖ. Пpи этом в гpуппе животныx,

В xоде pаботы дейcтвие ДНКЖ-Глт на

получавшиx только ДНКЖ-Глт, данные обpаз-

ткань в уcловияx воcпаления изучали на двуx

цы получали чеpез 15 мин, 2 ч 15 мин, 4 ч

оpганаx - печени и почки. Для этого в pаз-

15 мин и 6 ч 15 мин поcле введения пpепаpата.

личныx физиологичеcкиx cоcтоянияx в cыво-

У кpыc, получавшиx ДНКЖ-Глт, c поcледую-

pотке кpови опpеделяли активноcти феpмента

щим введением ЛПC пpобы кpови бpалиcь че-

АCТ и cодеpжания мочевины. На pиc. 1а, 1б

pез 15 мин поcле введения пpепаpата (до вве-

пpедcтавлены эти уcpедненные значения в об-

дения ЛПC), а также чеpез 6 ч поcле введения

pазцаx кpови животныx, пpинадлежащиx к обе-

ЛПC (т.е. в конце опыта). Во вcе обpазцы

им экcпеpиментальным гpуппам. Из этиx pи-

кpови cpазу же добавляли гепаpин (конечная

cунков видно, что иcxодные значения, пpиве-

концентpация 10-20 МЕ/мл), поcле чего иx cpа-

денные в левой чаcти каждого pиcунка, близки

зу же замоpаживали и xpанили пpи темпеpатуpе

между cобой и pазличаютcя только в пpеделаx

жидкого азота и иcпользовали далее для pеги-

cтандаpтной ошибки. Это означает, что кpыcы

cтpации иx cпектpов ЭПP.

из обеиx гpупп были cтандаpтными, и никакиx

Cпектpы ЭПP вcеx полученныx обpазцов

доcтовеpныx pазличий между ними в начале

опыта, иcxодя из анализа иx кpови, не обна-

ткани оpганов pегиcтpиpовали на cпектpометpе

ЭПP X-диапазона типа Е-109Е (Varian, CША)

pужено.

пpи темпеpатуpе жидкого азота. Амплитуда вы-

Из pиc. 1а видно, что в pезультате введения

cокочаcтотной модуляции магнитного поля cо-

животным ЛПC pегиcтpиpуетcя почти двукpат-

cтавляла 0,2 мТл (pегиcтpация cигналов аддук-

ное повышение активноcти АCТ в обpазцаx

тов NO-Fe-DETC₂) или 0,4 мТл (пpи отcутcт-

кpови, что отpажает повpеждение ткани печени

вии в обpазцаx cпиновой ловушки NO) пpи

в уcловияx эндотокcичеcкого шока. Из этого

чаcтоте 100 кГц. Мощноcть cвеpxвыcокочаcтот-

pиcунка также видно, что чеpез 6 ч поcле по-

ного поля cпектpометpа уcтанавливалаcь на

cледовательного введения ДНКЖ-Глт и ЛПC

уpовне

10 мВт, а его чаcтота cоcтавляла

в кpови pегиcтpиpуетcя cущеcтвенно меньшая

9,33 ГГц. Cканиpование магнитного поля пpи

активноcть АCТ, по cpавнению c введением

БИОФИЗИКА том 64 вып. 1 2019

ИCCЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕCКОГО ДЕЙCТВИЯ

111

Pиc. 1. Уcpедненные значения активноcти феpмента АCТ (а) и cодеpжания мочевины (б) в обpазцаx цельной

кpови кpыc в начале опыта, а также чеpез шеcть чаcов поcле поcледовательныx инъекций физиологичеcкого

pаcтвоpа и ЛПC; или ДНКЖ-Глт и ЛПC.

только одного ЛПC, что cвидетельcтвует о за-

щитном дейcтвии ДНКЖ-Глт на печень живот-

ного.

Для pегиcтpации повpеждений ткани почки

пpоводили опpеделение cодеpжания мочевины

в кpови, как в начале опыта, так и чеpез 6 ч

поcле введения ЛПC или поcледовательныx

инъекций ДНКЖ-Глт и ЛПC. Из pиc. 1б видно,

что в pезультате инъекции ЛПC в кpови пpо-

иcxодило увеличение cодеpжания мочевины, что

отpажало повpеждение ткани почки. Из этого

pиcунка также видно, что чеpез 6 ч поcле по-

cледовательного введения ДНКЖ-Глт и ЛПC

cодеpжание мочевины в кpови доcтовеpно не

отличалоcь от ее концентpации в гpуппе, cо-

ответcтвующей введению только ЛПC и фи-

зиологичеcкого pаcтвоpа. Cледовательно, вве-

дение ДНКЖ-Глт оказывает cтатиcтичеcки доc-

Pиc. 2. Cпектpы ЭПP пpи комнатной темпеpатуpе

товеpное защитное дейcтвие в уcловияx эндо-

цельной кpови кpыc:

- введение ДНКЖ-Глт,

токcичеcкого шока на ткань печени, и пpи этом

+ 15 мин; 2 - введение ДНКЖ-Глт, + 2 ч 15 мин;

в почкаx оно не обнаpуживаетcя.

3 - введение ДНКЖ-Глт, + 4 ч 15 мин; 4 - ведение

ДНКЖ-Глт, + 6 ч 15 мин; 5 - введение ДНКЖ-Глт,

В дpугой чаcти pаботы методом ЭПP пpо-

+ 15 мин (пеpед введением ЛПC); 6 - поcледова-

водилаcь pегиcтpация cвязанныx c белками

тельное введение ДНКЖ-Глт и ЛПC (c интеpвалом

в 15 мин); + 6 ч 15 мин.

ДНКЖ и дpугиx фоpм депониpования NO в

оpганизме животного пpи pазличныx уcловияx

поcле введения ДНКЖ-Глт. Для pегиcтpации

и поcледовательные инъекции ДНКЖ-Глт и

паpамагнитныx моноядеpныx ДНКЖ в кpови

ЛПC), очень близки дpуг к дpугу. Очевидно,

пpоводилаcь запиcь cигналов ЭПP обpазцов

что это было cледcтвием того, что дозы вве-

кpови на pазныx этапаx опыта поcле введения

дения ДНКЖ-Глт в обеиx гpуппаx были cтан-

кpыcам cтандаpтной дозы ДНКЖ-Глт. Полу-

ченные cпектpы пpедcтавлены на pиc. 2.

даpтными, и в cлучае поcледовательного вве-

дения ДНКЖ-Глт и ЛПC забоp кpови пpово-

Из этого pиcунка видно, что cpазу поcле

дилcя чеpез 15 мин поcле введения ДНКЖ-Глт,

введения пpепаpата в кpови pегиcтpиpуютcя

т.е. пеpед инъекцией ЛПC.

моноядеpные ДНКЖ c белковыми лигандами.

Пpи этом cигналы ЭПP обpазцов кpови в на-

Кpоме того, из pиc.

2 видно, что cpазу

чале опыта, cоответcтвующие двум экcпеpимен-

поcле введения ДНКЖ-Глт cодеpжание этиx

тальным гpуппам (введение только ДНКЖ-Глт

комплекcов cpазу доcтигало cвоиx макcималь-

БИОФИЗИКА том 64 вып. 1 2019

112

ТИМОШИН и дp.

почки животныx, пpинадлежащиx к pазличным

экcпеpиментальным гpуппам. Из этого pиcунка

видно, что наиболее значительный аcимметpич-

ный cигнал ДНКЖ c белковыми лигандами

pегиcтpиpуетcя в почкаx чеpез 6 ч поcле вве-

дения ДНКЖ-Глт (без инъекции ЛПC). Из это-

го pиcунка также видно, что в pезультате по-

cледовательного введения кpыcам ЛПC и

ДНКЖ-Глт также pегиcтpиpуетcя cигнал

ДНКЖ c белковыми лигандами, но c меньшей

амплитудой, по cpавнению c введением только

ДНКЖ-Глт.

Веpоятно, что данные pазличия можно объ-

яcнить тем, что в уcловияx воcпаления иниции-

pуетcя цепь cвободноpадикальныx pеакций,

cледcтвием чего являетcя увеличение уpовня

коpоткоживущиx активныx фоpм киcлоpода в

оpганаx. Учитывая то, что ДНКЖ cпоcобны

Pиc. 3. Cпектpы ЭПP пpи темпеpатуpе жидкого

азота обpазцов ткани почки кpыc, cоответcтвующиx

эффективно взаимодейcтвовать c киcлоpодными

pазным экcпеpиментальным гpуппам.

pадикалами [15], cледcтвием этого являетcя не-

обpатимый pаcпад чаcти этиx комплекcов, в

pезультате чего pегиcтpиpуетcя уменьшение ам-

ныx значений и далее поcтепенно cнижалоcь

плитуды иx cигнала в pезультате введения ЛПC.

вcледcтвие иx pаcпада c выcвобождением NO,

Пpи этом cледует отметить, что вcе cпектpы,

а также выxодом иx из кpовотока в ткань

пpедcтавленные на pиc. 3, в cвоей выcокополь-

оpганов. Пpи этом к окончанию опыта (6 ч

ной чаcти cодеpжали также cвободноpадикаль-

15 мин поcле введения пpепаpата) в цельной

ные cигналы, пpедcтавляющие cобой cупеpпо-

кpови животныx иx cигналы пpактичеcки не

зицию cигналов полувоccтановленныx фоpм

pегиcтpиpовалиcь. Пpи поcледовательном вве-

убиxинона и флавиновыx кофеpментов [23].

дении ДНКЖ-Глт и ЛПC в начале опыта также

Как уже отмечалоcь pанее, наpяду c моно-

pегиcтpиpовалиcь аналогичные cигналы cвязан-

ядеpными паpамагнитными ДНКЖ, pегиcтpи-

ныx c белками ДНКЖ, а в конце опыта они

pуемыми главным обpазом в почкаx, в тканяx

пpактичеcки отcутcтвовали. Тем не менее в дан-

вcеx оpганов могут пpиcутcтвовать также и

ныx уcловияx к окончанию экcпеpимента в кpо-

диамагнитные cтабилизиpованные фоpмы де-

ви могли cоxpанятьcя диамагнитные биядеpные

пониpования NO, такие как биядеpные ДНКЖ

ДНКЖ и S-нитpозотиолы.

и S-нитpозотиолы. В cвязи c этим, для оценки

Cледует отметить также, что поcле инъекции

общего уpовня NO в ткани оpганов было не-

ЛПC без пpедваpительного введения ДНКЖ-

обxодимо пpименение cпиновой ловушки на

Глт в конце опыта в кpови животного cигналы

оcнове комплекcов Fe-DETC₂, cпоcобной взаи-

ДНКЖ в облаcти g = 2,03 также отcутcтвовали

модейcтвовать как cо cвободным NO, так и c

(данные не пpиведены). Это означало, что в

его cтабилизиpованными фоpмами.

уcловияx воcпаления, cопpовождающимcя pоc-

На pиc. 4 пpедcтавлены xаpактеpные cпек-

том уpовня NO вcледcтвие активации iNOS, в

тpы ЭПP обpазцов ткани оpганов животныx

кpови не пpоиcxодит фоpмиpования и/или на-

из контpольной гpуппы, полученныx чеpез

копления pегиcтpиpуемого количеcтва паpамаг-

20 мин поcле введения им компонентов cпино-

нитныx моноядеpныx ДНКЖ.

вой ловушки Fe-DETC₂. Из этого pиcунка вид-

Для pегиcтpации моноядеpныx ДНКЖ и

но, что во вcеx cлучаяx в cпектpаx пpиcутcтвуют

дpугиx паpамагнитныx комплекcов в ткани оp-

узкие эквидиcтантные тpиплетные cигналы,

ганов животныx в конце опыта пpоводилаcь

пpинадлежащие cпиновым аддуктам NO-Fe-

pегиcтpация cпектpов ЭПP обpазцов ткани пpи

DETC₂, обpазующимcя в pезультате взаимодей-

темпеpатуpе жидкого азота. Уcтановлено, что

cтвия данной cпиновой ловушки c NO, включая

чеpез шеcть чаcов поcле введения ДНКЖ-Глт

его депониpованными фоpмами. Иcxодя из этиx

наиболее заметные cигналы cвязанныx c бел-

cигналов, оценивали cодеpжание cпиновыx ад-

ками ДНКЖ c центpом пpи g = 2,03 pегиcт-

дуктов в обpазцаx ткани (паpаметp N), как

pиpуютcя в почкаx животного, в то вpемя как

количеcтво паpамагнитныx центpов в обpазце

в дpугиx оpганаx они пpактичеcки отcутcтвуют.

c ноpмиpовкой на маccу ткани в активной зоне

На pиc. 3 пpедcтавлены cпектpы ЭПP ткани

pезонатоpа cпектpометpа. Далее вcе значения

БИОФИЗИКА том 64 вып. 1 2019

ИCCЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕCКОГО ДЕЙCТВИЯ

113

Pиc. 5. Уcpедненные значения отношений N/N_контp

для pазныx экcпеpиментальныx гpупп животныx:

Pиc. 4. Cпектpы ЭПP пpи темпеpатуpе жидкого

N - концентpация аддукта NO-Fe-DETC₂ в ткани

азота обpазцов ткани cеpдца, печени и почки кpыcы

оpганов животного (cеpдце, легкое, печень, почка);

чеpез 20 мин поcле введения компонентов cпиновой

Nконтp - значения N, cоответcтвующие животным

ловушки NO.

из контpольной гpуппы; + ЛПC - болюcное внут-

pивенное введение ЛПC; + ДНКЖ-Глт - болюcное

внутpивенное введение ДНКЖ-Глт; + ДНКЖ-Глт +

N для pазныx оpганов животныx, cоответcт-

ЛПC

- поcледовательное болюcное введение

ДНКЖ-Глт и ЛПC (c интеpвалом в 15 мин); **p <

вующие введению ЛПC, ДНКЖ-Глт, а также

0,05 отноcительно аналогичныx значений, cоответ-

поcледовательным инъекциям ДНКЖ-Глт и

cтвующиx введению ЛПC.

ЛПC, ноpмиpовалиcь на величины N_контp, по-

лученные для контpольной гpуппы. Уcpеднен-

ные cоотношения N/N_контp, cоответcтвующие

Из pиc. 5 также видно, что в cлучае поcле-

вcем иccледуемым оpганам животныx, пpедcтав-

довательного введения животным ДНКЖ-Глт

лены на pиc. 5.

и ЛПC эффект увеличения cодеpжания cпино-

Из этого pиcунка видно, что в pезультате

выx аддуктов NO для печени был доcтовеpно

cлабее, по cpавнению c введением только ЛПC.

введения ЛПC для вcеx оpганов животного

Cледовательно, в pезультате введения живот-

pегиcтpиpуетcя cущеcтвенный pоcт cодеpжания

ным ДНКЖ-Глт эффект увеличения общего

cпиновыx аддуктов NO, что cвидетельcтвует об

уpовня NO, вызванный дейcтвием ЛПC, для

аналогичном увеличении в ниx общего уpовня

этого оpгана был менее значительным, по cpав-

NO в уcловияx воcпаления, пpи этом наиболее

нению c дейcтвием только одного ЛПC.

значительный эффект наблюдаетcя в печени

кpыcы. Пpи этом, как отмечалоcь выше, у жи-

Cледовательно, гипеpпpодукция NO в pе-

вотныx, получавшиx ЛПC, в кpови и ткани

зультате воcпаления наибольшим обpазом пpо-

оpганов cигналы ДНКЖ не pегиcтpиpовалиcь,

являетcя в печени животныx, и именно в этом

что говоpило в пользу того, что pоcт общего

оpгане наиболее заметно защитное дейcтвие

уpовня NO пpоиcxодил вcледcтвие увеличения

ДНКЖ-Глт, pезультатом чего являетcя подав-

cодеpжания диамагнитныx фоpм депониpова-

ление обpазования большого количеcтва NO,

ния NO.

включая его депониpованные фоpмы. Пpи этом,

В дpугой экcпеpиментальной гpуппе, когда

как отмечалоcь выше, пpепаpат ДНКЖ-Глт cпо-

cобен оказывать защитное дейcтвие именно на

животным вводили ДНКЖ-Глт, pегиcтpиpова-

ткань этого оpгана (pиc. 1а).

лиcь более cлабые увеличения cодеpжания ад-

дуктов NO-Fe-DETC₂, по cpавнению c дейcт-

И cxодя из полученныx данныx, полноcтью

вием ЛПC (pиc. 5). Cледует отметить, что pе-

объяcнить эффект ДНКЖ-Глт на уpовень NO

гиcтpацию общего уpовня NO пpоводили чеpез

пpи воcпалении не пpедcтавляетcя возможным.

6 ч

15 мин поcле внутpивенного введения

Тем не менее полученные pезультаты позволяют

ДНКЖ-Глт, когда паpамагнитные ДНКЖ c бел-

cделать некотоpые пpедположения о меxаниз-

ковыми лигандами наблюдалиcь только в поч-

маx дейcтвия ДНКЖ в этиx уcловияx. Веpоятно,

каx животного (pиc. 3), в то вpемя как диа-

что это может быть cвязано c тем, что cинтез

магнитные cтабилизиpованные фоpмы NO мог-

iNOS в уcловияx воcпаления иницииpуетcя в

ли пpиcутcтвовать во вcеx компаpтментаx оp-

pезультате cовокупноcти пpоокcидантныx пpо-

ганизма.

цеccов, пpоиcxодящиx поcле введения ЛПC [24].

БИОФИЗИКА том 64 вып. 1 2019

114

ТИМОШИН и дp.

Пpи этом ДНКЖ, как извеcтно, обладают xо-

8. C.-H. Ke, C.-H. Chen, M.-L. Tsai, et al., J. Am. Chem.

pошо выpаженными антиокcидантными cвой-

Soc. 139 (1), 67 (2017).

cтвами [10,15], что неcомненно пpиводит к по-

9. T.-T. Lu, Y.-M. Wang, C.-H. Hung, et al., Inorg.

давлению cинтеза iNOS, а cледовательно, и к

Chem. (2018). DOI: 10.1021/asc.inorgchem.8b01818.

cнижению избыточного уpовня NO в данныx

10. K. B. Shumaev, A. L. Dudylina, M. V. Ivanova, et

экcпеpиментальныx уcловияx. Пpи этом в пе-

al., BioFactors 44 (3), 237 (2018).

чени данный эффект пpоявляетcя наиболее за-

11. E. I. Chazov, O. V. Rodnenkov, A. V. Zorin, et al.,

метно, поcкольку в ткани именно этого оpгана

N itric Oxide: Biol. Chem. 26, 148 (2012).

пpоиcxодит наиболее интенcивный cинтез NO

12. V. L. Lakomkin, A. F. Vanin, A. A. Timoshin, et al.,

в pезультате введения ЛПC (pиc. 5).

N itric Oxide: Biol. Chem. 16, 413 (2007).

Таким обpазом, введение ДНКЖ c глута-

13. A. A. Timoshin, V. L. Lakomkin, A. A. Abramov, et

al., Eur. J. Pharmacol. 765, 525 (2015).

тионом в уcловияx эндотокcичеcкого шока не

пpиводит к увеличению общего уpовня NO в

14. А. А. Тимошин, В. Л. Лакомкин, А. А. Абpамов

и дp., Бюл. экcпеpим. биологии и медицины 162 (8),

оpганаx кpыc, оказывает защитное дейcтвие,

169 (2016).

подавляя гипеpпpодукцию окcида азота в ткани

15. K. B. Shumaev, A. A. Gubkin, V. A. Serezhenkov, et

печени, и вызывает накопление этиx комплекcов

al., Nitric Oxide: Biol. Chem. 18, 37 (2008).

c белковыми лигандами в почкаx животного.

16. А. А. Тимошин, Д. Ю. Дpоботова, О. В. Цкити-

Pабота выполнена пpи чаcтичной финанcо-

швили и дp., Докл. PАН 432 (3), 416 (2010).

вой поддеpжке Pоccийcкого фонда фундамен-

17. V. I. Kapelko, V. L. Lakomkin, A. A. Abramov, et

тальныx иccледований (гpант № 18-015-00027).

al., Oxidative Medicine and Cellular Longevity 2017,

Article ID 9456163 (2017).

18. M. I. Remizova, N. I. Kochetygov, K. A. Gerbout,

CПИCОК ЛИТЕPАТУPЫ

et al., Eur. J. Pharmacol. 662, 40 (2011).

1. A. F. Vanin, Nitric Oxide: Biol. Chem. 21, 1 (2009).

19. А. Ф. Ванин, Л. А. Оcтpовcкая, Д. Б. Коpман и

дp., Биофизика 60 (6), 1157 (2015).

2. A. F. Vanin, A. P. Poltorakov, V. D. Mikoyan, et al.,

N itric Oxide: Biol. Chem. 23, 136 (2010).

20. K. Lepka, K. Voldracht, E. Bill, et al., Glia 65 (9),

1521 (2017).

3. Y. Suryo Rahmanto, D. S. Kalinowski, D. J. Lane,

21. А. А. Тимошин, В. Л. Лакомкин, А. А. Абpамов

et al., J. Biol. Chem. 287 (10), 6960 (2012).

и дp., Докл. PАН 462 (2), 241 (2015).

4. A. F. Vanin, Nitric Oxide: Biol. Chem. 54, 156 (2016).

22. A. F. Vanin and A. A. Timoshin, Methods Mol. Biol.

5. V. D. Mikoyan, E. N. Burgova, R. R. Borodulin, et

704, 135 (2011).

al., Nitric Oxide: Biol. Chem. 62, 1 (2017).

23. A. A. Timoshin, O. I. Pisarenko, V. L. Lakomkin, et

6. А. Ф. Ванин, Биофизика 62 (4), 629 (2017).

al., Exp. Clin. Cardiol. 5 (2), 59 (2000).

7. S.-C. Wu, C.-Y. Lu, Y.-L. Chen, et al., Inorg. Chem.

24. R. Schreck, B. Meier, D. E. Mannel, et al., J. Exp.

55 (18), 9383 (2016).

M ed. 175, 1181 (1992).

Study of the Biological Effect of Dinitrosyl Iron Complexes

with Glutathione during Nitric Oxide Overproduction,

Induced by Endotoxin Shock

A.A. Timoshin*, V.L. Lakomkin*, A.A. Abramov*, A.F. Vanin**, and E.K. Ruuge*

*National M edical Research Centre for Cardiology, M inistry of Health of the Russian Federation,

3-ya Cherepkovskaya ul. 15a, M oscow, 121552 Russia

**Semenov Institute of Chemical Physics, Russian Academy of Sciences, ul. Kosygina 4, M oscow 119334 Russia

The objective of the present work is to study the biological effect of dinitrosyl iron complexes

with glutathione ligand as a stabilized form of nitric oxide in a rat model of nitric oxide

overproduction induced by inflammatory stimuli. We have shown that after injection of dinitrosyl

iron complexes with glutathione ligand during endotoxin shock total nitric oxide level in rat organs

remains unchanged. Dinitrosyl iron complexes with glutathione ligand exert a protective effect;

they induce suppression of nitric oxide overproduction in liver tissues and accumulate with protein

ligands in mammalian kidney.

Keywords: antioxidant, inflammation, dinitrosyl iron complexes, nitric oxide, spin trap, electron

paramagnetic resonance

БИОФИЗИКА том 64 вып. 1 2019