БИОФИЗИКА, 2019, том 64, № 4, с. 668-673

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОФИЗИКА

УДК 575.224:599.323.4

ДЕЛЕЦИЯ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК У ПОТОМКОВ САМОК

МЫШЕЙ, ПОДВЕРГНУТЫХ ВОЗДЕЙСТВИЮ

РЕНТГЕНОВСКОГО ИЗЛУЧЕНИЯ

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН,

142290, Пущино Моcковcкой облаcти, ул. Инcтитутcкая, 3

E-mail: lommg1@gmail.com

Поступила в редакцию 08.04.2019 г.

После доработки 08.04.2019 г.

Принята к публикации 30.04.2019 г.

Проведена оценка влияния рентгеновского излучения на митохондриальный геном потомков

самок мышей, облученных в преконцептивном периоде в дозах 0,5 и 2 Гр. Последствия воздействия

рентгеновского излучения оценивали по доле потомков, имеющих делецию мтДНК размером

4974 п.о. Результаты проведенного исследования показали, что облучение самок мышей в

выбранных дозах не приводит к увеличению доли их потомков, имеющих делецию мтДНК в клетках

тканей головного мозга, селезенки и периферической крови.

Ключевые слова: мыши, рентгеновское излучение, потомки F1, делеция мтДНК.

DOI: 10.1134/S0006302919040045

ну органеллу [3]. Таким образом, можно пола-

Исследования молекулярных, генетических

гать, что одной из возможных причин более вы-

последствий радиационного воздействия остают-

раженной нестабильности митохондриального

ся достаточно актуальной проблемой. Развитие

генома потомства облученных самок, по сравне-

этих исследований востребовано в связи с широ-

нию с потомками облученных самцов, могут

ким использованием ионизирующих излучений в

быть повреждения в мтДНК ооцитов, которые у

терапии опухолей и в других областях медицины.

млекопитающих наследуются по материнской

Кроме того, люди могут подвергаться воздей-

линии [4].

ствию ионизирующих излучений в процессе про-

фессиональной деятельности, в результате ядер-

Одним из распространенных изменений в ми-

ных аварий и при возможном радиационном тер-

тохондриальном геноме являются делеции

роризме.

структурные перестройки, приводящие к утрате

части генов [5]. Превышение порогового уровня

Ранее нами проводились исследования влия-

молекул мтДНК с делециями приводит к дефици-

ния преконцептивного облучения либо самцов,

ту белков цепи переноса электронов, повышен-

либо самок мышей на ядерный геном их потом-

ной генерации активных форм кислорода и азота

ства. Нам удалось обнаружить повышенный уро-

и окислительному стрессу, митохондриальной

вень нестабильности ядерного генома в тканях

дисфункции [6,7]. Наличие делеции 4977 п.о.,

(периферической крови, селезенке, кончике хво-

встречающейся в тканях человека наиболее ча-

ста и головном мозге) потомства самок не только

сто, рассматривают как индикатор повреждения

в сравнении с контролем, но и в сравнении с

мтДНК соматических клеток [8]. После воздей-

потомством облученных самцов [1,2]. По сравне-

ствия ионизирующих излучений в клетках также

нию с другими клетками мтДНК в ооцитах -

происходит формирование делеций мтДНК [9-

крупная мишень для радиационного воздей-

11]. Поскольку воздействие генотоксических

ствия, поскольку в ооците млекопитающих мито-

факторов на ооциты может вызвать наследуемую

хондрии занимают значительный объем, включая

нестабильность не только ядерного, но и мито-

от 150 тысяч до более 1 млн копий митохондри-

хондриального генома, мы попытались оценить

альной ДНК (мтДНК), по одной-две копии на од-

влияние ионизирующей радиации на митохон-

Сокращения: мтДНК - митохондриальная ДНК.

дриальный геном соматических клеток (клеток

668

ДЕЛЕЦИЯ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК

669

Таблица 1. Xаpактеpиcтика групп мышей-потомков, рожденных до и после облучения самок-родителей

Преконцептивные

Пол потомков

Количество

дозы внешнего

Среднее количество

потомков,

рентгеновского облучения

потомков в помете, шт.*

самок-родителей, Гр

самка, %

самец, %

9.7 ± 0.3

0.5

11.3 ± 1.75

7.4 ± 0.35

8 ± 1.38

Примечание. * Среднее арифметическое значение на группу и стандартная ошибка среднего.

головного мозга, селезенки и перферической

кровь, селезенку, кончик хвоста и головной

крови) у потомков (F₁) самок мышей, подвергну-

мозг). Все манипуляции с животными проводили

тых воздействию острого рентгеновского излуче-

согласно рекомендациям Комиссии по биологи-

ния в дозах 0,5 и 2 Гр. Последствия воздействия

ческой безопасности и биоэтике ИТЭБ РАН. Вы-

ионизирующей радиации оценивали по доле по-

деление ДНК проводили методом фенольной де-

томков этих самок, имеющих делецию мтДНК

протеинизации после обработки тканевых лиза-

размером 4974 п.о. в клетках тканей головного

тов протеиназой К и РНКазой [2].

мозга, селезенки и периферической крови.

Для проведения данного исследования ис-

пользовали образцы общей ДНК, полученные из

периферической крови, головного мозга и селе-

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

зенки потомков самок мышей, которые были об-

В эксперименте были использованы двухме-

лучены в дозах 0,5 и 2 Гр и дали по два помета.

сячные мыши линии BALB/c из питомника экс-

Краткая характеристика групп животных в вы-

периментальных животных филиала Института

бранных семьях представлена в табл. 1.

биоорганической химии РАН (Пущино). Срав-

Полимеразная цепная реакция. Фрагмент мито-

нивали два потомства (F₁), рожденные от одних и

хондриального генома амплифицировали с ком-

тех же родительских пар животных (поколения

бинацией праймеров PL69

(5'-AATTACAG-

F₀). Первое потомство получали до облучения са-

GCTTCCGACACAA-3') и PL70 (5'-GGAGATTG-

мок, второе - после воздействия на самок радиа-

GTTGATGTATGAG-3')

[12].

Реакцию

ции. Первое потомство, рожденное необлучен-

амплификации выполняли на приборе «Терцик»

ными самками, рассматривали в качестве «кон-

(«ДНК Технология», Россия), она состояла из

трольного». Через

40 суток после рождения

35 циклов и проводилась при следующих услови-

первого потомства самок подвергали воздей-

ях: денатурация при 94°С в течение 40 с, отжиг

ствию рентгеновского излучения в дозах 0,5, 1 и

при 50°С - 20 с и элонгация при 72°С - 1 мин.

2 Гр при мощности экспозиционной дозы

Предварительная денатурация при 94°С - 4 мин,

0,1 Гр/c на установке РУМ-13 (напряжение

завершающий синтез - 10 мин при 72°C. Продук-

200 кВ, сила тока 8 мА, фильтры 1,0 мм Cu и

ты амплификации разделяли электрофорезом в

1,0 мм Al, фокусное расстояние 74 см) в ЦКП

2%-м агарозном геле, содержащем бромистый

«Источники излучений» ИБК РАН. Затем самки

этидий, и документировали с помощью гель-до-

спаривались с теми же самцами, от которых было

кументиpующей cиcтемы DocPrint (Vilber Lour-

получено первое потомство [2].

mat Systems, Фpанция).

Потомство, рожденное до и после облучения

Статистическая обработка результатов. Для

родителей, по достижении четырехнедельного

сравнения долей потомков с делециями мтДНК в

возраста забивали путем дислокации шейных по-

группах использовали двухсторонний точный

звонков и собирали образцы тканей (цельную

критерий Фишера (F) при уровне значимости

БИОФИЗИКА том 64

№ 4

2019

670

ЛОМАЕВА и др.

Пример электрофореграммы продуктов ПЦР при определении делеции мтДНК 4974 п.о.: дорожки 1 и 6 - мтДНК с

делецией; дорожки 2-5 и 7-9 - мтДНК без делеции; M - маркер молекулярного веса ДНК (pUC Mix Marker 8, Fer-

mentas, США).

p ≤ 0,05. Его расчет выполнен в программе IBM

родителей. Образцы общей ДНК, полученные из

SPSS Statistic 19 (IBM Software, США).

периферической крови, головного мозга и селе-

зенки потомков, были исследованы на наличие

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

делеции мтДНК размером 4974 п.о. Для выявле-

ния делеции был использован метод ПЦР протя-

В работе были определены доли мышей-по-

томков, имеющих делецию мтДНК, в группах

женных фрагментов и комбинация праймеров

мышей, рожденных до и после облучения самок-

PL69 и PL70 [12]. Если в исследуемом образце

Таблица 2. Доля мышей-потомков, имеющих делецию 4974 п.о., рожденных до и после облучения самок-роди-

телей

Преконцептивные

Доля потомков с делецией в тканях, %

дозы внешнего

рентгеновского облучения

Мозг

Селезенка

Кровь

самок-родителей, Гр

20.7

0.5

17.6

11.8

23.3

F_0-0.5*

р = 1.000

р = 0.492

р = 1.000

24.3

16.2

8.1

22.5

17.5

F_0-2

р = 1.000

р = 0.073

р = 0.314

Примечание. * Fn-m - двухсторонний точный критерий Фишера; р - достигнутый уровень значимости по критерию F.

БИОФИЗИКА том 64

№ 4

2019

ДЕЛЕЦИЯ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК

671

Таблица 3. Доля мышей-потомков разного пола, имеющих делецию 4974 п.о., рожденных до и после облучения

самок-родителей

Доля потомков - самок и самцов с делецией в тканях, %

Преконцептивные

дозы внешнего

мозг

селезенка

кровь

рентгеновского облучения

самок-родителей, Гр

♀

♂

♀

♂

♀

♂

66.7

33.3

F_0-0*

р = 0.669

р = 1.000

р = 0.669

0.5

37.5

62.5

F_0.5-0.5

р = 0.669

р = 0.417

55.6

44.4

66.7

33.3

66.7

F_0-0

р = 0.714

р = 0.405

р = 1.000

33.3

66.7

28.6

71.4

42.9

57.1

F_2-2

р =0.707

р = 0.315

р = 1.000

Примечание. * Fn-m - двухсторонний точный критерий Фишера; р - достигнутый уровень значимости по критерию F.

ДНК содержались молекулы мтДНК с данной де-

го генома. Причиной отсутствия изменений в до-

лецией, то синтезировался фрагмент размером

ле потомков с делециями после облучения самок-

445 п.о., определяемый электрофоретически (ри-

родителей в дозе 2 Гр может быть элиминация

сунок).

ооцитов, содержащих значительное количество

Только в группе животных, рожденных самка-

поврежденных копий мтДНК [13]. Возможно, в

ми после облучения в дозе 2 Гр, наблюдается тен-

поврежденных клетках дисфункциональные ми-

денеция к увеличению доли потомков с делеция-

тохондрии, содержащие мтДНК с делециями,

ми в клетках ткани селезенки (p = 0,073). Разли-

удаляются по механизму митофагии [14]. Дефи-

чие в долях потомков с делециями в этой ткани

цит АТФ вследствие повреждений в мтДНК мог

после облучения самок-родителей в дозе 0,5 Гр по

оказаться критическим для выживания и разви-

сравнению с контрольным потомством статисти-

тия эмбрионов [15]. Остаются жизнеспособными

чески не значимы. Не выявлено статистически

значимых изменений в долях потомков с делеци-

те, кто имеет мало мутантных копий мтДНК. За-

ями в тканях мозга и крови до и после облучения

щитой от материнской передачи мтДНК с мута-

самок-родителей в дозах 0,5 и 2 Гр (табл. 2).

циями от одного поколения другому также может

быть эффект «узкого места» (genetic bottleneck).

Облучение самок в дозе 0,5 Гр не привело к

Возможная роль механизмов действия митохон-

возрастанию доли их потомков с делециями, воз-

можно, потому, что эта доза было недостаточна

дриального «генетического узкого места» обсуж-

для индукции нестабильности митохондриально-

дается в литературе [16].

БИОФИЗИКА том 64

№ 4

2019

672

ЛОМАЕВА и др.

Делеция мтДНК размером 4974 п.о. была вы-

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

явлена во всех исследованных нами тканях. У мы-

G. V. Vasil'eva, V. G. Bezlepkin, M. G. Lomaeva, et al.,

шей, как и у людей, делеции мтДНК встречаются

Mutat. Res. 485 (2), 133 (2001).

в разных тканях, и их количество увеличивается

M. G. Lomaeva, G. V. Vasil'eva, L. A. Fomenko, et al.,

по мере старения организма [12,17-19]. Делеции

Rus. J. Genetics 47 (10), 1221 (2011).

мтДНК у млекопитающих накапливаются в пост-

митотических тканях, таких как головной мозг,

M. V. Cannon, K. Takeda, and C. A. Pinkert, Reprod.

печень, сердце и скелетные мышцы, характеризу-

Med. Biol. 10, 251 (2011).

ющихся более низкой скоростью деления клеток

G. S. Shadel and D. A. Clayton, Annu. Rev. Biochem.

и более высоким уровнем энергетического обме-

66, 409 (1997).

на [20]. Предполагается также, что «митотически

J. M. Cooper, V. M. Mann, and A. H. Schapira, J.

активные» ткани обладают способностью элими-

NeuroSci. 113 (1), 91 (1992).

нировать клетки с мутациями мтДНК в течение

А. И. Газиев., Радиац. биол. радиоэкол. 53 (2), 117

жизни, тогда как в «постмитотических» тканях

(2013).

такие клетки не удаляются и могут вместо этого

способствовать накоплению мутантных копий

W. W. Kam and R. B. Banati, Free Radic. Biol. Medic.

мтДНК [21].

65, 607 (2013).

A. Quigley, K. Reardon, R. Kapsa, et al., J. Clin. Neu-

Ранее нами было показано различие проявле-

romusc. Dis. 3 (2), 77 (2001).

ния нестабильности ядерного генома у потомков

N. Kubota, J. Hayashi, T. Inada, et al., Radiat. Res. 148

разного пола, рожденных от самок мышей, под-

(4), 395 (1997).

вергшихся воздействию ионизирующих излуче-

ний [22]. У самок-потомков, рожденных самка-

10.

S. Prithivirajsingh, M. D. Story, S. A. Bergh, et al.,

ми, облученными в дозе 2 Гр, уровень полимор-

FEBS Lett. 571 (1-3), 227 (2004).

физма яДНК был выше по сравнению с самцами-

11.

V. N. Antipova, L. V. Malakhova, and V. G. Bezlepkin,

потомками. Поэтому представлялось интерес-

Biofizika 56 (3), 439 (2011).

ным оценить влияние ионизирующей радиации

12.

S. M. Tanhauser and P. J. Laipis, J. Biol. Chem. 270

на митохондриальный геном потомков разного

(42), 24769 (1995).

пола, рожденных от облученных самок-роди-

телей.

13.

W. Fan, K. G. Waymire, N. Narula, et al., Science 319

(5865), 958 (2008).

Как видно из данных, представленных в

14.

A. L. Boudoures, J. Saben, A. Drury, et al., Dev. Biol.

табл. 3, ни в контрольных, ни в облученных груп-

426 (1), 126 (2017).

пах не было выявлено статистически значимых

15.

S. Chappel, Obstet. Gynecol. Int. AD 183024 (2013).

различий между долями потомков-самок и по-

томков-самцов с делецией мтДНК.

16.

H. Zhang, S. P. Burr, and P. F. Chinnery, Essays Bio-

chem. 62 (3), 225 (2018).

Отсутствие ассоциации делеций мтДНК с по-

17.

A. F. Phillips, A. R. Millet, M. Tigano, et al., Mol. Cell.

лом показано и при исследовании делеций в тка-

65 (3), 527 (2017).

нях людей [23,24].

18.

N. Kazachkova, A. Ramos, C. Santos, et al., Aging Dis.

Таким образом, результаты исследования, вы-

4 (6), 337 (2013).

полненного с использованием такой адекватной

19.

P. M. Eimon, S. S. Chung, C. M. Lee, et al., Dev.

модели, как сравнение потомства от одной и той

Genet. 18 (2), 107 (1996).

же родительской пары до и после облучения в

20. A. Trifunovic, A. Wredenberg, M. Falkenberg, et al.,

условиях строгого дозиметрического контроля,

Nature 429 (6990), 417 (2004).

показали, что воздействие рентгеновского излу-

чения в дозах 0,5 и 2 Гр на самок-мышей линии

21. K. Krjutškov, M. Koltšina, K. Grand, et al., Curr.

BALB\c не приводит к увеличению доли их по-

Genet. 60 (1), 11 (2014).

томков с делецией мтДНК 4974 п.о. в клетках тка-

22. М. Г. Ломаева, Л. А. Фоменко, Г. В. Васильева и

ней головного мозга, селезенки и перифериче-

др., Радиац. биол. радиоэкол. 56 (2), 149 (2016).

ской крови.

23. S. Ye. Zhang, A. A. Sayer, et al., Biochem. Soc. Trans.

31 (2), 444 (2003).

Работа выполнена при частичной поддержке

Российского фонда фундаментальных исследова-

24. X. T. Zhao, J. B. Feng, Y. W. Li, et al., Biomed. Envi-

ний (проект № 03-04-48274).

ron. Sci. 25 (5), 533 (2012).

БИОФИЗИКА том 64

№ 4

2019