БИОФИЗИКА, 2019, том 64, № 3, с. 478-485

БИОФИЗИКА КЛЕТКИ

УДК 577.352.4:612.111.019:57.086.13

КОРРЕКЦИЯ ХОЛОДОВОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ ЭРИТРОЦИТОВ

МЛЕКОПИТАЮЩИХ ХЛОРПРОМАЗИНОМ,

ВЛИЯЮЩИМ НА ДИНАМИЧЕСКУЮ СТРУКТУРУ МЕМБРАН

Институт проблем криобиологии и криомедицины Национальной академии наук Украины,

61016, Харьков, ул. Переяславская, 23, Украина

E-mail: starling.nataly@gmail.com

Поступила в редакцию 18.07.2018 г.

После доработки 18.03.2019 г.

Принята к публикации 28.03.2019 г.

Исследована устойчивость эритроцитов млекопитающих (человек, собака, лошадь, бык и кролик)

к холодовому шоку в присутствии хлорпромазина и изучено его влияние на состояние эритроцитар-

ных мембран. С помощью корреляционного анализа определена сила связи между мембранными

фосфолипидами эритроцитов млекопитающих и характеристиками холодового шока этих клеток.

Установлено, что более устойчивыми к холодовому шоку являются эритроциты млекопитающих,

мембраны которых характеризуются высоким содержанием сфингомиелина, фосфатидилэтанол-

амина и низким содержанием фосфатидилхолинов. Показана высокая эффективность хлорпрома-

зина в защите эритроцитов млекопитающих от холодового шока. Методом ЭПР спиновых зондов

исследована динамическая структура мембран эритроцитов человека, обработанных хлорпромази-

ном. Использование набора спин-меченых зондов: амида пальмитиновой кислоты, 5-доксилстеа-

риновой кислоты и 16-доксилстеариновой кислоты, позволяющих изучать параметры микровязко-

сти липидного бислоя мембран эритроцитов в трансмембранном направлении, позволило устано-

вить локализацию действия хлорпромазина: в области полярных головок и гидрофобных хвостов

мембранных фосфолипидов.

Ключевые слова: эритроциты млекопитающих, холодовой шок, хлорпромазин, антигемолитическая

активность, структурно-динамическое состояние мембран.

DOI: 10.1134/S0006302919030074

зуют гипертонические растворы. Необходимость

Низкотемпературное консервирование широ-

применения гипертонических растворов в случае

ко используется для продолжительного хранения

холодового шока эритроцитов человека связыва-

биологического материала. При температуре

ют с присутствием холестерина в их плазматиче-

-196°С биологический объект может храниться

ских мембранах [1,2]. Полагают, что развитие по-

достаточно долго. Основные его повреждения

вреждения эритроцитов человека при холодовом

развиваются при замораживании, когда происхо-

шоке происходит следующим образом. В услови-

дит изменение температуры и концентрирование

ях инкубирования клеток в гипертонической сре-

внеклеточного раствора в результате выморажи-

де (при 37°С) в результате обезвоживания разви-

вания свободной воды. Для моделирования дей-

вается латеральное разделение мембранных ком-

ствия факторов криоповреждения (в частности,

понентов. В процессе последующего охлаждения

изменения температуры) на клетки используют

этих клеток до 0°С происходят фазовые переходы

холодовой шок, который заключается в их охла-

липидов в бесхолестериновых областях эритро-

ждении от 37°С до 0°С [1,2]. В указанных услови-

цитарной мембраны. На границе раздела фаз об-

ях многие клетки повреждаются, в отличие от

разуются дефекты, через которые происходит

эритроцитов человека, которые достаточно

утечка внутриклеточного содержимого. Пред-

устойчивы к охлаждению. Поэтому с целью сен-

ставленная точка зрения развития холодового

сибилизации эритроцитов к охлаждению исполь-

шока эритроцитов человека базируется на дан-

ных, полученных с использованием модельных

Cокpащения: ХПР - хлорпромазин, АПК - амид пальмити-

новой кислоты,

5-ДС

- 5-доксилстеариновая кислота,

систем [3-5] и при истощении клеточных мем-

16-ДС - 16-доксилстеариновая кислота.

бран по холестерину [6,7]. Последний подход,

478

КОРРЕКЦИЯ ХОЛОДОВОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ ЭРИТРОЦИТОВ

479

связанный с направленной модификацией струк-

В качестве доноров крови были использованы

турных компонентов клетки, может приводить к

здоровые половозрелые самцы животных, кото-

изменениям, которые не являются узкоспеци-

рые были иммунизированы, свободны от пара-

фичными и охватывают клетку в целом, т.е. вы-

зитов. Заготовку крови животных и все манипу-

зывают нарушения ее нативности в той или иной

ляции проводили в соответствии с отечественны-

степени. В связи с этим для исследования темпе-

ми и международными биоэтическими нормами,

ратурной и осмотической чувствительности кле-

материалами IV Европейской Конвенции о защи-

ток целесообразно использовать нативные эрит-

те позвоночных животных, используемых для

роциты разных видов млекопитающих, которые

экспериментальных и других научных целей (ETS

различаются по составу цитоплазмы, способно-

123) (Страсбург, 1986).

сти к деформации, активности транспортных пу-

После удаления плазмы эритромассу трижды

тей, фосфолипидному и белковому составу мем-

отмывали путем центрифугирования (центрифу-

браны [8-12]. Использование таких природных

га ОПн-3У4.2, 3000 об/мин, 3 мин) в 10-кратном

биологических объектов с привлечением корре-

объеме физиологического раствора (0,15 моль/л

ляционного анализа является перспективным для

NaCl, 0,01 моль/л фосфатный буфер, pH 7,4).

выявления компонентов, участвующих в меха-

Лейкоцитарную пленку и супернатант удаляли

низме реализации устойчивости клеток к дей-

аспирацией. Эритроциты хранили в виде плотно-

ствию стресса.

го осадка не более четырех часов при температуре

Известно, что разрушение эритроцитов чело-

0°С. Все используемые в работе среды готовили

века в условиях холодового шока могут предот-

на 0,01 моль/л фосфатном буфере, рН 7,4

вращать амфифильные соединения, в частности

Холодовой шок эритроцитов осуществляли сле-

хлорпромазин (ХПР) [13,14]. В настоящее время

дующим образом: сначала

50 мкл клеточного

интерес к ХПР, который является классическим

осадка переносили на 10 мин при температуре

транквилизатором и используется при лечении

37°С в 0,5 мл раствора, содержащего разные кон-

определенных психических расстройств, обу-

центрации NaCl (0,15-2,00 моль/л); затем из этой

словлен его противомикробными и противоопу-

пробы 50 мкл суспензии эритроцитов переносили

холевыми свойствами [15-18].

на 10 мин в 1,0 мл раствора NaCl той же концен-

Эффект ХПР в условиях температурно-осмо-

трации, охлажденного до температуры 0°С. Ко-

тического стресса эритроцитов реализуется в

нечный гематокрит - 0,4%. Точность измерения

первую очередь на уровне плазматической мем-

температуры ± 0,5°С.

браны. В пользу этого свидетельствуют и данные

Контроль осмоляльности растворов осуществ-

о трансформации клеток под действием этого ве-

ляли с помощью осмометра ОМКА 1Ц-01 (Одес-

щества [19]. Можно полагать, что проявление ан-

са, Украина).

тигемолитического эффекта будет определяться

структурно-динамическим состоянием эритро-

Вычисление значений максимальной антигемо-

цитарной мембраны.

литической активности и эффективных концентра-

ций хлорпромазина. Были получены зависимости

Целью данной работы является исследование

гемолиза эритроцитов млекопитающих в услови-

особенности устойчивости эритроцитов разных

ях холодового шока от концентрации ХПР (10-

видов млекопитающих (человек, собака, лошадь,

340 мкмоль/л). Клетки переносили из гипертони-

бык и кролик) к действию холодового шока в

ческой среды (1,2 моль/л NaCl, 37°С, 10 мин) в

присутствии хлорпромазина и изучение влияния

охлажденный раствор (1,2 моль/л NaCl, 0°С,

этого вещества на структурно-динамическое со-

10 мин), уже содержащий ХПР.

стояние эритроцитарных мембран.

Из полученных концентрационных зависимо-

стей гемолиза эритроцитов млекопитающих в

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

условиях холодового шока были рассчитаны ве-

Получение эритроцитов млекопитающих. Для

личины максимальной антигемолитической ак-

исследования использовали эритроциты, полу-

тивности и значения эффективных концен-

ченные из донорской крови человека, быка, ло-

траций.

шади, собаки и кролика, заготовленной на гемо-

Эффективная концентрация (САГmax) ХПР со-

консерванте «Глюгицир». Кровь мужчин группы

ответствовала середине диапазона концентраций

А(II)+ была предоставлена Харьковским област-

вещества, в пределах которого наблюдался мини-

ным центром службы крови. Кровь быка, лошади

мальный уровень гемолиза эритроцитов.

и собаки была предоставлена Харьковской госу-

дарственной зооветеринарной академией, кроли-

Значение максимальной антигемолитической

ка - виварием Института проблем криобиологии

активности (АГ_max) ХПР рассчитывали по фор-

и криомедицины НАН Украины.

муле:

БИОФИЗИКА том 64

№ 3

2019

480

ШПАКОВА и др.

NaCl, 10 ммоль/л фосфатный буфер (рН 7,4), при

температуре 37°С в течение 10 мин. Инкубация

клеток с амфифильным веществом не сопровож-

далась гемолизом эритроцитов. Контрольные

клетки инкубировали в аналогичных условиях без

добавления ХПР. К контрольным или модифи-

цированным ХПР клеткам добавляли раствор

зондов. Спин-меченая суспензия эритроцитов

(порядка 10⁹ кл/мл) содержала 5 · 10^-5 моль/л

зонда (не более 2% спирта). Спектры ЭПР реги-

стрировали на спектрометре «Bruker» со стан-

дартной термоприставкой при 37°С. Параметры

вращательной подвижности зондов вычисляли,

как описано в работе [20].

Статистический анализ данных. Статистиче-

скую обработку полученных числовых материа-

лов и все виды анализа результатов проводили с

помощью программы «Statistica» (версия 6.0).

Экспериментальные данные представлены как

среднее арифметическое значение количествен-

Рис. 1. Зависимости уровня гемолиза эритроцитов

ных показателей (М) ± стандартная ошибка сред-

млекопитающих в условиях холодового шока от

него арифметического (m) или как медиана ре-

концентрации NaCl в среде: 1 - человек, 2 - кролик,

зультатов (Ме) и степень рассеяния в виде интер-

3 - бык, 4 - лошадь, 5 - собака.

квартильного интервала (Q1-Q3). Для проверки

статистической значимости различий применяли

критерии Манна-Уитни. Корреляционный ана-

к -а

АГ

max

×100 %,

лиз с использованием непараметрического коэф-

фициента ранговой корреляции Спирмена (r

где к - величина гемолиза эритроцитов в отсут-

применяли для анализа связей между исследуе-

ствие ХПР, а - минимальная величина гемолиза

мыми показателями. Различия считали статисти-

эритроцитов в присутствии ХПР.

чески значимыми при p < 0,05.

Концентрация хлорпромазина в стоковом рас-

Реактивы. В работе использовали следующие

творе составляла 40 ммоль/л.

реактивы: 5-доксилстеариновую кислоту, 16-док-

Определение уровня гемолиза эритроцитов ме-

силстеариновую кислоту, хлорпромазин гидро-

тодом спектрофотометрии. Клетки осаждали цен-

хлорид (Calbiochem, США), амид пальмитиновой

трифугированием в течение

3 мин при

кислоты (Reanal, Венгрия); тритон Х-100 (Merсk,

3000 об/мин. Содержание вышедшего в суперна-

Германия).

тант гемоглобина определяли спектрофотомет-

рическим способом на спектрофотометре СФ-4А

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

(«ЛОМО», Россия) с проточной кюветой при

длине волны 543 нм и выражали в процентах по

На рис. 1 представлены данные о развитии ге-

отношению к 100%-му гемолизу эритроцитов. За

молиза эритроцитов млекопитающих при охла-

100% принимали поглощение пробы, в которую

ждении от 37°С до 0°С в гипертонических средах.

добавляли тритон Х-100 в концентрации 0,1%.

Монотонные зависимости гемолиза эритроцитов

Исследование состояния липидного бислоя мем-

быка и кролика от концентрации соли в инкуба-

бран эритроцитов методом ЭПР-спектроскопии.

ционной среде при охлаждении от 37°С до 0°С су-

Структурно-динамическое состояние мембран

щественно отличаются от зависимостей, полу-

эритроцитов человека исследовали методом ЭПР

ченных для эритроцитов человека, собаки и ло-

спиновых зондов с помощью спин-меченых жир-

шади (рис.

1). Последние характеризуются

ных кислот, содержащих нитроксильные фраг-

постепенным повышением уровня повреждения

менты в различных положениях вдоль гидрофоб-

с последующим в большей или меньшей степени

ной цепи

- амида пальмитиновой кислоты

выраженным снижением, которое можно объяс-

(АПК), 5-доксилстеариновой кислоты (5-ДС) и

нить некой «адаптацией» клеток к холодовому

16-доксилстеариновой кислоты (16-ДС).

шоку. В основе отмеченной «адаптации» эритро-

цитов человека, лошади и собаки могут лежать

Эритроциты человека, выделенные по стан-

дартной методике, инкубировали с ХПР

процессы, связанные с входом катионов Na⁺ в

(120 мкмоль/л) в среде, содержащей 150 ммоль/л

клетки, что будет приводить к снижению концен-

БИОФИЗИКА том 64

№ 3

2019

КОРРЕКЦИЯ ХОЛОДОВОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ ЭРИТРОЦИТОВ

481

трационного градиента на мембране и, как след-

Таблица 1. Корреляция между показателями холодово-

ствие, к уменьшению уровня гемолитического

го шока эритроцитов млекопитающих и липидным со-

ставом их плазматических мембран [21]

повреждения эритроцитов при охлаждении.

Пороговые

Гемолиз

Поскольку развитие повреждения эритроци-

тов человека в условиях холодового шока связы-

концентрации

в 0,8 моль/л

Липиды мембран

вают с фазовыми переходами липидов в бесхоле-

NaCl, моль/л

NaCl, %

эритроцитов

стериновых областях эритроцитарной мембраны

r_s

и формированием дефектов на границе раздела

фаз [1,2], представляло интерес оценить содержа-

Лизофосфатидилхолин

-0,891*

0,017

0,609

0,200

ние холестерина в мембранах изучаемых эритро-

цитов. Проведенный анализ показал, что для кле-

Сфингомиелин

0,878*

0,021

-0,714

0,111

ток человека, собаки, быка, кролика и лошади со-

держание мембранного холестерина варьирует в

Фосфатидилхолин

-0,878*

0,021

0,657

0,156

диапазоне от 23,0 до 29,9% от общих фосфолипи-

дов [21,22], причем этот показатель оказался вы-

Сфингомиелин +

-0,878*

0,021

0,829*

0,042

ше в клетках, которые более устойчивы к дей-

+ фосфатидилхолин

ствию холодового шока - эритроцитах быка и

Лизофосфатидилхолин +

-0,878*

0,021

0,829*

0,042

кролика.

+ сфингомиелин +

Это согласуется с ранее выдвинутыми предпо-

+ фосфатидилхолин

ложениями о важной роли холестерина в разви-

тии холодового повреждения эритроцитов чело-

Фосфатидилэтаноламин

0,878*

0,021

-0,886*

0,019

века и распространяется на клетки животных.

Сфингозин

0,878*

0,021

-0,714

0,111

Исходя из важности липидного компонента

эритроцитарной мембраны в обеспечении устой-

Примечание. * - Статистически значимые корреляции (p < 0,05).

чивости клеток к действию холодового шока

[1,2], представляло интерес оценить силу корре-

ляционной связи между мембранными фосфоли-

устойчивыми к повреждающему действия холо-

пидами эритроцитов разных видов млекопитаю-

дового шока.

щих и характеристиками холодового шока этих

клеток (рис. 1).

В ранее предложенном механизме холодового

шока авторы работы [23] связывали повреждение

В качестве показателей холодового шока эрит-

роцитов использовали два параметра, которые

клеток при охлаждении с содержанием неламел-

лярного фосфатидилэтаноламина, полагая, что

определяли из концентрационных зависимостей

гемолиза эритроцитов млекопитающих (рис. 1) -

этот фосфолипид участвует в формировании

это значение пороговой концентрации NaCl (т.е.

трансмембранных дефектов, приводящих к раз-

максимальная концентрация соли, после кото-

витию гемолиза эритроцитов. Однако получен-

рой наблюдается увеличение уровня гемолиза

ные нами результаты (табл. 1, рис. 1) указывают

клеток, превышающее 10%) и величину гемолиза

на иную роль неламеллярных фосфолипидов в

в среде, содержащей 0,8 моль/л NaCl. Данные по

развитии холодового шока эритроцитов млеко-

фосфолипидному составу (в процентах от общего

питающих, поскольку связь между содержанием

количества фосфолипидов) эритроцитарных

фосфатидилэтаноламина, сфингомиелина и зна-

мембран разных видов млекопитающих взяты из

чением пороговых концентраций соли значимая

работы [21]. Результаты корреляционного анали-

и положительная, а между содержанием фосфа-

за представлены в табл. 1. Видно, что пороговые

тидилэтаноламина и величиной гемолиза в

концентрации соли положительно коррелируют с

0,8 моль/л NaCl - значимая и отрицательная. Та-

содержанием сфингомиелина и фосфатидилэта-

ким образом, неламеллярные фосфолипиды, на-

ноламина и отрицательно - с содержанием фос-

оборот, обеспечивают устойчивость клеток к хо-

фатидилхолина в различных комбинациях.

лодовому шоку, вероятно, за счет образования

Уровень гемолиза эритроцитов в 0,8 моль/л

гексагональной структуры в ламеллярной упа-

NaCl положительно коррелирует с холинсодер-

ковке липидов. В результате этого происходит

жащими фосфолипидами и отрицательно - с со-

сброс напряжения на мембране (значительное

держанием фосфатидилэтаноламина. Таким об-

изотропное натяжение жидких липидных участ-

разом, эритроциты, которые характеризуются

ков мембраны при охлаждении) и, как следствие,

высоким содержанием фосфатидилэтаноламина

большие трансмембранные поры, доступные для

и низким содержанием фосфатидилхолина, то

внутриклеточных молекул гемоглобина, не могут

есть клетки быка и кролика, являются более

формироваться.

БИОФИЗИКА том 64

№ 3

2019

482

ШПАКОВА и др.

Таблица 2. Величины максимальной антигемолитиче-

нении формы эритроцитов [19,24]), так и на мик-

ской активности и значения эффективных концентра-

роуровне. В последнем случае изменения, вы-

ций хлорпромазина при холодовом шоке эритроцитов

званные действием ХПР, затрагивают как непо-

млекопитающих в среде, содержащей 1,2 моль/л NaCl

средственно саму эритроцитарную мембрану, так

Эритроциты

АГмaкс, %

С_{АГмакс.},

и метаболический статус клетки. Известно, что

млекопитающих

ХПР является ингибитором кальмодулина

мкмоль/л

[25,26], цитоплазматического белка, участвующе-

Человек

70 ± 3

120 ± 20

го в формировании клеточного ответа на внеш-

ние воздействия [27-29].

Бык

70 ± 4

155 ± 5

Изучение эффективности ХПР при его ис-

пользовании на разных этапах температурно-ос-

Лошадь

76 ± 2

240 ± 7

мотического стресса эритроцитов человека пока-

Кролик

70 ± 3

145 ± 10

зало, что предобработка эритроцитов ХПР не

позволяет веществу проявить антигемолитиче-

Собака

44 ±9

82 ± 21

ский эффект [13,30]. Это свидетельствует о том,

что антигемолитическое действие ХПР не связа-

но с предварительной биохимической модифика-

Примечание. АГ_max - антигемолитическая активность;

- значения эффективных концентраций хлорпро-

С_АГmax

цией клеток, которая заключается в первую оче-

мазина; представлены данные M ± m, n = 7.

редь в ингибировании кальмодулина. Тот факт,

что для проявления эффективности ХПР в усло-

виях холодового шока эритроцитов необходимо

Фосфатидилэтаноламин и холестерин являют-

его присутствие в среде в момент резкого измене-

ся эндогенными факторами, определяющими

ния температурных условий (37°С - 0°С), гово-

устойчивость эритроцитов разных видов млеко-

рит о способности ХПР встраиваться и иниции-

питающих к холодовому шоку. Поскольку на

ровать в мембране процессы, предотвращающие

формирование трансмембранных пор могут ока-

ее разрушение. Ранее в работе [31] с использова-

зывать влияние не только эндогенные, но и экзо-

нием эритроцитарных теней была показана спо-

генные факторы, представляло интерес исследо-

собность ХПР влиять на замыкание мембранных

вать влияние мембранотропного агента ХПР на

пор.

чувствительность эритроцитов животных к холо-

Амфифильные соединения взаимодействуют

довому шоку. Поскольку эритроциты млекопита-

как с липидными, так и с белковыми компонен-

ющих различаются по липидному составу плаз-

тами мембраны [32-34]. В работе с использова-

матических мембран [21,22], можно предполо-

нием катионного трифторперазина [35] показа-

жить, что в условиях холодового шока

но, что в условиях осмотического шока эритро-

эффективность ХПР будет определяться видовы-

цитов человека эффективность вещества не

ми особенностями клеток.

зависит от состояния белковых компонентов

Проведенные исследования позволили вы-

мембраны, модифицированных протеолитиче-

явить защитный эффект ХПР в условиях холодо-

скими ферментами (проназа, трипсин, папаин) и

вого шока для клеток всех исследуемых животных

нейраминидазой. Исходя из этого, можно пред-

(табл. 2). Уровень антигемолитической активно-

положить, что мишенью действия амфифильных

сти хлорпромазина достаточно высокий для

соединений являются в первую очередь липид-

эритроцитов человека, лошади, быка и кролика

ные компоненты мембраны. Хлорпромазин, яв-

(порядка 70%) и несколько ниже для клеток соба-

ляющийся катионным амфифильным соедине-

ки (44%). Выявленная особенность эффективно-

нием, преимущественно взаимодействует с отри-

сти ХПР для эритроцитов собаки может быть свя-

цательно заряженными липидами, что показано с

зана с невысоким содержанием мембранного

использованием модельных объектов [36,37].

фосфатидилэтаноламина по сравнению с эритро-

Методом ЭПР-спектроскопии с использова-

цитами других млекопитающих [21] и, как след-

нием спиновых зондов была исследована дина-

ствие, низкой способностью клеток собаки адап-

мическая структура мембраны эритроцитов чело-

тироваться к изменяющимся температурно-ос-

века в присутствии ХПР. Для этого применяли

мотическим условиям внешней среды.

набор зондов, с помощью которых изучали пара-

Молекулярный механизм антигемолитическо-

метры микровязкости липидного бислоя мем-

го действия ХПР в условиях холодового шока не-

бран эритроцитов в трансмембранном направле-

достаточно изучен.

нии. Спин-меченые жирные кислоты (амид паль-

ХПР характеризуется множественным влия-

митиновой кислоты,

5-доксилстеариновая и

нием на биологические объекты. Его действие на

16-доксилстеариновая кислоты) содержали нит-

клетки проявляется как на макроуровне (в изме-

роксильные фрагменты в различных положениях

БИОФИЗИКА том 64

№ 3

2019

КОРРЕКЦИЯ ХОЛОДОВОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ ЭРИТРОЦИТОВ

483

вдоль гидрофобной цепи. Зонд АПК, меченный в

первом положении вдоль углеродной цепи, явля-

ется удобным инструментом для изучения состо-

яния полярной поверхности мембраны. Зонды

5-ДС дают информацию о структуре гидратиро-

ванной анизотропной зоны мембраны, а 16-ДС -

более гидрофобной области (удаленной от по-

верхности мембраны на расстояние около 20 Å).

Типичные спектры ЭПР зондов АПК, 5-ДС и

16-ДС в мембране эритроцитов при 20°С пред-

ставлены на рис. 2. Спектры зондов АПК и 16-ДС

свидетельствуют о сравнительно быстром враще-

нии нитроксилов на поверхности и в гидрофоб-

ной зоне бислоя, соответственно, в то время как

спектр зонда 5-ДС отражает существенно анизо-

тропное вращение радикала. Кроме того, спектр

зонда 16-ДС демонстрирует суперпозицию сиг-

налов в высоком поле (наложение сигналов от

зондов, находящихся в различных микроокруже-

ниях), что свидетельствует о локализации нит-

роксилов в микроокружениях с различной поляр-

ностью. Параметр перераспределения зонда в

этих микрообластях, вычисляемый по отноше-

нию интенсивностей «гидрофобного» и «поляр-

ного» сигналов (Ι_h/Ι_p, рис. 2) может служить ха-

рактеристикой динамической структуры мем-

браны. При использовании одинаковых

Рис. 2. Спектры ЭПР спин-меченых жирных кислот

концентраций эритроцитов во всех эксперимен-

в мембране эритроцитов человека: 1 - амид пальми-

тах эмпирический параметр встраивания (диф-

тиновой кислоты, 2 - 5-доксилстеариновая кислота,

фузии) зонда в мембрану, пропорциональный

3 - 16-доксилстеариновая кислота.

интенсивности «гидрофобного» сигнала ЭПР, за-

висит от состояния липидных областей, сорбиру-

нитроксильного радикала зонда 5-ДС, не изменя-

ющих молекулы зонда.

ется для эритроцитов, проинкубированных с

Обработку эритроцитов человека хлорпрома-

ХПР, т.е. ХПР не оказывает влияние на состояние

зином осуществляли инкубированием клеток в

физиологическом растворе, содержащем амфи-

фил, при температуре 37°С. Продолжительность

инкубирования клеток с ХПР в течение 10 мин

Таблица 3. Параметры вращательной подвижности

как в экспериментах с ЭПР, так и в случае холо-

зондов АПК и 16-ДС (ν₊), зонда 5-ДС (ΔН_o) и пара-

дового шока эритроцитов достаточна для полного

метр распределения зонда 16-ДС (I_h/I_p) в мембране

встраивания амфифильных молекул в мембрану

эритроцитов человека, обработанных хлорпромази-

ном (Ме, Q1-Q3)

[38]. Концентрация вещества соответствовала

эффективной концентрации ХПР при холодовом

Параметр

Зонд

Контроль

Хлорпромазин

шоке эритроцитов человека (табл. 2) с учетом ге-

матокрита и, как показано в работе [39], не вызы-

АПК

ν₊ × 10^-8, с^-1

7,92

6,02*

вала нарушения барьерной функции мембраны

(7,65-8,32)

(5,61-7,00)

для ионов феррицианида.

5-ДС

ΔН_o, G

3,51

3,64

В табл. 3 представлены значения параметров

(3,32-3,85)

(3,35-4,25)

зондов АПК, 5-ДС и 16-ДС в мембранах эритро-

цитов, обработанных ХПР. Исследование влия-

I_h/I_p

3,0

4,6*

ния ХПР на липидный бислой мембран с исполь-

(2,2-3,7)

(3,4-5,0)

зованием зонда АПК показало, что ХПР значи-

16-ДС

тельно уменьшает частоту вращательной

ν₊ × 10^-8, с^-1

4,98

3,38*

подвижности спинового зонда, что свидетель-

(4,40-5,93)

(3,06-4,12)

ствует об увеличении микровязкости водно-ли-

пидной поверхности мембраны. Значение пара-

Примечание. * - статистически значимые различия по сравнению

метра ΔН₀, соответствующее частоте вращения

с показателями контрольных клеток (р < 0,05); n = 7.

БИОФИЗИКА том 64

№ 3

2019

484

ШПАКОВА и др.

анизотропной зоны мембраны (область глицери-

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

новых остатков молекул фосфолипидов).

А. М. Белоус, Е. А. Гордиенко и Л. Ф. Розанов,

Замораживание и криопротекция (Высш. шк., М.,

Величина частоты вращательной подвижно-

1987).

сти нитроксильного радикала зонда

16-ДС

А. М. Белоус и В. И. Грищенко, Криобиология

(табл. 3) свидетельствует о повышении микровяз-

(Наук. думка, Киев, 1994).

кости гидрофобной зоны мембраны под действи-

H. Giang and M. Schick, Chem. Phys. Lipids 199, 35

ем ХПР. При исследовании влияния ХПР на пе-

(2016).

рераспределение молекул зонда 16-ДС (Ι_h/Ι_p) в

L. Mao, L. Yang, Q. Zhang, et al., Biochem. Biophys.

Res. Commun. 468 (1-2), 125 (2015).

бислое мембран эритроцитов (табл. 3) обнаруже-

но практически полное исчезновение сигнала от

Y. Lange, S. M. Ali Tabei, J. Ye, et al., Biochemistry 52

(40), 6950 (2013).

зонда в полярном микроокружении. Выявленные

W. F. Wolkers, L M. Crowe, N. M. Tsvetkova, et al.,

особенности влияния ХПР на гидрофобные обла-

Mol. Membr. Biol. 19 (1), 59 (2002).

сти мембраны могут быть связаны со способно-

M. B. Cassera, A. M. Silber, and A. M. Gennaro, Bio-

стью этого вещества при встраивании в мембрану

phys. Chem. 99 (2), 117 (2002).

пересекать ее и распределяться во внутреннем

J. Florin-Christensen, C. E. Suarez, M. Florin-Chris-

монослое [19].

tensen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (14), 7736

(2001).

Таким образом, показана способность ХПР

G. Benga, Eur. Biophys. J. 42 (1), 33 (2013).

изменять структурно-динамическое состояние

10.

L. Liu, T. Lei, L. Bankir, et al., J. Comp. Physiol. B 181

эритроцитарной мембраны, что отражает неспе-

(1), 65 (2011).

цифическое нарушение баланса гидрофильно-

11.

H. Matei, L. Frentescu, and Gh. Benga, J. Cell. Mol.

гидрофобных взаимодействий и, как результат,

Med. 4 (4), 270 (2000).

возможное изменение упаковки липидов в лате-

12.

P. Bogner, K. Sipos, A. Ludany, et al., Eur. Biophys. J.

ральном и трансмембранном направлениях.

31 (2), 145 (2002).

13.

Н. М. Шпакова, Е. Р. Панталер и В. А. Бонда-

Следует отметить, что наши результаты об уве-

ренко, Биохимия 60 (10), 1624 (1995).

личении микровязкости как водно-липидной по-

14.

Н. М. Шпакова, Проблемы криобиологии 19 (4),

верхности мембраны, так и гидрофобной зоны

449 (2009).

мембраны (табл. 3) согласуются с данными, полу-

15.

T. Alexandru, A. Staicu, A. Pascu, et al., J. Biomed.

ченными другими исследователями [32,40]. Так,

Opt. 20 (5), 051002 (2015).

было показано, что в модельных бислоях ХПР

16.

A. M. Armada, T. Alexandru, D. Machado, et al., In

увеличивает упорядоченность фосфолипидов,

Vivo 27 (5), 605 (2013).

изменяя их состояние в области полярных голо-

17.

W. Y. Lee, W.T. Lee, C.H. Cheng, et al., Oncotarget 6

вок и жирнокислотных цепей [40], причем эти

(29), 27580 (2015).

эффекты могут быть обратимыми [32].

18.

D. Rundle-Thiele, R. Head, L. Cosgrove, et al., Br. J.

Clin. Pharmacol. 81 (2), 199 (2016).

В заключение можно сделать вывод о том, что

19.

H. Ahyayaucha, M. Gallego, O. Casis, et al., J. Physiol.

развитие холодового шока эритроцитов млекопи-

Biochem. 62 (3), 199 (2006).

тающих зависит от липидного состава их плазма-

20. Г. И. Лихтенштейн, Метод спиновых меток в

тических мембран, в частности, более устойчивы-

молекулярной биологии (Наука, М., 1974).

ми являются клетки с высоким содержанием хо-

21. J. M. C. Wessels and J. H. Veerkamp, Biochim. Bio-

лестерина и неламеллярных фосфолипидов

phys. Acta 291 (1), 190 (1973).

(фосфатидилэтаноламина и сфингомиелина).

22. G. J. Nelson, J. Lipid Res. 8 (4), 374 (1967).

Хлорпромазин, характеризующийся высоким ко-

23. А. М. Белоус, В. А. Бондаренко, Т. П. Бондаренко

и др., Криобиология и криомедицина 12, 13 (1983).

эффициентом распределения в эритроцитарной

24. W. H. Reinhart, S. Lubszky, S. Thöny, et al., Toxicol.

мембране, защищает эритроциты всех исследуе-

In Vitro 28 (7), 1274 (2014).

мых млекопитающих от холодового поврежде-

25. H. Kawamura, M. Arai, and A. Togari., Pharmacol.

ния. В присутствии ХПР происходит изменение

Sci. 117 (1), 54 (2011).

микровязкости мембраны в области полярных го-

26. C. Lübker and R .Seifert, PLoS One 10 (5), e0124017

ловок и гидрофобных хвостов мембранных фос-

(2015).

фолипидов. Можно предположить, что в основе

27. E. Carafoli and J. Krebs, J. Biol. Chem. 291 (40),

защитного действия ХПР при холодовом шоке

20849 (2016).

эритроцитов лежит способность его молекул

28. A. Roy, J. Ye, F. Deng, et al., Biochim. Biophys. Acta

предотвращать образование трансмембранных

1868 (1), 283 (2017).

пор через изменение состояния липидных

29. S. Takemoto-Kimura, K. Suzuki, S. I. Horigane, et al.,

компонентов мембраны.

J. Neurochem. 141 (6), 808 (2017).

БИОФИЗИКА том 64

№ 3

2019

КОРРЕКЦИЯ ХОЛОДОВОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ ЭРИТРОЦИТОВ

485

30. E. A. Semionova, E. A. Chabanenko, N. V. Orlova,

35. Н. М. Шпакова, О. Н. Дунаевская, О. П. Сынчи-

et al., Probl. Cryobiol. Cryomed. 27 (3), 219 (2017).

кова и др., Проблемы криобиологии 3, 7 (2002).

36. A. V. Agasøster, L. M. Tungodden, D. Čejka, et al.,

31. M. R. Lieber and T. L. Steck, J. Biol. Chem. 257 (19),

Biochem. Pharmacol. 61 (7), 817 (2001).

11660 (1982).

37. J. Y. Chen, L. S. Brunauer, F. C. Chu, et al., Biochim.

32. Y. W.Jiang, G. Gao, Z. Chen, et al., New J. Chem. 41

Biophys. Acta 1616 (1), 95 (2003).

(10), 4048 (2017).

38. J. Y. Chen and W. H. Huestis, Biochim. Biophys. Acta

33. E. A. Guevara, M. de Lourdes Barriviera, A. Hassón-

1323 (2), 299 (1997).

Voloch, et al., Photochem. Photobiol. 83 (4), 914

39. 39. Л. В. Цымбал, Н. В. Орлова и Н. М. Шпакова,

(2007).

Биол. мембраны 22 (4), 327 (2005).

34. P. T. Martins, A. Velazquez-Campoy, W. L. Vaz, et al.,

40. M. Suwalsky, F. Villena, C. P. Sotomayor, et al., Bio-

J. Am. Chem. Soc. 134 (9), 4184 (2012).

phys. Chem. 135 (1-3), 7 (2008).

Correction of Cold Injury to Mammalian Erythrocytes by Chlorpromazine,

Influencing the Membrane Dynamic Structure

N.M. Shpakova, N.V. Orlova, and S.S. Yershov

Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine, National Academy of Sciences of Ukraine

ul. Pereyaslavska 23, Kharkiv, 61016 Ukraine

The stability of mammalian erythrocytes (human, dog, horse, bull and rabbit) to cold shock in the presence

of chlorpromazine was studied and its effect on the state of erythrocyte membranes was investigated. By

means of the correlation analysis, the force of the connection between membrane phospholipids of mamma-

lian erythrocytes and the characteristics of the cold shock of these cells was determined. It has been estab-

lished that erythrocytes of mammals whose membranes are characterized with a high content of sphingomy-

elin, phosphatidylethanolamine and a low content of phosphatidylcholines are more resistant to the cold

shock. The chlorpromazine shows the high efficiency when protecting mammalian erythrocytes against the

cold shock. The dynamic structure of membranes of human erythrocytes treated with the chlorpromazine

was studied by EPR of spin probes. The use of a set of spin-labeled probes: palmitic acid amide, 5-doxylstearic

acid and 16-doxylstearic acid, which allow studying the microviscosity parameters of the lipid bilayer of

erythrocyte membranes in the transmembrane direction, has made it possible to establish the localization of

the action of the chlorpromazine, namely in the region of polar heads and hydrophobic tails of membrane

phospholipids.

Keywords: mammalian erythrocytes, cold shock, chlorpromazine, anti-hemolytic activity, structural and dynamic

state of membranes

БИОФИЗИКА том 64

№ 3

2019