БИОФИЗИКА, 2019, том 64, № 3, с. 601-607

БИОФИЗИКА CЛОЖНЫX CИCТЕМ

УДК 576.32

ОСОБЕННОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДА МАЙЛСА

ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ МИКРОСОСУДИСТОЙ ПРОНИЦАЕМОСТИ

ПРИ ИШЕМИЧЕСКИ-РЕПЕРФУЗИОННОМ ПОРАЖЕНИИ

ТОНКОГО КИШЕЧНИКА

Институт биофизики клетки РАН - обособленное подразделение Федерального исследовательского центра

«Пущинский научный центр биологических исследований PАН»,

142290, Пущино Московской области, ул. Институтская, 3

Институт экспериментальной кардиологии Национального медицинского исследовательского центра кардиологии

Минздрава России, 121552, Москва, ул. 3-я Черепковская, 15а

E-mail: gordeeva1310@yandex.ru

Поступила в редакцию 21.10.2018 г.

После доработки 21.11.2018 г.

Принята к публикации 14.02.2019 г.

Метод Майлса с использованием красителя Эванса является стандартным способом определения

проницаемости сосудов. Цель настоящей работы - определить специфику проникновения краси-

теля Эванса в кишечную ткань при ишемически-реперфузионном поражении тонкого кишечника

в течение раннего реперфузионного периода. Было показано, что в раннем реперфузионном пери-

оде происходит значительное разрушение микрососудов ворсинок и увеличение сосудистой прони-

цаемости для белков плазмы крови, что, по данным гистологии и лазерной допплеровской фло-

уметрии, приводит к нарушению кровотока на уровне микроциркуляторного русла. Максимальное

содержание красителя Эванса в кишечной ткани регистрировалось при его введении в кровоток пе-

ред 60-минутной ишемией, а минимальное содержание красителя Эванса - через 15 мин реперфу-

зии. Таким образом, изменение уровня содержания красителя Эванса в кишечной ткани зависит от

количества неповрежденных сосудов тонкого кишечника в момент введения красителя на разных

стадиях ишемии-реперфузии. Присутствие красителя Эванса в ткани при исследовании ишемиче-

ски-реперфузионного поражения тонкого кишечника в первую очередь количественно определяет

степень сохранности сосудов тонкого кишечника, а не степень проницаемости сосудов, как приня-

то считать.

Ключевые слова: ишемия-реперфузия, кишечник, сосудистая проницаемость, краситель Эванса.

DOI: 10.1134/S0006302919030220

зии органа физиологическим раствором) содер-

Многие патологии связаны с нарушениями

жание красителя Эванса в ткани показывает сте-

проницаемости микрососудистого русла. Одним

из методов исследования состояния проницаемо-

пень сохранности сосудов, то есть низкий

сти сосудов при патологиях является использова-

уровень содержания Эванса в ткани указывает на

ние анализа Майлса. Это метод основан на внут-

сохранение функционального состояния сосудов

ривенном введении азокрасителя Эванса, кото-

[2-5]. При патологических состояниях, которые

рый прочно связывается с альбумином крови,

сопровождаются повреждением сосудов, будет

быстро (в течение минут) распространяется по

происходить миграция меченого альбумина в

кровеносному руслу и присутствует в крови по

окружающие ткани, то есть повышение уровня

крайней мере в течение суток [1]. При физиоло-

красителя Эванса в ткани, что позволяет количе-

гических условиях эндотелиальный барьер не

ственно определять степень проницаемости сосу-

проницаем для меченного красителем Эванса

дов в органе [1]. Метод Майлса активно использу-

альбумина, соответственно после удаления мече-

ется для определения изменения проницаемости

ного альбумина из крови (например, при перфу-

микрососудов при разных патологиях [2,7-10], в

Сокращения: МЦР - микроциркуляторное русло, ЛДФ -

том числе и при ишемически-реперфузионном

лазерная допплеровская флоуметрия.

поражении внутренних органов [3-5,11].

601

602

ГОРДЕЕВА и др.

Метод Майлса применяется также при мони-

Животные. Были использованы крысы-самцы

торинге лечения лекарственными препаратами

линии Wistar (масса тела 200-220 г, возраст 6-8

для исследования сосудистой проницаемости

недель), которых содержали в условиях вивария

при разных патологиях органов [9,11,12]. Однако

ИБК PАН (Пущино Московской области). Об-

здесь очень важно отметить существенный мо-

щее количество животных - 35 особей. Работу с

мент. При использовании красителя Эванса в

лабораторными животными проводили в соот-

крови остается некоторая доля свободного краси-

ветствии с положениями «Европейской конвен-

теля (0,5% от общего количества), который может

ции о защите позвоночных животных, используе-

связываться с препаратами белковой природы,

мых для эксперимента и других научных целей,

например ферментами или пептидами, при этом

1986». Основной документ, регламентирующий

может происходить инактивация ферментов [13].

проведение настоящего исследования - «Руко-

Тогда при одновременном введении красителя

водство по работе с лабораторными животными

Эванса и белкового препарата интерпретация эф-

ИБК PАН» (Приказ ИБК РАН

№57 от

фектов препаратов будет затруднительна, напри-

30.12.2011 г.).

мер, при исследовании протекторных свойств

Модель ишемически-реперфузионного пораже-

ферментов-антиоксидантов при окислительном

ния тонкого кишечника. В качестве эксперимен-

стрессе в пораженном органе [14,15]. Соответ-

тальной модели ишемически-реперфузионного

ственно, необходимо определить временные

поражения была использована окклюзия верхней

границы введения красителя и лекарственного

мезентеральной артерии по модификации, опи-

препарата. В этом случае актуальным является

санной в работе [17]. Предварительно животным

выяснение возможности и специфики проникно-

внутривенно вводили смесь золетила 100 (3 мг/кг)

вения красителя в ткани органа при разной степе-

и рометара (10 мг/кг) и вскрывали брюшную по-

ни поражения сосудов.

лость. Ишемию кишечника выполняли путем на-

ложения сосудистого зажима на верхнюю мезен-

В настоящей работе в качестве модели острой

теральную артерию и вену на срок 60 мин. Репер-

патологии нами используется ишемически-ре-

фузия кишечника была опосредована снятием

перфузионное поражение тонкого кишечника,

сосудистого зажима. Максимальный период ре-

которое сопровождается в первую очередь дис-

перфузии составил 120 мин. Оперативное вмеша-

функцией микрососудистого русла [12,16]. На

тельство проводили под общим наркозом.

данной модели с помощью метода Майлса было

проведено исследование специфики проникно-

Измерение состояния сосудов с помощью краси-

вения красителя Эванса в кишечную ткань на

теля Эванса. Краситель Эванса (40 мг/кг) крысам

разных стадиях поражения сосудов микроцирку-

вводили внутривенно на разных сроках ишемиче-

ляторного русла. Параллельно гистологическими

ски-реперфузионного поражения: за 15 мин до

методами было выявлено морфологическое со-

ишемии, сразу после купирования ишемии, через

стояние микроциркуляторного русла (МЦР) в

15 мин после периода 15-минутной реперфузии,

разные сроки ишемически-реперфузионного по-

здоровому животному на срок 15 мин.

ражения тонкого кишечника, а методом лазерной

Для удаления из кровотока несорбированного

допплеровской флоуметрии (ЛДФ) было опреде-

тканью красителя Эванса проводили перфузию

лено функциональное состояние системы микро-

целого животного через аорту физиологическим

циркуляции тонкого кишечника. В совокупно-

раствором, содержащим гепарин. Качество пер-

сти, эти методы позволят решить задачу объек-

фузии оценивали визуально по исчезновению

тивной оценки характера миграции альбумин-

окраски мезентеральных сосудов тонкого кишеч-

связанного красителя Эванса из сосудистого рус-

ника. После окончанию перфузии весь под-

ла в окружающие ткани при разной степени пора-

вздошный отдел тонкого кишечника был разде-

жения сосудов при ишемически-реперфузион-

лен на пять частей, каждая длиной около 2 см, для

ном поражении.

отбора образцов слизистой оболочки. Образцы

взвешивали, помещали в 0,5 мл 0,9% NaCl и

1,5 мл формамида и инкубировали 20 ч при 40°С.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

После инкубации суспензию центрифугировали

при 14000 g в течение 15 мин и определяли опти-

Материалы. В работе использовали краситель

ческую плотность супернатанта на спектрофото-

Эванса Evans Blue (Sigma, Германия), золетил 100

метре Multiskan (Thermo Electron, США) при

(Virbac Sante Animale, Франция), рометар (Biove-

600 нм. Относительное содержание красителя

ta, Чехия), гепарин натрия 5000 МЕ/мл (РУП

Эванса в ткани выражали в единицах оптической

«Белмедпрепараты», Россия), формамид (Appli-

плотности при 600 нм на грамм ткани (D₆₀₀/г).

Chem, Германия), фиксатор Myrsky’s Fixative

(Merck, США), гематоксилин-эозин (VITRO-

Оценка состояния ткани тонкого кишечника.

STAIN Biovitrum, Россия).

Для проведения гистологического анализа состо-

БИОФИЗИКА том 64

№ 3

2019

ОСОБЕННОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДА МАЙЛСА\

603

Содержание красителя Эванса в ткани эпителии тонкого кишечника при ишемически-реперфузионном пора-

жении при разных способах введения красителя

Экспериментальная группа

D₆₀₀/г ткани

Введение красителя на 15 мин здоровому животному

0,24 ± 0,04

Введение красителя за 15 мин до ишемии. Ишемия 60 мин,

2,42 ± 0,4

реперфузия 15 мин

Введение красителя сразу после 60-минутной ишемии.

1,72 ± 0,18

Реперфузия 15 мин

Введение красителя через 15 мин реперфузии

0,8 ± 0,05

яния слизистой оболочки образцы тонкого ки-

но для здорового органа. Проницаемость микро-

шечника экспериментальных животных помеща-

сосудов для белков крови соответствует норме и,

ли в фиксатор Myrsky’s Fixative для гистологиче-

согласно гистологическому анализу ткани здоро-

ского материала с последующим заключением в

вого кишечника, слизистая оболочка и МЦР

парафин по стандартной методике. Парафино-

функционально целостные (рис. 1а).

вые срезы

(2 мкм) получали на микротоме

Максимальное содержание красителя Эванса

(Thermo Electron, США) и окрашивали гематок-

в слизистой ткани тонкого кишечника отмечено в

силин-эозином. Для определения распределения

случае введения красителя в кровяное русло пе-

красителя Эванса по сосудистым структурам вы-

ред ишемически-реперфузионным поражением

полняли серии криосрезов толщиной 20 мкм с

тонкого кишечника (2,42 ± 0,4 D₆₀₀/г ткани).

помощью криотома (Thermo Electron, США) при

t = -20°C. Микроскопический анализ срезов про-

Макроскопический анализ тонкого кишечника

водили на микроскопе DM 6000 (Leica, Герма-

через 15 мин реперфузии показал неоднород-

ния) с цифровой камерой Leica DFC 490. Визуа-

ность в картине поражения органа и способах вы-

лизацию красителя Эванса в ткани проводили

хода красителя Эванса из МЦР. Доминируют

при возбуждении на 515-560 нм.

участки со значительным кровоизлиянием и с

обильным слизистым экссудатом. Анализ криос-

Лазерная допплеровская флоуметрия. Исследо-

резов соответствующих участков тонкого кишеч-

вание выполняли на аппарате «Анализатор лазер-

ника с помощью флуоресцентной микроскопии

ный микроциркуляции крови ЛАКК-01» (НПП

показал, что в кишечной ткани в конце реперфу-

«ЛАЗМА», Россия). В качестве основного пара-

зионного периода (15 мин) наблюдается значи-

метра уровня перфузии кишечной ткани исполь-

тельное разрушение микрососудов в апикальной

зовали показатель микроциркуляции, который

части пораженных ворсинок с выходом из микро-

отражает величину среднего потока крови (эрит-

сосудов в строму ворсинок и в полость кишечни-

роцитов) в интервалах времени регистрации в

ка красителя Эванса (рис. 2).

единице объема ткани и выражается в относи-

тельных перфузионных единицах (arbitrary perfu-

Гистологический анализ динамики пораже-

sion units) [18]. Для регистрации показателя мик-

ния тонкого кишечника при ишемии-реперфу-

роциркуляции весь тонкий кишечник визуально

зии представлен на рис. 1б-г. После периода

разделяли на три участка, согласно работе [19], в

ишемии (60 мин) в тонком кишечнике отмечено

пределах каждого участка производили регистра-

частичное повреждение ворсинок: отек стромы,

цию показателя микроциркуляции. Регистрацию

повреждение апикального эпителия и появление

ЛДФ-сигнала проводили непрерывно в течение

субэпителиальных пространств (рис. 1б). Репер-

всего ишемически-реперфузионного периода.

фузионный период в течение 15 мин после пери-

ода ишемии приводит к развитию видимых по-

вреждений слизистой оболочки тонкого кишеч-

РЕЗУЛЬТАТЫ

ника, в частности, структур ворсинок (рис. 1в).

В таблице представлены данные по содержа-

Патологическое состояние ворсинок тонкого ки-

нию красителя Эванса в слизистой оболочке тон-

шечника характеризуется повреждением МЦР,

кого кишечника крысы при его введении на раз-

что приводит к появлению крупных очагов кро-

ных этапах ишемически-реперфузионного пора-

воизлияний в строму ворсинок, особенно в апи-

жения.

кальной части, развитием интерстициального

Из таблицы видно, что минимальное содержа-

отека и слущивание пораженного эпителия по

ние красителя Эванса (0,24 ± 0,04 D₆₀₀/г) отмече-

оси ворсинка-крипта в полость кишечника.

БИОФИЗИКА том 64

№ 3

2019

604

ГОРДЕЕВА и др.

Рис. 1. Гистология тонкого кишечника крысы при ишемически-реперфузионном поражении: (а) - контроль, ин-

тактная структура слизистой оболочки; (б) - ишемия 60 мин/реперфузия 0 мин; (в) - ишемия 60 мин/реперфузия

15 мин; (г) - ишемия 60 мин/реперфузия 120 мин. Окраска эозин-гематоксилином.

В случае введения красителя Эванса на срок

15 мин сразу после окончания 60-минутной ише-

мии отмечается снижение содержания красителя

в слизистой оболочке тонкого кишечника до

1,72 ± 0,18 D₆₀₀/г ткани по сравнению с вариан-

том введения красителя перед поражением. В

случае введения красителя на срок 15 мин через

15 мин реперфузии его содержание уменьшается

до 0,8 ± 0,05 D₆₀₀/г ткани (таблица).

Архитектура тонкого кишечника через 120 мин

реперфузии представлена на рис.

1д. Через

120 мин реперфузии происходит сильное пораже-

ние слизистой оболочки. Соединительная ткань

стромы ворсинок уплотнена и инфильтрована

полиморфноклеточными элементами, отмечены

Рис. 2. Флуоресцентная микроскопия тонкого ки-

кровоизлияния. Ворсинки теряют физиологиче-

шечника при ишемически-реперфузионном пора-

скую форму и увеличиваются в ширину из-за на-

жении. Ишемия - 60 мин, реперфузия - 15 мин.

личия значительного интерстициального отека.

Участок с кровоизлиянием. Светлые места - флуо-

Наблюдается разрушение и масштабное слущи-

ресценция красителя Эванса. Фильтр: Cube name N

2.1 для флуорохрома Evans Blue. Криосрезы.

вание эпителиальных клеток.

БИОФИЗИКА том 64

№ 3

2019

ОСОБЕННОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДА МАЙЛСА\

605

Рис. 3. ЛДФ-сигнал локального кровотока тонкого кишечника при ишемически-реперфузионном поражении (цен-

тральный участок тонкого кишечника). ЛДФ-сигнал отражает период покоя (0-1 мин), период ишемии (отсутствие

кровотока) (1-60 мин), начальный период возобновления кровотока (реперфузия) (61-64 мин) и конец реперфу-

зионного периода (114-120 мин). Непрерывная съемка.

Как видно из гистологических исследований,

судов опосредована контактными взаимодей-

уже с началом реперфузии происходит пораже-

ствиями эндотелиальных клеток, которые огра-

ние сосудов МЦР, что приводит к появлению

ничивают межклеточную миграцию веществ.

крупных очагов кровоизлияний в строму ворси-

При ряде патологических состояний барьерная

нок (рис. 1б). Динамика разрушения МЦР при

функция эндотелия нарушается, и в ткань посту-

ишемически-реперфузионном поражении была

пает богатая белком плазма, что опосредует раз-

выявлена методом ЛДФ. На рис. 3 представлен

витие отека [20].

ЛДФ-сигнал, отражающий изменение показате-

В настоящей работе на модели ишемически-

ля микроциркуляции в слизистой тонкого ки-

реперфузионного поражения тонкого кишечника

шечника на медиальном участке в течение всего

была показана специфика использования краси-

ишемически-реперфузионного периода. В кон-

теля Эванса для исследования состояния МЦР

троле (период покоя) значения показателя мик-

тонкого кишечника на разных сроках ишемиче-

роциркуляции составляют около 70 отн. ед. (от-

ски-реперфузионного поражения: краситель вво-

носительных единиц кровотока). С началом ише-

дили в норме, до ишемии, с началом реперфузии

мии происходит снижение уровня показателя

и по окончании реперфузии.

микроциркуляции до 20 отн. ед. (отсутствие кро-

вотока). С началом реперфузии вначале наблюда-

В случае здорового кишечника целостность

ется повышение его уровня в сторону контроль-

МЦР позволяет красителю беспрепятственно

ных значений с последующей фазой спада в тече-

циркулировать по микрососудам в составе крове

ние 4-5 мин, т.е. снижение уровня показателя

и не проникать через сосудистую стенку. При

микроциркуляции впервые минуты реперфузии

перфузии краситель в составе крови полностью

развивается параллельно с поражением ворсинок

удаляется из неповрежденных сосудистых струк-

и микрососудов. К концу реперфузионого перио-

тур слизистой оболочки тонкого кишечника (таб-

да (через 120 мин) показатель микроциркуляции

лица).

не достигает контрольных значений и составляет

Противоположная ситуация наблюдается при

в среднем 50% от контроля, что соответствует

введении красителя Эванса за 15 мин до ишеми-

значительному поражению структуры МЦР.

чески-реперфузионного поражения. Соединяясь

с альбумином крови, краситель беспрепятствен-

но циркулирует по здоровым сосудам МЦР тон-

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

кого кишечника в течение 15 мин. В последую-

Микрососудистое русло тонкого кишечника

щие 60 мин ишемии краситель в составе крови

выстлано изнутри монослоем эндотелиальных

блокируется в сосудах тонкого кишечника. Ги-

клеток, которые выполняют многочисленные

стологический анализ показал, что в период ише-

функции в организме, участвуя в регуляции свер-

мии не наблюдается патологического разруше-

тывания крови, в контроле сосудистого тонуса и

ния структур слизистой оболочки, что согласует-

гемодинамики, в иммунных реакциях, в барьер-

ся с данными работы [2], где было показано, что

ной функции. Барьерная функция эндотелия со-

ишемия сама по себе не приводит к значительно-

БИОФИЗИКА том 64

№ 3

2019

606

ГОРДЕЕВА и др.

му микрососудистому повреждению кишечника.

сокий уровень содержания красителя в слизистой

Однако последующий 15-минутный реперфузи-

оболочке тонкого кишечника относительно ана-

онный период запускает развитие значительного

логичных показателей в здоровом органе. Стоит

поражения кишечной ткани [21]. При макроско-

отметить, что содержание красителя ниже, чем во

пическом анализе тонкого кишечника было об-

втором варианте введения, что, по-видимому,

наружено, что через 15 мин реперфузии преобла-

связано с нарушением структур МЦР в течение

дают участки со значительным кровоизлиянием и

ишемического периода.

участки с обильным слизистым экссудатом. Мик-

При введении красителя Эванса через 15 мин

роскопический анализ этих участков показал

после реперфузии отмечено еще большее сниже-

крупные очаги кровоизлияний в ткани кишечни-

ние его содержания в слизистой оболочке кишеч-

ка, что напрямую указывает на поражение МЦР.

ной ткани (таблица). В этом случае уменьшение

Разрушение МЦР было подтверждено ЛДФ-ана-

содержания красителя в слизистой оболочке ки-

лизом. ЛДФ-грамма показала изменение локаль-

шечной ткани указывает на развитие поражения

ной гемодинамики в начальный реперфузион-

МЦР, а не на снижение его поражения. Получен-

ный период. Таким образом, снижение уровня

ные результаты не совпадают с мнением ряда ав-

показателя микроциркуляции в первые минуты

тором о том, что низкий уровень содержания кра-

реперфузии развивается параллельно с пораже-

сителя Эванса в кишечной ткани указывает на со-

нием микрососудов. Быстрое развитие пораже-

хранение функционального состояния сосудов

ния в начальный реперфузионный период объяс-

[2-5]. Так, макро- и микроскопический монито-

няет высокий уровень содержания красителя

ринг и ЛДФ-анализ показали, что через 15 минут

Эванса в слизистой оболочке (таблица). Невоз-

реперфузии происходит нарушение кровотока на

можность удаления красителя при последующей

уровне МЦР, разрушение микрососудов и обра-

перфузии из кишечной ткани связано с двумя

зование интерстициального отека, что, по-види-

причинами: во-первых, это масштабное разруше-

мому, опосредует невозможность попадания кра-

ние МЦР, во-вторых, миграция красителя в

сителя в составе крови в соответствующие микро-

строму из-за увеличения проницаемости микро-

сосудистые структуры.

сосудов для белков плазмы крови. Вопрос о доми-

Таким образом, использование красителя

нирующем процессе на данных сроках реперфу-

зионного периода остается открытым, однако по

Эванса для определения состояния микрососудов

и сосудистой проницаемости при ишемически-

предварительным данным основной вклад вно-

сит разрушение МЦР. Тем не менее в совокупно-

реперфузионном поражении тонкого кишечника

имеет свою специфику. Она выражается в измен-

сти оба процесса приводят к выходу плазмы в ки-

шечную строму, что опосредует образование ин-

чивости картины проникновения красителя в

ткани органа на разных стадиях поражения сосу-

терстициального отека и нарушение кровотока на

дов. Так, при введении красителя в здоровые со-

уровне МЦР.

суды перед ишемически-реперфузионным пора-

При введении красителя Эванса синего на

жением миграция красителя Эванса из микросо-

срок 15 мин сразу после купирования ишемии его

судов в ткани будет зависеть от совокупности двух

содержание в слизистой оболочке снижается по-

процессов: от уровня разрушения микрососудов

чти в полтора раза, по сравнению с вариантом

и увеличения сосудистой проницаемости для аль-

введения красителя перед ишемически-реперфу-

бумин-связанного красителя. Степень развития

зионным поражением (таблица). Снижение со-

этих процессов, в свою очередь, связана с продол-

держания красителя в слизистой ткани кишечни-

жительностью периода, как ишемии, так и репер-

ка не указывает на уменьшение поражения МЦР

фузии. Данный вариант введения красителя наи-

и снижение проницаемости сосудов для белков

более часто используется в исследованиях изме-

плазмы крови, как принято считать [2-5], а, на-

нения проницаемости сосудов при ишемически-

против, указывает на развитие поражения. Так, в

реперфузионном поражении кишечника [2,3,5].

период ишемии структура слизистой оболочки и

Напротив, варианты введения красителя

МЦР остается в целом неповрежденной, что поз-

Эванса сразу после ишемии или во время репер-

воляет красителю в начальный момент после

фузии не могут быть использованы для адекват-

купирования ишемии достигнуть с током крови

ной оценки проницаемости сосудов. В этой ситу-

сосудистых структур кишечной ткани. Однако

ации МЦР повреждено, что ограничивает про-

последующий после ишемии 15-минутный ре-

никновение красителя в эту область. Поэтому

перфузионный период приводит к повреждению

снижение содержания красителя в слизистой тка-

МЦР, росту микрососудистой проницаемости и

ни кишечника в этих условиях не может быть

нарушению общей архитектуры слизистой обо-

критерием, указывающим на уменьшение сосу-

лочки, как показал макро- и микроскопический

дистой проницаемости для белков плазмы крови.

анализ кишечной ткани. Это обуславливает вы-

В этом случае уровень красителя в ткани тонкого

БИОФИЗИКА том 64

№ 3

2019

ОСОБЕННОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДА МАЙЛСА\

607

кишечника количественно определяет в первую

6. M. Radu and J. Chernoff, J. Vis. Exp. 73, 50062 (2013).

очередь степень сохранности сосудов тонкого ки-

7. G. E. Plante, M. Chakir, S. Lehoux, et al., Can. J.

шечника на разных стадиях ишемически-репер-

Physiol. Pharmacol. 74, 824 (1996).

фузионного поражения, а не степень проницае-

8. Y. Suyama, O. Handa, Y. Naito, et al., Biochem. Bio-

мости сосудов.

phys. Res. Commun. 498, 228 (2018).

Данные о специфике миграции красителя

9. L. Y. Pan, Y. F. Chen, H. C. Li, et al., Cell Physiol. Bio-

Эванса в кишечную ткань при разной степени по-

chem. 44, 2395 (2017).

ражения сосудов необходимо учитывать при ис-

10. J. Moitra, S. Sammani, and J. G. Garcia, Transl. Res.

следовании протекторных свойств различных

150, 253 (2007).

препаратов, которые могут взаимодействовать с

11. Y. Suzuki, A. C. Yeung, and F. Ikeno, J. Biomed. Bio-

этим красителем.

technol. 2011, 195483 (2011).

Работа выполнена при финансовой поддержке

12. D. N. Granger, Microcirculation 6, 167 (1999).

Российского фонда фундаментальных исследова-

13. C. Tsopelas and R. Sutton, J. Nucl. Med. 43, 1377

ний (гранты № 17-44-500371р_а и № 17-04-

(2002).

00356а), Программы Президиума РАН «Молеку-

14. A. Gordeeva, A. Temnov, A. Charnagalov, et al., Dig.

лярная и клеточная биология» и Фонда содей-

Dis. Sci. 60, 3610 (2015).

ствия развития малых форм предприятия в науч-

15. М. Г. Шарапов, А. Е. Гордеева, Р. Г. Гончаров

но-технологической сфере «УМНИК» в рамках

и др., Биофизика 62, 6 (2017).

договора № 11430ГУ/2017 от 10.05.2017 г.

16. B. Vollmar and M. D. Menger, Langenbecks Arch.

Surg. 396, 13 (2011).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

17. S. I. Kim, Y. B. Kim, K. M. Koh, et al., J. Surg. Res.

179, 99 (2013).

1. L. Yao, X. Xue, P. Ju, et al., Contrast Media Mol. Im-

18. В. И. Козлов, Лазерная допплеровская флоуметрия в

aging 2018, 7628037 (2018).

оценке состояния и расстройств микроциркуляции

2. J. Schumacher, K. Binkowski, A. Dendorfer, et al.,

крови. Методическое пособие для врачей (М., РУДН,

Shock 20, 565 (2003).

2012).

3. Z. Zang, F. F. Li, M. D. Lu, et al., Zhonghua Yi Xue Za

19. D. E. Rosow, D. Sahani, O. Strobel, et al., J. Gastroin-

Zhi 93, 2913 (2013).

test. Surg. 9, 1262 (2005).

4. A. T. Mészáros, T. Büki, B. Fazekas, et al., Surgery 161,

20. В. П. Ширинский, Успехи физиол. наук 42, 1

1696 (2017).

(2011).

5. Z. Teke, B. Kabay, A. Ozden, et al., J. Surg. Res. 149,

21. A. Gordeeva, M. Sharapov, I. Tikhonova, et al., Cells

259 (2007).

Tissues Organs 203 (6), 353 (2013).

Particularities of the Use of the Miles Assay for the Study of Microvascular

Permeability in Ischemic-Reperfusion Injury of the Small Intestine

A.E. Gordeeva*, I.V. Tikhonova*, V.P. Shirinsky**, and V.I. Novoselov*

*Institute of Cell Biophysics, Russian Academy of Sciences,

Institutskaya ul. 3, Pushchino, Moscow Region, 142290 Russia

**Institute of Experimental Cardiology, Russian Cardiology Research and Production Complex of the Ministry of Health

of Russian Federation, 3-ya Cherepkovskaya ul. 15a, Moscow, 121552 Russia

The Miles assay combined with the use of the Evans blue dye is a traditional method for assessing vascular

permeability. Our objective was to determine a specificity of Evans dye penetration into the intestinal tissue

during ischemic-reperfusion injury of the small intestine in the early reperfusion phase. It was shown that in

the early reperfusion phase there is a significant destruction of villus microvessels and an increase in vascular

permeability for plasma proteins, that, according to histology and laser Doppler flowmetry, leads to impaired

blood flow at the level of the microvasculature. The highest concentration of Evans blue in the intestinal tis-

sue was recorded when it was injected into the bloodstream before 60-min ischemia, and the lowest level of

Evans blue dye was detected after 15 minutes of reperfusion. Thus, the change in the level of dye content in

the intestinal tissue depends on the number of intact vessels of the small intestine at the time of dye injection

at different stages of ischemia-reperfusion. The presence of Evans blue dye in the tissue in the study of isch-

emic-reperfusion injury of the small intestine first of all quantitatively determines the degree of preservation

of the vessels of the small intestine, but not the degree of vascular permeability, as is commonly believed.

Keywords: ischemia-reperfusion, intestine, vascular permeability, Evans blue dye

БИОФИЗИКА том 64

№ 3

2019