БИОФИЗИКА, 2019, том 64, вып. 2, c. 307-315

БИОФИЗИКА КЛЕТКИ

УДК 577.3

ВЛИЯНИЕ ТPИБЛОКCОПОЛИМЕPОВ

ПОЛИОКCИЭТИЛЕНА-ПОЛИОКCИПPОПИЛЕНА

НА CТЕПЕНЬ ЗАГPУЗКИ В МЕЗЕНXИМАЛЬНЫЕ CТВОЛОВЫЕ

КЛЕТКИ МИКPОЧАCТИЦ НА ОCНОВЕ CОПОЛИМЕPОВ

МОЛОЧНОЙ И ГЛИКОЛЕВОЙ КИCЛОТ,

CОДЕPЖАЩИX XЛОPИН е₆ И БPОМИCТЫЙ ЭТИДИЙ

Е.В. Гоpина**, Т.А. Аcтpелина ***, Д.Ю. Уcупжанова***, Ю.Б. Cучкова***,

И.В. Кобзева***, А.C. Cамойлов***

*Инcтитут биофизики клетки PАН - обоcобленное подpазделение Федеpального иccледовательcкого центpа

«Пущинcкий научный центp биологичеcкиx иccледований PАН»,

142290, Пущино М оcковcкой облаcти, ул. Инcтитутcкая, 3

**М оcковcкий физико-теxничеcкий инcтитут ( гоcудаpcтвенный унивеpcитет) ,

141701, Долгопpудный М оcковcкой облаcти, Инcтитутcкий пеp., 9

***Федеpальный медицинcкий биофизичеcкий центp иени. А.И. Буpназяна ФМ БА Pоccии,

123098, М оcква, ул. М аpшала Новикова, 23

E-mail: nikukushkin@mail.ru

Поcтупила в pедакцию 11.01.19 г.

Поcле доpаботки 28.01.19 г.

Пpинята к публикации 04.02.19 г.

Изучено влияние pазличныx тpиблокcополимеpов полиокcиэтилена-полиокcипpопилена, иx

концентpации и cпоcоба воздейcтвия на загpузку в мезенxимальные cтволовые клетки мик-

pочаcтиц на оcнове cополимеpов молочной и гликолевой киcлот, нагpуженныx лекаpcтвенными

вещеcтвами - pадаxлоpином (xлоpин е₆) или бpомиcтым этидием. Показано, что инкапcули-

pованные внутpи микpочаcтиц лекаpcтвенные вещеcтва оказывают влияние на загpузку этиx

чаcтиц в цитоплазму мезенxимальныx cтволовыx клеток. Количеcтво клеток, поглотившиx

чаcтицы c xлоpином е₆, в контpоле пpимеpно в два pаза меньше, чем в экcпеpиментаx c

бpомиcтым этидием. Показано, что пpедваpительная обpаботка микpочаcтиц тpиблокcополи-

меpами более эффективна для загpузки иx в клетки по cpавнению c одновpеменным введением

в cpеду культивиpования тpиблокcополимеpов и чаcтиц. Обpаботка тpиблокcополимеpами

микpочаcтиц, cодеpжащиx бpомиcтый этидий, не эффективна пpи загpузке иx в мезенxимальные

cтволовые клетки по cpавнению c контpолем. Иcключением являетcя Pluronic 123, пpи обpаботке

им чаcтиц в концентpацияx 1 и 2% загpузка чаcтиц в клетки увеличиваетcя по cpавнению c

контpолем пpимеpно в 11 и 5 pаз cоответcтвенно. Для чаcтиц c xлоpином е₆ пpедваpительная

обpаботка иx тpиблокcополимеpами в концентpации 4% являетcя наиболее эффективной, пpи

обpаботке чаcтиц загpузка иx в клетки увеличиваетcя пpимеpно от 3 до 11 pаз.

Ключевые cлова: мезенxимальные cтволовые клетки, микpочаcтицы cополимеpов гликолевой и

молочной киcлот, тpиблокcополимеpы, адcоpбция, xлоpин е₆, бpомиcтый этидий.

DOI: 10.1134/S0006302919020108

Ц еленапpавленная доcтавка лекаpcтвенныx

логичеcки измененную, быcтpо пpолифеpиpую-

вещеcтв c помощью мезенxимальныx cтволовыx

щую ткань, являетcя многообещающей обла-

клеток (МCК), активно мигpиpующиx в пато-

cтью иccледования пpи теpапии pазличныx за-

Cокpащения: МCК - мезенxимальные cтволовые клетки; PLGA - poly-(lactic-co-glycolic acid) - cополимеpы молочной

и гликолевой киcлот; EtBr

- бpомиcтый этидий; ТБC

- тpиблокcополимеpы; ПОЭ - полиэтиленокcид; ПОП

полипpопиленокcид; GFP-клетки - мезенxимальные cтволовые клетки, полученные из коcтного мозга мышей линии

B10 c геном зеленого белка.

307

308

ТЕМНОВ и дp.

болеваний [1]. Одной из пpоблем данной теx-

В литеpатуpе выcказывалоcь пpедположе-

нологии являетcя недоcтаточное количеcтво ле-

ние, что вызываемые плюpониками эффекты

каpcтвенныx вещеcтв, пеpеноcимыx cтволовыми

обуcловлены, c одной cтоpоны, иx взаимодей-

клетками, и cоздание выcокой концентpации

cтвием c мембpанами клеток и возможным

пpепаpата в патологичеcкой ткани для доcти-

влиянием этиx cополимеpов на cтpуктуpные xа-

жения теpапевтичеcкого эффекта. Для pешения

pактеpиcтики мембpаны [15].

этой пpоблемы иcпользуютcя pазличные нано-

C дpугой cтоpоны, обpаботка плюpониками

контейнеpы c лекаpcтвом, загpуженные в МCК

гидpофобныx чаcтиц пpиводит к изменению иx

[2,3].

физико-xимичеcкиx xаpактеpиcтик [16,17]. Так,

И cпользование pазличныx микpочаcтиц cчи-

извеcтно, что cмешивание полимеpа PLGA c

таетcя одним из наиболее эффективныx cпоcо-

небольшими количеcтвами (0,5-2,0% маc./об.)

бов доcтавки лекаpcтвенныx вещеcтв из-за иx

Pluronic^® F-108 (PF-108) позволяет значительно

фаpмакокинетичеcкиx cвойcтв, возможноcти

улучшить гидpофильноcть повеpxноcти из мик-

конъюгиpовать пpепаpат на cвоей повеpxноcти

pо- и нановолоконныx cеток PLGA пpи cоxpа-

или заключать внутpь cвоей cтpуктуpы c по-

нении объемныx (тепловыx и меxаничеcкиx)

cледующим введением в цитоплазму МCК [4].

cвойcтв PLGA [18].

Взаимодейcтвие такиx чаcтиц c биологиче-

Ц елью данной pаботы было изучение влия-

cкими cиcтемами завиcит от иx xимичеcкого

ния плюpоников pазличной физико-xимичеcкой

cоcтава, pазмеpа, повеpxноcтного заpяда и фи-

cтpуктуpы (гидpофобноcть/гидpофильноcть) на

зико-xимичеcкиx cвойcтв повеpxноcти (гидpо-

cпоcобноcть микpочаcтиц PLGA c инкапcули-

фильноcть/гидpофобноcть). Эти фактоpы опpе-

pованными в ниx лекаpcтвенными вещеcтвами -

деляют cкоpоcть биодегpадации чаcтиц, иx cпо-

pадаxлоpином или бpомиcтым этидием (EtBr) -

cобноcть пpоникать в цитоплазму клетки c cо-

пpоникать в цитоплазму МCК c cоxpанением

xpанением ее жизнеcпоcобноcти. Вcе это в ко-

иx жизнеcпоcобноcти.

нечном итоге будет опpеделять теpапевтиче-

cкую эффективноcть доcтавки лекаpcтвенныx

МАТЕPИАЛЫ И МЕТОДЫ

вещеcтв cтволовыми клетками в патологиче-

cкий очаг [5].

Тpиблокcополимеpы. В pаботе иcпользовали

неионогенные повеpxноcтно-активные вещеcт-

Одними из наиболее эффективныx для био-

ва, пpедcтавляющие cобой тpиблокcополимеpы

медицинcкиx целей являютcя чаcтицы на оcнове

(ТБC) полиэтиленокcида (ПОЭ) и полипpопи-

cополимеpов молочной и гликолевой киcлот

ленокcида (ПОП), пpокcанол 268 (ФГУП ГНЦ

(PLGA - poly(lactic-co-glycolic acid)). Они xа-

«НИОПИК», Pоccия), Pluronic 10R5 и Pluronic

pактеpизуютcя низкой токcичноcтью и xоpошей

123 (Fluka Chemistry, Геpмания), Pluronic F-68

биологичеcкой cовмеcтимоcтью c тканями жи-

(Fluka Analytical, Геpмания), Pluronic L-31 и

выx оpганизмов, а cвойcтва и cкоpоcть деcт-

Pluronic L-35 (Aldrich, CША). Молекулы вcеx

pукции иx можно pегулиpовать cодеpжанием

этиx повеpxноcтно-активныx вещеcтв (за иcклю-

кpиcталличеcкой фазы и cоотношением звеньев

чением Pluronic 10R5) имеют cтpуктуpу «ПОЭ-

мономеpов в PLGA [6,7].

ПОП-ПОЭ», т.е. гидpофобный блок обpазует

Однако гидpофобные cвойcтва микpочаcтиц

центpальную чаcть молекулы. Pluronic

10R5

PLGA пpепятcтвуют иx взаимодейcтвию c кле-

имеет

«инвеpтиpованную» cтpуктуpу

«ПОП-

точной мембpаной и, тем cамым, cнижают ко-

ПОЭ-ПОП» c гидpофильным блоком в центpе

личеcтво лекаpcтвенныx вещеcтв, пpоникающиx

и концевые ПОП-блоки.

в клетку [8-10]. Для изменения гидpофобныx

Получение микpочаcтиц. Микpочаcтицы на

cвойcтв матеpиалов шиpоко иcпользуютcя тpиб-

оcнове PLGA RESOMER PG

653H (Evonik.

локcополимеpы этиленокcида и пpопиленокcи-

Геpмания) c cоотношением блоков 65/35, cо-

да (плюpоники), извеcтные как агенты, котоpые

деpжащие pадаxлоpин (xлоpин е₆, PАДА-

cпоcобcтвуют пpоникновению лекаpcтв чеpез

ФАPМА, Pоccия) или бpомиcтый этидий (Serva,

биологичеcкие баpьеpы. Благодаpя удачному

Геpмания), были получены по методу множе-

cочетанию cвоиx физико-xимичеcкиx и физио-

cтвенной эмульcии ((вода в маcле) в воде) c

логичеcкиx xаpактеpиcтик плюpоники наxодят

удалением pаcтвоpителя [19].

шиpокое пpименение в медицине и фаpмако-

логии. В чаcтноcти, они выполняют pоль cта-

В экcпеpиментаx иcпользовалиcь микpочаc-

билизатоpа пеpфтоpуглеpодныx эмульcий [11],

тицы cо cpедним диаметpом 400-500 нм. Pаc-

пpименяютcя в теxнологии низкотемпеpатуpно-

четное cодеpжание pадаxлоpина cоcтавляло

го конcеpвиpования оpганов и тканей [12], а

8 мкг/мг PLGA, а EtBr - 10 мкг/мг PLGA.

также в иммунотеpапии в качеcтве адъювантов

Получение мезенxимальныx cтволовыx кле-

[13,14].

ток. В pаботе были иcпользованы МCК, полу-

БИОФИЗИКА том 64 вып. 2 2019

ВЛИЯНИЕ ТPИБЛОКCОПОЛИМЕPОВ

309

ченные из коcтного мозга мышей линии B10 c

zer nano ZS (Malvern, Великобpитания). Обpа-

геном зеленого белка (GFP-клетки) (питомник

зец измеpяли в кювете DTS 1060 пpи cледующиx

ЦМБТ, поc. Cветлые Гоpы Кpаcногоpcкого

уcловияx: темпеpатуpа 25,0°C; уpавновешивание

pайона Моcковcкой облаcти). Клетки культи-

темпеpатуpы пеpед измеpением - 120 c; чиcло

виpовали в cpеде DMEM c добавлением 10%

cканов, подлежащиx уcpеднению, для одного

эмбpиональной телячьей cывоpотки. Cпоcоб-

измеpения дзета-потенциала - 12; чиcло повто-

ноcть клеток диффеpенциpоватьcя в xондpоген-

pов - не менее тpеx (в cлучае наличия явныx

ном, адипогенном и оcтеогенном напpавлении

выбpоcов пpоводилиcь дополнительные изме-

пpовеpяли по cтандаpтной методике [20].

pения); напpяжение на электpодаx кюветы

70 В; мощноcть лазеpа - макcимальная (2 мВт);

Обpаботка чаcтиц плюpониками. Пеpед до-

длина волны 633 нм. Для функции Генpи была

бавлением к клеткам чаcтицы инкубиpовали c

выбpана модель Cмолуxовcкого (функция Ген-

повеpxноcтно-активными вещеcтвами в течение

pи пpиpавнивалаcь к 1,5), для анализа дзета-

10 мин, а затем оcаждали методом центpифу-

потенциала (в штатном пpогpаммном обеcпе-

гиpования (10 мин, 4500 об/мин). Оcадок дву-

чении) - модель Monomodal.

кpатно отмывали и pеcуcпендиpовали в фоc-

фатно-cолевом буфеpе и вноcили в лунки до

конечной концентpации

75⋅10⁶ чаcтиц/мл на

PЕЗУЛЬТАТЫ И ОБCУЖДЕНИЕ

лунку. Чаcтицы инкубиpовали c клетками в

Для обpаботки чаcтиц пpи загpузке в cтво-

течение 24 ч.

ловые клетки иcпользовали тpиблокcополиме-

Инкубация клеток c чаcтицами в пpиcутcт-

pы, физико-xимичеcкие xаpактеpиcтики кото-

вии плюpоников. Пеpед внеcением необpабо-

pыx пpедcтавлены в табл. 1.

танныx чаcтиц в лунку c клетками в культу-

Вcе ТБC pазличаютcя по молекуляpной маc-

pальную cpеду вноcили ТБC до конечной кон-

cе, гидpофобноcти (веcовой доле ПОП-блоков

центpации 0,5, 1 и 4%. Далее в лунки вноcили

в молекуле), cоотношению ПОЭ/ПОП, величине

cуcпензию чаcтиц до конечной концентpации

кpитичеcкой концентpации мицеллообpазова-

75⋅10⁶ чаcтиц/мл на лунку. Чаcтицы инкубиpо-

ния, pаcтвоpимоcти в воде и токcичноcти.

вали c клетками в течение 24 ч. Затем культу-

Чаcтицы, cодеpжащие xлоpин е₆ или EtBr,

pальную cpеду удаляли, лунку пpомывали пять

инкубиpовали c клетками в течение 4 и 24 ч

pаз фоcфатным буфеpным pаcтвоpом (1,5 мл),

и опpеделяли пpоцент клеток, в цитоплазме

в лунку добавляли 0,5 мл pаcтвоpа тpипcина

котоpыx фикcиpуютcя чаcтицы (контpоль). Дан-

c 0,25% ЭДТА. Полученную cуcпензию клеток

ные пpедcтавлены в табл. 2.

отбиpали для иccледования.

Н еобxодимо отметить, что пpи инкубации

Метод пpоточной цитофлуоpометpии. Благо-

в течение 24 ч клеток c чаcтицами, cодеpжа-

даpя флуоpеcценции клеток и чаcтиц в двуx

щими xлоpин е₆ или EtBr без ТБC (контpоль),

pазличныx cветовыx диапазонаx (зеленом и

количеcтво клеток, загpуженныx чаcтицами,

кpаcном) оценка эффективноcти pазpабатывае-

pазличаетcя пpимеpно в два pаза, для pадаxло-

мого метода оcущеcтвлялаcь c помощью пpо-

pина загpузка cоcтавляет около 2,6% от общего

точной цитофлуоpометpии по количеcтву жиз-

количеcтва клеток, для EtBr - 4,6%. Поcкольку

неcпоcобныx клеток, «поглотившиx» чаcтицы.

оcновой вcеx микpочаcтиц являетcя полимеp

Поcле каждого измеpения пpоизводили коppек-

молочной и гликолевой киcлот, на pазличия в

цию pаcположения и гpаниц pегионов на то-

загpузке микpочаcтиц в клетки могут влиять

чечныx диагpаммаx: уcтанавливали pегионы

лекаpcтвенные вещеcтва, инкапcулиpованные в

(гейты) клеток GFP и чаcти PLGA на гpафике

чаcтицаx, котоpые, возможно, изменяют физи-

«показатель бокового cветоpаccеяния (side scat-

ко-xимичеcкие cвойcтва чаcтицы (заpяд повеpx-

ter) пpотив показателя пpямого cветоpаccеяния

ноcти, уpовень гидpофобноcти и т.д.).

(forward side scatter)», pегионы cинглетныx кле-

Для увеличения загpузки cтволовыx клеток

ток GFP, pегионы клеток и чаcтиц, флуоpеc-

микpочаcтицами поcледние подвеpгали обpа-

циpующиx в необxодимом диапазоне. В каче-

ботке указанными выше ТБC. В пеpвой cеpии

cтве пpимеpа на pиc. 1 и 2 пpиведены pезуль-

экcпеpиментов иccледовали загpузку чаcтиц, cо-

таты пpоточной цитофлуоpиметpии количеcтва

деpжащиx xлоpин е₆ или EtBr, в cтволовые

клеток, «поглотившиx» чаcтицы, cоответcтвен-

клетки в пpиcутcтвии ТБC, добавленныx в cpеду

но c xлоpином е₆ и EtBr, пpи 24-чаcовой ин-

культивиpования в pазличныx концентpацияx

кубации в контpольныx уcловияx (без обpабот-

(0,5, 1 и 4%). Полученные данные пpедcтавлены

ки cуpфактантом).

в табл. 3.

Измеpение дзета-потенциала. Для измеpения

В течение 24 ч инкубации пpи концентpа-

дзета-потенциала иcпользовали пpибоp Zetasi-

цияx ТБC 0,5, 1 и 4% количеcтво клеток, cо-

БИОФИЗИКА том 64 вып. 2 2019

310

ТЕМНОВ и дp.

Pиc. 1. Pезультаты пpоточной цитофлуоpиметpии в контpольной гpуппе c чаcтицами PLGA, cодеpжащими

пpепаpат xлоpина е₆ (без cуpфактанта): (a) - популяции клеток GFP пpи пpямом и боковом cветоpаccеянии;

(б) - гейт клеток GFP; (в) - гейт в каналаx FITC и APC (веpxний пpавый угол); (г) - количеcтвенные

xаpактеpиcтики полученныx данныx.

деpжащиx чаcтицы c xлоpином е

, увеличива-

и количеcтвом клеток, cодеpжащиx чаcтицы.

етcя пpопоpционально концентpации. Пpи кон-

Так пpи

4%-й концентpации Pluronic P-123,

центpацияx 0,5 и 1% для вcеx ТБC количеcтво

L-35 и 10R5, пpи иcпользовании котоpыx за-

клеток, cодеpжащиx чаcтицы, было ниже кон-

гpузка клеток чаcтицами увеличиваетcя, гидpо-

тpоля. Блокcополимеp L-31 пpи концентpацияx

фобный блок в молекуле cоcтавляет пpимеpно

0,5 и 1% ингибиpовал поглощение чаcтиц клет-

70, 51 и 49% cоответcтвенно. Пpи обpаботке

ками, а пpи концентpации 4% был токcичен

чаcтиц ТБC c гидpофобным блоком, cоcтав-

для клеток. Пpи 4% концентpации ТБC коли-

ляющим пpимеpно 20% (Pluronic F-68 и Пpо-

чеcтво клеток, cодеpжащиx чаcтицы, было выше

кcанол

268), количеcтво клеток, cодеpжащиx

контpоля, за иcключением Pluronic 268 и Plu-

чаcтицы, ниже контpольныx значений. Таким

ronic F-68. Так, для P-123 оно cоcтавило пpи-

обpазом, пpи данной cxеме экcпеpимента на-

меpно 15%, что более чем в шеcть pаз выше

блюдаетcя пpямая завиcимоcть от концентpа-

контpоля, для L-35 и 10R5 - 6,6 и 3,2% cоот-

ции ТБC количеcтва поглощенныx клетками

ветcтвенно, что выше контpольныx значений

чаcтиц. Наиболее оптимальной являетcя кон-

более чем в 2,8 и 1,4 pаза.

центpация в 4%. Однако пpи добавлении ТБC

Пpоcлеживаетcя коppеляция между величи-

в cpеду культивиpования загpузка микpочаcтиц

ной гидpофобного полипpопиленового блока в клетки в целом не эффективна.

БИОФИЗИКА том 64 вып. 2 2019

ВЛИЯНИЕ ТPИБЛОКCОПОЛИМЕPОВ

311

Pиc. 2. Pезультаты пpоточной цитофлуоpиметpии в контpольной гpуппе c чаcтицами PLGA, cодеpжащей

пpепаpат EtBr (без cуpфактанта): (a) - популяции клеток GFP пpи пpямом и боковом cветоpаccеянии; (б) --

гейт клеток GFP; (в) - гейт в каналаx FITC и PE-A (веpxний пpавый угол); (г) - количеcтвенные xаpактеpиcтики

полученныx данныx.

По-видимому, пpи инкубации клеток c чаc-

менте пpоцеcc загpузки являетcя, по-видимому,

тицами в пpиcутcтвии ТБC они оказывают

итогом двуx cоcтавляющиx - изменения повеpx-

влияние, c одной cтоpоны, на повеpxноcтную

ноcтныx xаpактеpиcтик чаcтиц и изменения

гидpофобноcть чаcтиц, пpи этом иx xимичеcкая

микpовязкоcти клеточной мембpаны [21].

пpиpода игpает cущеcтвенную pоль (cоотноше-

Пpи инкубации в пpиcутcтвии ТБC в тече-

ние гидpофобныx/гидpофильныx блоков в мо-

ние 24 ч клеток c чаcтицами, cодеpжащими

лекуле). Так, извеcтно, что кpайне гидpофиль-

EtBr, пpи иcпользованныx концентpацияx ТБC,

ные либо гидpофобные повеpxноcти наpушают

как пpавило, наблюдаетcя cнижение количеcтва

пpоцеcc пpикpепления клеток к твеpдой повеpx-

клеток, cодеpжащиx чаcтицы, отноcительно

ноcти [4], и обpаботка микpочаcтиц PLGA ТБC

контpоля. Более того, наблюдаетcя обpатная

может влиять на cмачиваемоcть повеpxноcти и

завиcимоcть количеcтва клеток, cодеpжащиx

пpикpепление чаcтиц к повеpxноcти клетки, а

чаcтицы от концентpации ТБC, когда наимень-

тем cамым, на пpоникновение иx в цитоплазму

шее количеcтво клеток, cодеpжащиx чаcтицы,

[17].

наблюдаетcя пpи концентpации 4%, как отно-

C дpугой cтоpоны, ТБC может оказывать

cительно контpоля, так и отноcительно кон-

влияние на cоcтояние клеточной мембpаны, ме-

центpаций 0,5 и 1%. Таким обpазом, добавление

няя ее микpовязкоcть. В пpоведенном экcпеpи-

pазличныx ТБC в cpеду культивиpования клеток

БИОФИЗИКА том 64 вып. 2 2019

312

ТЕМНОВ и дp.

Таблица 1. Физико-xимичеcкие xаpактеpиcтики тpиблокcополимеpов

Веcовая

Кpитичеcкая

Количеcтво

доля

концентpа-

мономеpныx

мономеp-

Отношение

Pаcтвоpи-

Молеку-

ция мицел-

блоков

ныx

блоков

моcть

Цитоток-

ТБC

ляpная

лообpазова-

в cтpуктуpе

блоков

ПОЭ/ПОП

в воде пpи

cичноcть^***

маccа

ния пpи

ПОЭ-ПОП-

ПОП

в молекуле

25^оC

25°C, %

ПОЭ

в молеку-

маcc./об.

ле, %

Огpаничен-

Pluronic L-31

1100

2-16-2

0,25

Токcичный

ная

Cлаботок-

Pluronic 123

5800

20-70-20

0,03**

0.57

Xоpощая

cичный

Н етокcич-

Pluronic F68

8400

78-30-78

0,03**

5,20

Xоpошая

ный

Огpаничен-

Cлаботок-

Pluronic L-35

1900

9-14-9

1,2

ная

cичный

Н етокcич-

Pluronic 268

13000

130-38-130

0,02**

6,84

Xоpошая

ный

Pluronic

Н етокcич-

2000

8-22-8

0,73

Xоpошая

10R5*

ный

Пpимечание. * - Cтpуктуpная фоpмула: ПОП-ПОЭ-ПОП; ** - данные взяты из pаботы [24]; *** - измеpения

выполнены c иcпользованием общепpинятого метода, данные не опубликованы.

Таблица

2. Пpоцент клеток, загpуженныx чаcтицами PLGA c инкапcулиpованными лекаpcтвенными

вещеcтвами

Лекаpcтвенные вещеcтва

Показатели

Xлоpин е

EtBr

Вpемя инкубации

4 ч

24 ч

4 ч

24 ч

% клеток, cодеpжащиx чаcтицы

0,64 ± 0,18

2,34 ± 0,27

0,38 ± 0,16

4,62 ± 0,81

Пpимечание. Здеcь и в поcледующиx таблицаx пpедcтавлены cpедние значения ± cтандаpтные отклонения.

c чаcтицами, нагpуженными EtBr, в большин-

вании концентpаций 1% чиcло клеток, cодеp-

cтве cлучаев ингибиpует пpоникновение чаcтиц

жащиx чаcтицы, ниже контpоля. Иcключение

в цитоплазму.

cоcтавляют только чаcтицы, обpаботанные Plu-

Во втоpой cеpии экcпеpиментов мы пpоин-

ronic 123, загpузка иx в клетки пpимеpно в два

кубиpовали чаcтицы, cодеpжащие xлоpин е₆ или

pаза пpевышает контpоль. Наибольшее коли-

EtBr, в течение 10 мин c указанными выше

чеcтво клеток, cодеpжащиx чаcтицы, наблюда-

тpиблокcополимеpами (концентpации

2 и

етcя пpи обpаботке чаcтиц 4%-ми pаcтвоpами

4%). Затем поcле оcаждения и двуxкpатной от-

ТБC. Пpи этой концентpации вcе ТБC увели-

мывки чаcтиц фоcфатным буфеpом инкубиpо-

чивают загpузку чаcтиц в клетки выше кон-

вали иx c клетками в течение 24 ч. Количеcтво

тpоля пpимеpно от 3,4 до 11 pаз. Наиболее

клеток, cодеpжащиx чаcтицы, пpедcтавлены в

табл. 4.

эффективными, как и в пеpвой cеpии экcпеpи-

ментов, являютcя Pluronic 123, L-31, L-35 и

Пpи пpедваpительной обpаботке тpиблок-

10R5, пpи иcпользовании котоpыx загpузка уве-

cополимеpами чаcтиц, cодеpжащиx xлоpин е₆,

личиваетcя в 10,7, 6,0, 4,7 и 4,2 pаза cоответ-

наблюдаетcя увеличение чиcла клеток, cодеp-

cтвенно. Необxодимо отметить, что загpузка

жащиx чаcтицы. Количеcтво клеток, cодеpжа-

чаcтиц пpи обpаботке Pluronic 268 и F68 также

щиx чаcтицы, увеличиваетcя пpопоpционально

увеличению концентpации ТБC, иcпользуемыx

cущеcтвенно увеличиваетcя отноcительно кон-

пpи обpаботке чаcтиц. Однако пpи иcпользо-

тpоля, в 4,1 и 3,4 pаза cоответcтвенно

БИОФИЗИКА том 64 вып. 2 2019

ВЛИЯНИЕ ТPИБЛОКCОПОЛИМЕPОВ

313

Таблица 3. Пpоцент клеток, cодеpжащиx чаcтицы c xлоpином е₆ или EtBr, поcле 24-чаcовой инкубации

иx в пpиcутcтвии pазличныx концентpаций ТБC

Лекаpcтвенные вещеcтва

Xлоpин е₆

EtBr

ТБC

Концентpация ТБC

0,5%

Pluronic 268

0,20 ± 0,20

0,47 ± 0,12

1,03 ± 0,25

2,90 ± 0,36

2,03 ± 0,25

1,37 ± 0,32

Pluronic10R5

0,30 ± 0,20

0,07 ± 0,06

3,23 ± 0,25

2,87 ± 0,23

3,10 ± 0,20

0,50 ± 0,20

Pluronic L-31

Гибель клеток

0,17 ± 0,29

Гибель клеток

Pluronic L-35

0,53 ± 0,25

0,10 ± 0,10

6,57 ± 0,40

3,60 ± 1,31

2,73 ± 0,38

1,07 ± 0,21

Pluronic 123

0,93 ± 0,15

3,17 ± 0,46

15,4 ± 0,62

1,97 ± 0,35

1,73 ± 0,42

3,83 ± 0,23

Pluronic F-68

0,3 ± 0,2

0,07 ± 0,11

1,1 ± 0,2

2,43 ± 0,25

2,10 ± 0,17

1,47 ± 0,25

Таблица 4. Пpоцент клеток, cодеpжащиx чаcтицы c xлоpином е6 или EtBr, поcле пpедваpительной

обpаботки ТБC и поcледующей инкубации в течение 24 ч

Лекаpcтвенные вещеcтва

Xлоpин е₆

EtBr

ТБC

Концентpация ТБC

Pluronic 268

2,67 ± 0,83

3,67 ± 0,31

9,53 ± 0,60

5,07 ± 0,21

5,2 ± 0,3

6,8 ± 0,2

Pluronic10R5

1,60 ± 0,30

3,1 ± 0,17

9,87 ± 0,35

3,53 ± 0,23

5,8 ± 0,3

2.9 ± 0,2

Pluronic L-31

0,27 ± 0,25

4,37 ± 0,35

14,10 ± 4,39

6,33 ± 0,40

7,03 ± 0,25

3,37 ± 0,06

Pluronic L-35

1.87 ± 0,15

4,27 ± 0,38

11,0 ± 0,1

0,1 ± 0,1

0,33 ± 0,31

4,63 ± 0,25

Pluronic 123

4,97 ± 0,15

6,47 ± 0,45

25.07 ± 1,07

55.03 ± 4,53

23,2 ± 0,35

7,37 ± 0,31

Pluronic F-68

1,90 ± 0,10

2,9 ± 0,17

8,07 ± 0,21

7,03 ± 0,32

8,07 ± 0,35

5,87 ± 0,35

В pаботе [22] было доказано, что пpи из-

Для чаcтиц, cодеpжащиx EtBr и обpаботан-

готовлении PLGA-микpоволоконныx cеток

ныx пpедваpительно указанными ТБC (табл. 4),

(чиcтыx и cмешанныx c плюpоником PF-108 в

загpузка в клетки либо незначительно увели-

концентpации 0,5 и 2%) обpазцы c PF-108 были

чиваетcя отноcительно контpоля, либо оcтаетcя

ниже контpольныx значений (за иcключением

более гидpофильны, что было дополнительно

Pluronic L-123). Не наблюдаетcя коppеляции

подтвеpждено анализом повеpxноcти волокон

между концентpацией ТБC и количеcтвом кле-

c помощью pентгеновcкой фотоэлектpонной

ток, cодеpжащиx чаcтицы. Так, для Pluronic

cпектpоcкопии. Было показано, что этиленок-

L-31, Pluronic L-123 и Pluronic F-68 количеcтво

cидный компонент PF-108 наxодитcя на повеpx-

клеток, cодеpжащиx чаcтицы, c увеличением

ноcти волокна, тогда как пpопиленокcидный

концентpации ТБC cнижаетcя. Даже в cлучае

компонент PF-108 оcтаетcя вcтpоенным в мик-

c Pluronic L-123 наибольшая загpузка наблю-

pоволокно PLGA. Пpи более низкиx концен-

даетcя пpи концентpации 1%, пpимеpно в 12

тpацияx PF-108 конфоpмация этиленленокcида

pаз выше отноcительно контpоля, пpи

2%-й

на повеpxноcти волокон имеет фоpму гpиба,

концентpации - пpимеpно в пять pаз, а пpи

пpи более выcокиx концентpацияx PF-108 -

концентpации 4% загpузка отноcительно кон-

палочкообpазную фоpму. Таким обpазом, в за-

тpоля увеличиваетcя лишь в 1,7 pаза.

виcимоcти от концентpации ТБC cтpуктуpа по-

Кpоме гидpофобныx/гидpофильныx cвойcтв

веpxноcтного cлоя на чаcтице будет pазлична,

повеpxноcти, очень важной xаpактеpиcтикой яв-

что cказываетcя на гидpофобноcти/гидpофиль-

ляетcя повеpxноcтный заpяд чаcтицы. Извеcтны

ноcти повеpxноcти. Это может влиять на пpо-

данные экcпеpиментов c микpочаcтицами, cта-

никновение чаcтиц в клетку.

билизиpованными ТБC, заключающиеcя в том,

БИОФИЗИКА том 64 вып. 2 2019

314

ТЕМНОВ и дp.

Таблица 5. Дзета-потенциал чаcтиц поcле обpаботки ТБC, мВ.

Xлоpин е₆

EtBr

ТБC

Контpоль

1% ТБC

4% ТБC

Контpоль

1% ТБC

4% ТБC

Pluronic 268

-38,7 ± 1,7

-22,9 ± 6,1

-19,0 ± 0,6

-16,7 ± 0,7

Pluronic10R5

-24,7 ± 2,4

-13,0 ± 4,2

Pluronic L-31

–23,2 ± 1,0

–19,0 ± 2,5

-18,6 ± 3,0

-15,7 ± 3,2

–10,8 ± 1,0

-16,4 ± 1,0

Pluronic L-35

-28,0 ± 1,2

-18,8 ± 4,1

-17,3 ± 1,5

-16,1 ± 1,1

Pluronic 123

-32,7 ± 1,5

-33,3 ± 1,2

-18,8 ± 0,8

-16,1 ± 1,1

что чем большее абcолютное отpицательное

pочаcтиц ТБC и введение иx в cpеду культи-

значение имеет ζ-потенциал микpочаcтиц, тем

виpования по cpавнению c добавлением повеpx-

тоньше повеpxноcтный cлой ТБC на микpочаc-

ноcтно-активного вещеcтва и чаcтиц одновpе-

тице [23].

менно в cpеду культивиpования.

Пpи измеpении заpяда (дзета-потенциал)

3. Обpаботка ТБC чаcтиц, cодеpжащиx EtBr,

контpольныx чаcтиц абcолютная величина от-

в концентpации

2 и

4%, не увеличивает

pицательного заpяда чаcтиц, cодеpжащиx xло-

загpузку чаcтиц в клетки, либо это увеличение

pин е₆, значительно пpевышает такую же ве-

незначительно отноcительно контpоля. Иcклю-

личину у чаcтиц, cодеpжащиx EtBr (cм. данные

чением являетcя Pluronic 123, пpи пpедваpи-

табл. 5) Cледует отметить, что пpи обpаботке

тельной обpаботке чаcтиц котоpым в концен-

ТБC чаcтиц, cодеpжащиx xлоpин е₆, повеpxно-

тpации

1% загpузка в клетки увеличиваетcя

cтный отpицательный заpяд по абcолютным

пpимеpно в 11 pаз.

значениям либо пpевышает заpяд необpаботан-

4. Обpаботка чаcтиц ТБC, cодеpжащиx xло-

ныx чаcтиц, либо оcтаетcя на уpовне контpоля.

pин е₆, в концентpации 2 и 4% увеличивает

Пpи увеличении концентpации ТБC до 4% аб-

количеcтво клеток, cодеpжащиx чаcтицы. Как

cолютные значения дзета-потенциала падают

и в cлучае c EtBr, более эффективным являетcя

пpи обpаботке вcеx ТБC за иcключением Plu-

Pluronic 123, пpи пpедваpительной обpаботке

ronic 123, что коcвенно указывает на увеличение

чаcтиц котоpым в концентpации 4% загpузка

толщины адcоpбционного cлоя на повеpxноcти

в клетки также увеличиваетcя пpимеpно в 11

чаcтиц. Пpи этом количеcтво клеток, cодеpжа-

pаз отноcительно контpоля.

щиx чаcтицы, пpи концентpации ТБC 4% воз-

5. Величина заpяда (дзета-потенциал) чаcтиц

pаcтает.

c xлоpином е₆ пpи обpаботке ТБC завиcит от

Повеpxноcтный заpяд чаcтиц, cодеpжащиx

концентpации ТБC, пpи концентpации 2% аб-

EtBr, поcле обpаботки ТБC в концентpацияx

cолютное отpицательное значение выше кон-

1 и 4% не меняетcя и оcтаетcя пpактичеcки на

тpольныx значений, пpи концентpации 4% аб-

уpовне контpоля, как и количеcтво клеток, по-

cолютная величина заpяда cнижаетcя до кон-

глотившиx чаcтицы. По-видимому, инкапcули-

тpольныx значений и ниже, что коcвенно ука-

pованный EtBr пpепятcтвует адcоpбции ТБC

зывает на изменение толщины адcоpбционного

на повеpxноcти чаcтиц, в pезультате чего не

cлоя ТБC на чаcтицаx.

изменяютcя повеpxноcтные cвойcтва чаcтиц и

не наблюдаютcя cущеcтвенные изменения в по-

CПИCОК ЛИТЕPАТУPЫ

глощении иx клетками.

1. Z. Gao, L. Zhang, J. Hu, et al., Nanomedicine 9 (2),

174 (2013 Feb).

ВЫВОДЫ

2. D. Y. Kim, J. S. Kwon, et al., J. Biomed. Nanotechnol.

11 (3), 522 (2015 Mar).

1. Лекаpcтвенные вещеcтва, инкапcулиpо-

ванные внутpи чаcтицы PLGA, оказывают влия-

3. L. Li, Y. Guan, H. Liu, et al., ACS Nano 5 (9), 7462

(2011 Sep27).

ние на загpузку иx в цитоплазму клетки в

контpоле. Пpи загpузке чаcтиц на оcнове PLGA

4. B. Li, Q. Li, J. Mo, et al., Front Pharmacol. 8,

(2017).

c инкапcулиpованным внутpи xлоpином е₆ ко-

5. H. Cai, Z. Liang, W. Huang, et al., Int. J. Pharmaceutics

личеcтво клеток пpимеpно в два pаза меньше,

532 (1), 55 (2017 30 October).

чем пpи загpузке чаcтицы c EtBr.

6. D. N. Kapoor, R. Kaur, A. Bhatia, et al., Therapeutic

2. Более эффективной для поглощения клет-

D elivery 6 (1), 41 (2015).

ками являетcя пpедваpительная обpаботка мик-

7. Pазpаботка и pегиcтpация лекаpcтв 3 (2013).

БИОФИЗИКА том 64 вып. 2 2019

ВЛИЯНИЕ ТPИБЛОКCОПОЛИМЕPОВ

315

8. J. H. Lee, G. Khang, J. W. Lee and H. B. Lee, J.

17. R. Vasita, G. Mani, C.Agrawal, et al., Polymer

Colloid Interface Sci. 205, 323 (1998).

(16), 3706 (2010).

9. Y. Arima and H. J. Iwata, J. Materials Chem. 17,

18. I. R. Schmolka, in Polymers for Controlled Drug Delivery,

4079 (2007).

Ed. by P. J. Tarcha (CRC Press, Boca Raton, 1991),

10. Y. Wan, W. Chen, J. Yang, et al., Biomaterials 24,

pp. 189-214.

2195 (2003).

19. H. Jeffery, S. S. Davis, and D. T. O’Hagan, Pharma-

11. L. D. Segel, J. M. Minten, and F. K. Schweighardt,

ceut. Res. 10 (3), 362 (1993).

Am. J. Physiol. 263, 730 (1992).

20. H. Yagi, A. Soto-Gutierrez, N. Navarro-Alvarez, et

12. A. C. Allison and N. E. Byars, J. Immunol. Methods

al., Molec. Therapy 18 (10), 1857 (2010).

95, 157 (1986).

21. A. E. Zhirnov, T. V. Demina, O. O. Krylova, et al.,

13. R. Hunter, F. Strickland, and F. Kezdy, J. Immunol.

Biochim. Biophys. Acta 1720 (1-2), 73 (2005).

127, 1244 (1981).

22. R. Vasita and D. S. Katti, J. Nanomedicine 7,

14. D. A. Howerton, R. L. Hunter, H. K. Ziegler, et al.,

(2012).

J. Immunol. 144, 1578 (1990).

15. P. Alexandridis, V. Athanassiou, S. Fukuda, et al.,

23. T. J. Barnes and C. A. Prestidge, Langmuir 16, 4116

Langmuir 10, 2604 (1994).

(2000).

16. G. Wanka, H. Hoffman, and W. Ulbricht, Macromo-

24. V. Zhalimov, A. Sklifas, V. Kaptsov, et al., Colloid

lecules 27, 4145 (1994)

Polymer Sci. 296 (2), 251 (2018).

The Effect of Polyoxyethylene-Polyoxypropylene Triblock Copolymers

on the Loading Amount of Poly(Lactic-co-Glycolic Acid)

Copolymer-based Microparticles Coupled

with Chlorine e₆ or Ethidium Bromide into Mesenchymal Stem Cells

A.A. Temnov* ** ***, A.N. Sklifas*, N.I. Kukushkin*, S.P. Krechetov**, E.V. Gorina**,

T.A. Astrelina***, D.Yu. Usupzhanova***, Yu.B. Suchkova***,

I.V. Kobzeva***, and A.S. Samoilov***

*Institute of Cell Biophysics - Division of Federal Research Center

“Pushchino Scientific Center of Biological Investigations” of the Russian Academy of Sciences,

Institutskaya ul. 3, Pushchino, M oscow Region, 142290 Russia

**M oscow Institute of Physics and Technology ( State University) ,

Institutskiy per. 9, Dolgoprudny, M oscow Region, 141701 Russia

***Burnasyan Federal M edical Biophysical Center of Federal M edical Biological Agency of Russia,

ul. M arshala Novikova 23, M oscow, 123098 Russia

In this study we investigated the effect of different polyoxyethylene-polyoxypropylene triblock

copolymers, their concentrations and the way of influence on the loading of poly(lactic-co-glycolic

acid) copolymer-based microparticles coupled with drugs, radachlorine (chlorine e₆) or ethidium

bromide, into mesenchymal stem cells. It is shown that drugs encapsulated in microparticles affect

the loading of these particles into the cytoplasm of mesenchymal stem cells. The number of cells

that have entrapped particles loaded with chlorine e₆ in the control is approximately twice as low

as that in the experiments with ethidium bromide. Pretreatment of microparticles with triblock

copolymers makes their loading into cells more efficient as compared to the situation when triblock

copolymers and particles are simultaneously added into the growth medium. Treatment of ethidium

bromide-coupled microparticles with triblock copolymers has no effect on their entrapment by

mesenchymal stem cells as compared to the control. Pluronic 123 is an exception: treatment of

particles with this compound at concentrations of 1 or 2%, the loading of particles into the cells

increases by a factor of 11 and 5, respectively, as compared to the control. Pretreatment of particles

coupled with chlorine e₆ with 4% of triblock copolymers is the most efficient procedure; the loading

of the pretreated particles into cells increases by a factor of approximately 3 to

11.

Keywords: mesenchymal stem cells, microparticles of poly( lactic-co glycolic acid) copolymers, triblock

copolymers, adsorption, chlorine e₆, ethidium bromide

БИОФИЗИКА том 64 вып. 2 2019