БИОФИЗИКА, 2019, том 64, № 4, с. 674-685

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОФИЗИКА

УДК 577.357.464.23

ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ И МЕХАНИЗМЫ

ФОТОТОКСИЧНОСТИ ПРОИЗВОДНЫХ ХЛОРИНА е₆

И ИХ ЛИПОСОМАЛЬНЫХ ФОРМ

Т.В. Шман*, М.В. Белевцев*, В.П. Зорин

Белорусский государственный университет,

220030 Минск, проспект Независимости, 4, Республика Беларусь

E-mail: zorinate@mail.ru

*Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии,

223053, д. Боровляны Минской области, ул. Фрунзенская, 43, Республика Беларусь

Поступила в редакцию 16.01.2019 г.

После доработки 16.01.2019 г.

Принята к публикации 05.03.2019 г.

Методами конфокальной микроскопии и колокализационного анализа с использованием коэффи-

циентов корреляции Пирсона показано, что этерифицированные производные хлорина е₆ и их ли-

посомальные формы локализуются преимущественно в эндоплазматическом ретикулуме, комплек-

се Гольджи, митохондриях клетки и имеют низкий уровень локализации в лизосомах. Фармаколо-

гические формы введения фотосенсибилизаторов существенно влияют на уровень и кинетику

накопления их в клетках, но не оказывают значительного влияния на внутриклеточную локализа-

цию производных хлорина е₆. Установлены отличия в активности и механизмах действия для про-

изводных хлорина е₆ и их липосомальных форм по сравнению с хлорином е₆ при фотосенсибилизи-

рованном воздействии на клетки К562. Предполагается, что различия в механизмах повреждения

клеток в значительной степени определяются особенностями локализации фотосенсибилизаторов.

Ключевые слова: производные хлорина е₆, липосомальные формы, внутриклеточная локализация,

цитотоксичность, апоптоз.

DOI: 10.1134/S0006302919040057

структуры, в которых он накапливается, поэтому

Фотодинамическое воздействие на клетки и

внутриклеточная локализация ФС имеет суще-

ткани в присутствии фотосенсибилизаторов

ственное значение при определении механизмов

(ФС) происходит с участием радикальных реак-

повреждений клеток.

ций и активных форм кислорода. В случае ФС

Накопление и распределение ФС в различных

порфиринового ряда синглетный кислород (¹О₂)

клеточных, тканевых системах в решающей сте-

является основным агентом окислительных реак-

пени определяются их физико-химическими и

ций при фотосенсибилизированных процессах

структурными характеристиками. Наличие кати-

[1,2]. Эффективность фотоповреждения биоло-

онных или анионных групп, симметрия располо-

гических систем непосредственно связана с лока-

жения боковых заместителей в порфириновой

лизацией ФС, поскольку время жизни ¹О₂неве-

молекуле существенным образом сказываются на

лико (порядка 0,03-0,04 мкс) и длина свободного

взаимодействии ФС с клеточными, тканевыми

пробега молекулы за это время не превышает

структурами и определяют процессы их локали-

0,1 мкм [1,3]. Первичными мишенями окисли-

зации и накопления [4,5].

тельного действия ФС являются те клеточные

Ранее было показано, что хлорин е₆ (Хл е₆) и

его этерифицированные производные (ПХл е₆) -

Сокращения: ФС - фотосенсибилизаторы, Хл е₆ - хлорин

е6, ПХл е₆ - этерифицированные производные Хл е₆,

диметиловый и триметиловый эфиры хлорина е₆

ДМЭ - диметиловый эфир хлорина е₆,

ТМЭ

^- (ДМЭ и ТМЭ соответственно) - могут быть ис-

триметиловый эфир хлорина е₆, ЛФ - липосомальные

пользованы для различных приложений техники

формы, ДМФХ - димеристоилфосфатидилхолин, ЭСТ -

эмбриональная сыворотка телят, ККП - коэффициент

фотодинамической терапии, включая лечение

корреляции Пирсона, CMXRos - хлорметил-Х-розамин.

онкологических заболеваний, сосудистых пато-

674

ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ И МЕХАНИЗМЫ

675

логий, избирательное повреждение клеток с по-

вышенным пролиферативным статусом

[5,6].

Низкая растворимость данных соединений в вод-

ной среде обуславливает необходимость приме-

нения для их введения специальных носителей.

Наноразмерные липидные везикулы являются

наиболее популярной фармакологической фор-

мой для введения неполярных лекарственных со-

единений [7,8]. Однако использование липосо-

мальных форм (ЛФ) для введения ФС требует

проведения дополнительных исследований, так

как характеристики препарата в этом случае зави-

сят не только от свойств самого ФС, но и от

структурных характеристик наноразмерных ли-

пидных везикул.

В данной работе исследованы характеристики

взаимодействия хлоринов с клетками в культуре и

изучено влияния на эти процессы особенностей

химической структуры и форм введения сенсиби-

лизатора. Методами конфокальной флуоресцент-

Рис.

1. Структурные формулы хлорина е₆ и его

ной микроскопии и цитометрии изучены локали-

производных: для Хл е₆ R₁ = R₂ = R₃ = H; для ДМЭ

зация и накопление в культуральных клетках

R₁ = Н, R₂ = R₃ = СH₃; для ТМЭ R₁ = R₂ = R₃ = СH₃.

К562 хлорина е₆, его этерифицированных произ-

водных, введенных в суспензию клеток в органи-

флуориметра SFL-1211А (SOLAR, Беларусь) и

ческих растворителях и в составе ЛФ. Проведен

спектрофотометра PV1251C ( SOLAR, Беларусь).

анализ механизмов повреждения клеток, фото-

сенсибилизированных хлоринами и их липосо-

Концентрацию Хл е₆ в растворе ацетона опре-

мальными формами.

деляли по величине оптической плотности на

длине волны 664 нм, коэффициент молярной

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

экстинкции 50000 М^-1 см^-1л. Концентрацию ДМЭ

и ТМЭ определяли на длине волны 666 нм, коэф-

Фотосенсибилизаторы и их липосомальные фор-

фициент молярной экстинкции 54000 М^-1 см^-1л.

мы. Синтез хлоринов проводили по модифициро-

Для определения концентрации ФС, включенно-

ванной методике [9]. При синтезе этерифициро-

го в липидные везикулы, липосомы предвари-

ванных прозводных Хл е₆, ДМЭ и ТМЭ, в каче-

тельно разрушали добавлением

0,2%-го ней-

стве исходных субстанций использовали

трального детергента тритон X-100 (Panreac, Ис-

феофитин или Хл е₆. Чистоту Хл е₆ и его произ-

пания).

водных контролировали хроматографически.

Клеточные культуры. В работе были использо-

Структурные формулы исследуемых хлоринов

ваны клетки лейкемической линии миелоидного

представлены на рис. 1.

происхождения К562 (Коллекция клеточных

Липосомы, нагруженные хлоринами в опреде-

культур РНПЦ детской онкологии, гематологии

ленном соотношении липид : пигмент, готовили

и иммунологии). Суспензии клеток культивиро-

из синтетического насыщенного липида димири-

вали в среде RPMI-1640 (Sigma, США). При ис-

стоилфосфатидилхолина (ДМФХ), производства

следовании клетки отмывали и переводили в сре-

Sigma (США), на ручном экструдере Avanti Mini-

ду с 5%-м содержанием эмбриональной сыворот-

Extruder (метод Бенгема), используя поликарбо-

ки телят (ЭСТ) (Sigma, США).

натные мембранные фильтры

«Nuclepore^®»

Для исключения влияния агрегации спирто-

(Whatman, Великобритания) с порами 100 нм.

вые растворы ФС предварительно инкубировали

Фотосенсибилизаторы вводили в липидные вези-

в среде RPMI-1640 с 5%-м содержанием ЭСТ. В

кулы на стадии получения липидной пленки. Вы-

пробы, содержащие ЭСТ, добавляли Хл е₆ или его

сушенную липидную пленку гидратировали фос-

производные в растворах в концентрациях от

фатно-солевым буфером Дюльбекко (рН 7,4) при

постоянном перемешивании. Степень включе-

5 · 10^-6М до 1 ∙ 10^-5 М и инкубировали в термо-

ния хлоринов в липидные везикулы составляла

стате (37°С) в течение 1 ч. Клетки К562 в концен-

более 90% для ДМЭ и более 85% для ТМЭ.

трации 1 · 10⁶ клеток/мл помещали в подготов-

Спектрально-люминесцентные и абсорбционные

ленные пробы и икубировали при 37°С в течение

методы исследования. Спектральные характери-

необходимого для накопления ФС времени, за-

стики хлоринов исследовали с помощью спектро-

тем трижды отмывали средой от несвязавшегося

БИОФИЗИКА том 64

№ 4

2019

676

ЗОРИНА и др.

ФС. Липосомальные формы добавляли непо-

Цитофлуориметрический анализ. Определение

средственно к клеткам в среде RPMI-1640 с 5%

механизмов повреждения клеток. Изменения в

ЭСТ и проводили инкубирование по той же схе-

клетках, индуцированные фотодинамическим

ме. Затем клетки осаждали центрифугированием

воздействием, анализировали с применением ме-

и разводили свежей средой культивирования до

тодов проточной цитофлуориметрии (цитофлуо-

концентрации 5 · 10⁶ клеток/мл.

риметр FC 500, Beckman Coulter, США). Средние

значения интенсивности флуоресценции клеточ-

Конфокальная лазерная сканирующая микро-

ных популяций в каждом временном интервале

скопия. Определение локализации хлоринов в клет-

рассчитывали с помощью статистического пакета

ках. Прижизненный анализ локализации ФС в

программ CXP (Beckman Coulter, США).

культуральных клетках К562 проводили на лазер-

ном сканирующем конфокальном флуоресцент-

Структурные изменения в клетках при фото-

ном микроскопе TCS SPE (Leica, Германия).

сенсибилизации оценивали на основании анали-

Клетки наносили на стекла SuperFrost и накрыва-

за распределения клеток по интенсивности пря-

ли покровными стеклами толщиной 0,17 мм. Ис-

мого и бокового светорассеяния. При исследова-

пользовали иммерсионный объектив с увеличе-

нии динамики апоптоза анализ светорассеяния

нием 63× (Leica, Германия). Флуоресценцию ФС

совмещали с изменениями флуоресценции флуо-

возбуждали аргоновым лазером (λ = 488 нм), ре-

рохрома иодида пропидиума, связывающегося с

гистрацию флуоресценции осуществляли в диа-

ДНК, а также с изменениями флуоресценции ли-

пазоне 620-700 нм.

пофильного флуорохрома Mito Tracker® Red -

Для идентификации внутриклеточного рас-

хлорметил-Х-розамина (CMXRos), который ис-

пределения хлоринов использовали технику ко-

пользуется для оценки трансмембранного потен-

локализации. Накопление ФС в клетках прово-

циала митохондрий.

дили по схеме, указанной выше, затем клетки от-

мывали и ресуспендировали в среде RPMI-1640 c

Для оценки механизмов фотосенсибилизиро-

конечной концентрацией 2 · 10⁶ клеток/мл. Далее

ванного воздействия пробы готовили следующим

клетки инкубировали с колокализаторами со-

образом. Клетки К562 инкубировали в средах с

гласно стандартным протоколам для определения

различным содержанием ПХл е₆или их ЛФ в те-

внутриклеточной локализации исследованных

чение 1 ч (для ТМЭ - 3 ч) при температуре 37°С,

ФС. Были использованы флуоресцентные зонды,

дважды отмывали от несвязавшегося ФС, ресус-

обладающие высокой избирательностью накоп-

пендировали в свежей среде и облучали диодным

ления в органеллах: митохондриальный зонд Mito

лазером (λ = 660 нм) с регулируемой мощностью

Traker® Green FM (λ_возб = 490 нм, λ_рег = 511 нм) в

облучения (ИЛМ-660-0,5; «ЛЭМТ», Беларусь).

Фотооблучение проводили при комнатной тем-

концентрации

4·10^-7 М; лизосомальный зонд

пературе в течение 20 с. Конечная световая доза

Lyso Traker® Green DND-26 (λвозб = 504 нм,

облучения составляла 0,4 Дж/см². Затем клетки

λ_рег = 511 нм) в концентрации 1 · 10^-7М; колока-

помещали в термостат при температуре 37°С. Го-

лизаторы: для комплекса Гольджи

- NBD-

товили две серии образцов: аликвоты суспензии

BODYPY-Labeled Sphingolipids (λ_возб = 505 нм,

клеток отбирали через определенные промежут-

λ_рег = 511 нм) в концентрации 5 · 10^-6 М; для эн-

ки времени - 30 и 180 мин - для определения

доплазматического ретикулума- ER Traker® TM

числа поврежденных клеток (некроз или поздний

Green (λ_возб = 504 нм, λ_рег = 511 нм) в концентра-

апоптоз) в тесте с иодидом пропидиума (конеч-

ная концентрация 1 мкг/мл), а также в тесте с

ции 1 · 10^-6 М.

CMXRos (конечная концентрация 150 нМ) - для

Флуоресценцию колокализаторов исследова-

оценки ранних апоптотических изменений. В об-

ли в канале, регистрирующем излучение в диапа-

разцы клеток перед измерением на цитофлуори-

зоне 505-550 нм. В другом канале (620-700 нм)

метре вводили иодид пропидиума за 5 мин, CMX-

регистрировали флуоресценцию ФС. Наложение

Ros - за 25 мин. Время инкубирования с флуоро-

изображений двух каналов позволило сравнить

хромами учитывали в общем времени

характер распределения зонда и исследуемого

инкубирования образцов. При соблюдении тем-

ФС в клетке. Количественный анализ степени

нового режима добавление CMXRos в концентра-

колокализации осуществляли с использованием

ции до 250 нМ не приводило к дополнительной

коэффициента корреляции Пирсона (ККП) со-

гибели клеток.

гласно работе [10].

Для компьютерной обработки полученных

При измерении на цитофлуориметре уровня

флуоресцентных изображений клеток и количе-

флуоресценции красителей использовали узко-

ственного анализа параметров накопления и рас-

полосный оптический фильтр на 620 нм. Длина

пределения ФС в клетках использовали програм-

волны возбуждения флуоресценции - 488 нм (од-

му ImageJ.

нофазный аргоновый лазер).

БИОФИЗИКА том 64

№ 4

2019

ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ И МЕХАНИЗМЫ

677

Определение темновой цитотоксичности ФС

ДМЭ и ТМЭ в составе ЛФ, приготовленных экс-

проводили с помощью МТТ-теста по методике,

трузионным способом, практически не изменя-

описанной в работе [11].

лись при увеличении степени нагрузки в диапа-

зоне 1:1000 -1:100.

Из приведенных данных следует, что фотофи-

РЕЗУЛЬТАТЫ

зические и спектрально-флуоресцентные харак-

Анализ процессов локализации и накопления

теристики Хл е₆и его этерифицированных произ-

исследованных ФС осуществляли на основании

водных в составе липосом при связывании с мем-

определения их флуоресцентных характеристик в

бранными структурами близки и могут быть

клетках.

использованы для оценки накопления и распре-

Фотофизические и спектрально-флуоресцент-

деления ФС в клетке.

ные характеристики хлоринов. Ранее было показа-

Внутриклеточная локализация и накопление

но, что Хл е₆ и его этерифицированные производ-

хлоринов при введении в растворах и в составе ли-

ные в мономерном состоянии в растворах орга-

посомальных форм. При исследовании локализа-

нических растворителей обладают близкими

ции и накопления ФС анализировали распреде-

спектрально-флуоресцентными свойствами [12].

ление интенсивности их флуоресценции в куль-

Положения максимумов спектров поглощения и

туральных клетках К562. Для Хл е₆ в первые

флуоресценции исследуемых хлоринов в моно-

минуты инкубирования наблюдалось флуорес-

мерной форме различаются на 1-2 нм. Модифи-

центное свечение преимущественно в составе

кация боковых заместителей значительно изме-

плазматической мембраны, лишь через

10-

няет полярные свойства молекул хлоринов, что

12 мин окрашивания в цитоплазме регистрирова-

приводит к снижению их растворимости и, как

ли уровни свечения Хл е₆, превышающие авто-

следствие, к агрегации в водных растворах. Ре-

флуоресценцию клеток. Распределение Хл е₆ от-

зультатом этого являются различия параметров

носительно равномерно по цитоплазме. В случае

флуоресценции Хл е₆ и его этерифицированных

ДМЭ и ТМЭ интенсивность флуоресценции кле-

производных в водных растворах. Так, если флу-

ток была заметно выше уже на малых временах

оресцентные характеристики в органических рас-

инкубирования. Кроме того, существенно отли-

творителях для Хл е₆ и его производных близки,

чался характер внутриклеточного распределения:

то при переводе хлоринов в фосфатно-солевой

в случае ТМЭ выделялись отдельные сайты, име-

буфер величины их квантовых выходов и времени

ющие интенсивность флуоресценции на порядок

жизни флуоресценции существенно различают-

выше, чем в среднем по цитоплазме. Для ДМЭ

ся. Квантовый выход флуоресценции для Хл е₆

наблюдалась наиболее высокая скорость накоп-

при переводе в водную среду изменялся с 19,2% в

ления, яркая флуоресценция и относительно рав-

ацетоне до 5,5% в фосфатно-солевом буфере, для

номерное распределение ФС по цитоплазме

ДМЭ и ТМЭ с 18,0 и 18,2 % в ацетоне до 1,3 и 1,1 %

клетки (рис. 3).

в фосфатно-солевом буфере соответственно.

Представляет интерес сравнение процессов

Время жизни флуоресценции (τ) для Хл е_6, ДМЭ,

накопления и локализации этерифицированных

ТМЭ и его производных в ацетоне - 5,32 нс,

ПХл е₆ в клетках при введении их в растворе и в

5,21 нс, 5,23 нс соответственно. При переводе в

ЛФ. На рис. 4 представлены изображения клеток

фосфатно-солевой буфер величина τ для Хл е₆ со-

К562 в свете флуоресценции после окрашивания

ставляла 4,53 нс, для ДМЭ - 2,4 нс, для ТМЭ ве-

ДМЭ, ТМЭ и комплексами ДМЭ-ДМФХ и

личина τ не была определена [12-14].

ТМЭ-ДМФХ. Из рисунка видно, что ДМЭ и

ТМЭ, введенные в липосомах, локализовались,

Включение ПХл е₆ в липосомы позволяет со-

как и свободные пигменты, в плазматической

хранить мономерное состояние ФС в водной сре-

мембране клеток, в цитоплазме, в мембранных

де. Для ПХл е_6,включенных в состав липидных

структурах. Для образцов с 30-минутной инкуба-

везикул, квантовый выход флуоресценции и вре-

цией наблюдается более высокий уровень флуо-

мя жизни флуоресценции близки к максимально-

ресценции для ДМЭ и липосомальных форм

му значению, характерному для растворов пиг-

ДМЭ по сравнению с ТМЭ и его липосомальны-

ментов в органических растворителях [12]. Так,

ми формами. Распределение ЛФ ДМЭ - относи-

для липосомальных форм ДМЭ и ТМЭ кванто-

тельно равномерно по цитоплазме. Характер рас-

вый выход флуоресценции составлял 16,9 % и

пределения липосомальных форм ТМЭ по телу

17,1 %, время жизни флуоресценции - 5,12 нс и

клетки существенно отличался. Так же, как и для

5,22 нс соответственно. Не наблюдалось суще-

ТМЭ, введенного в растворе, для ТМЭ в ЛФ вы-

ственных различий в характере спектров элек-

делялись отдельные сайты, имеющие интенсив-

тронного поглощения и флуоресценции ДМЭ и

ность флуоресценции значительно выше, чем в

ТМЭ в этаноле и в липосомах из ДМФХ (рис. 2).

среднем по цитоплазме. Через 90 мин инкубиро-

Спектрально-флуоресцентные характеристики

вания существенно увеличивалась интенсив-

БИОФИЗИКА том 64

№ 4

2019

678

ЗОРИНА и др.

Рис. 2. Спектры электронного поглощения ДМЭ (а) и ТМЭ (б) и спектры флуоресценции ДМЭ (в) и ТМЭ (г) в этаноле

и в экструзионных липосомах из ДМФХ в растворе фосфатно-солевого буфера. Концентрация ДМЭ и ТМЭ

для спектров электронного поглощения равна 5 ∙ 10^-6 М; концентрация ДМЭ и ТМЭ для спектров флуоресценции -

2 ∙ 10^-7 М. Соотношение ДМЭ (ТМЭ) : ДМФХ = 1 : 40.

ность флуоресценции в пробах с ТМЭ, однако

флуоресценции исследованных ФС и флуорес-

уровень интенсивности флуоресценции оставал-

ценции субклеточных колокализаторов - эндо-

ся более низким по сравнению с пробами с ДМЭ.

плазматического ретикулума, митохондриально-

Следует отметить, что как для исследованных

го, комплекса Гольджи и лизосомального зондов.

хлоринов, так и для их ЛФ флуоресценция в обла-

В качестве примера на рис. 5 представлены изоб-

сти ядра клетки отсутствовала.

ражения клеток К562 при окрашивании ДМЭ

(клетки в свете флуоресценции ДМЭ), изображе-

Анализ интегральной флуоресценции единич-

ние клеток в свете флуоресценции колокализато-

ных клеток, показал, что при инкубировании в

ров и комбинированное свечение клеток в ре-

течение 2 ч в одинаковых условиях исследован-

зультате наложения двух каналов регистрации

ные ФС, введенные в суспензию клеток К562 в

флуоресценции. Внутриклеточное распределе-

растворах и в липосомах из ДМФХ, имеют раз-

ние флуоресценции ДМЭ умеренно коррелиро-

личный уровень накопления в клетках (табл. 1).

вало с распределением флуоресценции зондов

С использованием колокализаторов клеточ-

эндоплазматического ретикулума и комплекса

ных органелл была проведена конкретизация

Гольджи и в меньшей степени совпадало с флуо-

внутриклеточной локализации хлоринов и их ли-

ресценцией митохондриального зонда, что ука-

посомальных форм. С этой целью проводилось

зывает на возможную локализацию ДМЭ в этих

сопоставление распределения в клетках К562

органеллах. Следует отметить, что при этом прак-

БИОФИЗИКА том 64

№ 4

2019

ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ И МЕХАНИЗМЫ

679

Рис. 3. Изображения клеток К562 в свете флуоресценции хлоринов (инвертированы): (а) - Хл е₆; (б) - ДМЭ; (в) - ТМЭ.

Концентрация пигмента 5 · 10^-6 М; концентрация ЭСТ в среде инкубирования 5%, время инкубирования - 60 мин. Сре-

зы клеток представлены для Z = 10 .Число срезов Z = 20, шаг - 1 мкм. Масштабные отрезки на всех фотографиях - 5 мкм.

тически отсутствовало перекрытие областей флу-

Уровень колокализации Хл е₆ с митохондрия-

оресценции ДМЭ и лизотрэкера.

ми имеет умеренную корреляцию (ККП порядка

0,5), при этом определен высокий уровень его ко-

Для оценки значимости совпадения локализа-

локализации с зондами эндоплазматического ре-

ции хлоринов и колокализаторов в отдельных ор-

тикулума и комплекса Гольджи (ККП > 0,7). В

ганеллах были использованы критерии Пирсона.

наименьшей степени Хл е₆ накапливается в лизо-

Значения коэффициентов корреляции Пирсона,

сомах (ККП = 0,3-0,4).

количественно характеризующие степень коло-

кализации исследованных хлоринов, их ЛФ и

Из полученных данных видно, что этерифици-

специфических маркеров органелл в клетках

рованные ПХл е₆ и их липосомальные формы

К562, приведены в табл. 2.

имеют однотипное распределение: области флуо-

Таблица 1. Накопление в клетках К562 Хл е₆ и ПХл е₆, введенных в суспензию клеток в растворе и в составе ли-

посом

Фотосенсибилизатор

Хл е₆

ДМЭ

ТМЭ

ДМЭ-ДМФХ

ТМЭ-ДМФХ

Интегральная интенсивность

72.6 ± 6.0

610.4 ± 24.3

340.4 ± 16.7

320.2 ± 16.1

170.4 ± 12.2

флуоресценции

Примечание. Концентрация клеток 1 · 10⁶/мл; концентрация хлоринов 5 · 10^-6 М; концентрация ЭСТ в среде инкубирования

5%. Время инкубирования 120 мин; температура инкубирования 37°С. Соотношение пигмент : ДМФХ = 1 : 40. Ошибка рас-

считана по трем идентичным экспериментам.

Таблица 2. Значения коэффициентов корреляции Пирсона для Хл е₆, этерифицированных ПХл е₆, их ЛФ и ко-

локализаторов для органелл в клетках К562

Коэффициенты Пирсона для различных компартментов клетки

ФС

эндоплазматический

комплекс

митохондрии

ЛТ

ретикулум

Гольджи

Хл е₆

0.517 ± 0.073

0.905 ± 0.081

0.802 ± 0.072

0.386 ± 0.046

ДМЭ

0.641 ± 0.059

0.820 ± 0.073

0.866 ± 0.079

0.380 ± 0.048

ДМЭ-ДМФХ

0.684 ± 0.061

0.852 ± 0.074

0.744 ± 0.067

0.400 ± 0.051

ТМЭ

0.652 ± 0.058

0.684 ± 0.069

0.560 ± 0.058

0.340 ± 0.041

ТМЭ-ДМФХ

0.664 ± 0.061

0.676 ± 0.058

0.520 ± 0.057

0.361 ± 0.043

Примечание. Время инкубирования при накоплении ФС - 3 ч; концентрация хлоринов - 5 · 10^-6 М; концентрация ЭСТ в

среде инкубирования - 5%. Окрашивание колокализаторами - по протоколу. Величина ККП от 1.00 до 0.70 указывает на от-

носительно сильную корреляцию, 0.69-0.36 - на умеренную корреляцию, 0.35-0.20 - на слабую корреляцию, меньше 0.20 -

отсутствие корреляции [15].

БИОФИЗИКА том 64

№ 4

2019

682

ЗОРИНА и др.

Рис. 6. Относительное содержание апоптотических (по тесту с CMXRos) и некротических (по тесту с иодидом

пропидиума) клеток при фотосенсибилизации Хл е₆, ПХл е₆ и их ЛФ при времени инкубирования после фотооблучения

30 мин (а) и 180 мин (б). 1 - Хл е₆; 2 - ДМЭ; 3 - ДМЭ-ДМФХ; 4 - ТМЭ; 5 - ТМЭ-ДМФХ. Концентрация клеток К562 -

1 ∙ 10⁶/мл. Общее количество клеток в образце принято за 100 %. Соотношение ДМЭ (ТМЭ) : ДМФХ = 1 : 40;

концентрация хлоринов - 2 ∙ 10^-7 М; концентрация сыворотки в среде инкубирования - 2%. Доза светового

воздействия - 0,4 Дж/см², λ = 660 нм. Представлены средние значения и ошибка среднего (M ± m) для трех независимых

экспериментов.

тивность ФС представляет значительный интерес

ло, что выход некротически измененных клеток

сравнение их способности сенсибилизировать

для ПХл е₆, их ЛФ был также выше по сравнению

некротические и апоптотические повреждения

с Хл е_6.Наиболее высокая эффективность фото-

клеток.

сенсибилизации апоптотических повреждений

Оценка цитотоксичности исследованных ФС

клеток наблюдалась в случае ДМЭ и его ЛФ.

и их ЛФ по МТТ-тесту показала, что при концен-

трациях хлоринов от 2·10^-7 до 1·10^-5М в необлу-

ченных образцах не наблюдалось изменения жиз-

ОБСУЖДЕНИЕ

неспособности клеток К562. Действие световых

Представленные в данной работе результаты

потоков с дозой от 0,5 до 2 Дж/см² в отсутствие

показывают, что химическая модификация из-

ФС также не приводило к росту гибели клеток.

вестного фотосенсибилизатора Хл е₆ посред-

Результативность фотосенсибилизированно-

ством последовательной этерификация боковых

го воздействия на клетки оценивали после фото-

облучения суспензии клеток К562, нагруженных

карбоксильных групп оказывает неоднозначное

Хл е₆, ПХл е₆ или их ЛФ, с использованием мето-

влияние на скорость накопления ПХл е₆ в клет-

да цитофлуориметрии с СМХRos и флуоресциру-

ках. Использование ЛФ для введения этерифици-

ющим ДНК-красителем иодидом пропидиума.

рованных ПХл е₆ практически не влияет на кине-

С использованием описанных выше методик

тику накопления этих ФС в клетках, в тоже время

проведено сравнение результативности фотопо-

увеличение центров связывания, при введении

вреждения клеток К562 при их сенсибилизации

ПХл е₆ в составе липосом, сопровождалось сни-

хлоринами и их липосомальными формами

жением уровня накопления ФС (табл. 1). Исходя

(рис. 6). При использовании в качестве фотосен-

из полученных данных по уровню накопления в

сибилизаторов ПХл е₆ и их липосомальных форм

клетках К562 исследованные ФС располагаются в

степень как некротического, так и апоптотиче-

ряду ДМЭ > ТМЭ > ЛФ ДМЭ > ЛФ ТМЭ >> Хл е_6.

ского повреждения клеток К562 через 30 мин по-

Отличия в скоростях накопления ПХл е₆в клет-

сле облучения была выше по сравнению с Хл е₆

(рис. 6а). После 3 ч инкубирования число апопто-

ках не связаны с влиянием процессов агрегации

тически поврежденных клеток для Хл е₆ увеличи-

ФС во внеклеточной среде: с целью мономериза-

лось в 1,5 раза, для ДМЭ, ЛФ ДМЭ, ТМЭ и ЛФ

ции неполярные ФС в растворах вводили в куль-

ТМЭ - в 2,1, 2,8, 2,6 и 2,4 раза соответственно.

туральную среду с ЭСТ за 60 мин до добавления

Сравнение эффективности воздействия показа-

клеток.

БИОФИЗИКА том 64

№ 4

2019

ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ И МЕХАНИЗМЫ

683

Ранее проведенные исследования с использо-

жить, что процессы эндоцитоза не играют важной

ванием клеток лейкемической линии Raji, моно-

роли при накоплении как ПХл е_6,так и их липо-

нуклеарных клеткок периферической крови до-

сомальных форм.

норов, лейкемических клеток пациентов с ост-

Способность ФС накапливаться в отдельных

рым лимфобластным лейкозом и пациентов с

клеточных структурах, наряду с режимами фото-

острым миелоидным лейкозом показали, что ос-

облучения, во многом определяет тип механизма

новными детерминантами, определяющими уро-

фотосенсибилизированного повреждения клеток

вень накопления и эффективность сенсибилиза-

[1,19].

ции повреждения клеток, являются различия

скоростей перераспределения ФС на плазматиче-

Результаты исследования сенсибилизации

скую мембрану с белков сыворотки и наноноси-

ПХл е₆ клеток К562 подтверждают наличие кор-

телей, а также скорость их трансмембранного пе-

реляции между уровнем накопления ФС и отно-

реноса [13-16]. Согласно работам [14,17], при уве-

сительной эффективностью фотоповреждения

личении степени этерификации боковых групп

клеток. Процент поврежденных клеток в образ-

Хл е₆ данные кинетические параметры претерпе-

цах с Хл е₆ в 3,0 и 2,5 раза меньше в сравнении с

вают значительные разнонаправленные измене-

ДМЭ и ТМЭ соответственно. В образцах, содер-

ния. Процесс накопления относительно поляр-

жащих ЛФ ДМЭ и ТМЭ, процент некротически

ного Хл е₆, способного быстро перераспределять-

поврежденных клеток остается неизменным в

ся с белков среды и связываться с поверхностью

пределах статистической погрешности в сравне-

клеток, ограничен крайне низкой скоростью

нии со свободными ПХл е_6.Существенной осо-

трансмембранного переноса. Вследствие этого

бенностью процессов фотоповреждения клеток

флуоресценция данного ФС регистрируется в

К562 при использовании в качестве ФС Хл е₆ и

первые 15-20 мин окрашивания клеток преиму-

его производных являются отличия в относитель-

щественно в составе плазматической мембраны,

ном выходе апоптотически и некротически по-

а величина интегральной флуоресценции клеток,

врежденных клеток. При использовании Хл е₆от-

инкубированных с Хл е₆, значительно ниже ана-

носительное количество поврежденных клеток,

логичной характеристики для клеток, окрашен-

определяемое в тестах с иодидом пропидиума и

ных ДМЭ и ТМЭ. Основным фактором, контро-

СMXRos, одинаково. При облучении клеток в

лирующим скорость накопления ТМЭ в клетках,

присутствии ДМЭ, ТМЭ и их ЛФ процент апо-

является низкая скорость диссоциации из ком-

птотически поврежденных клеток значительно

плексов с белками среды или из липидных вези-

превышает процент числа клеток с поврежден-

кул [18]. Умеренно неполярный ДМЭ, сочетаю-

ной плазматической мембраной (некротические

щий высокую проницаемость в мембранных

изменения). Полученные в данной работе резуль-

структурах с относительно высокой диффузион-

таты о различиях механизмов фотосенсибилизи-

ной подвижностью во внеклеточной среде накап-

рованного Хл е₆ и его производными поврежде-

ливается в клетках с максимальной эффективно-

стью.

ния клеток полностью согласуются с данными

анализа степени экспрессии фосфатидилсерина -

Локализация ФС в клетке является важной де-

известного маркера апоптотических клеток, на

терминантой в определении эффективности ме-

внешней поверхности плазматической мембра-

ханизмов повреждения клетки. Использование

ны. Как показано в работе [17], фотосенсибили-

колокализаторов для различных клеточных орга-

зированное ПХл е₆воздействие на культуру лей-

нелл позволило провести оценку внутриклеточ-

кемических клеток пациентов с острым лимфоб-

ного распределению ПХл е₆. Полученные значе-

ластным лейкозом приводило к увеличению в

ния коэффициентов корреляции Пирсона между

2,5-4,0 раза числа Annexin V - положительного

флуоресценцией ДМЭ, ТМЭ, ЛФ ПХл е₆ и свече-

пула клеток по сравнению с Хл е₆.

нием митохондриального зонда, а также колока-

лизаторов эндоплазматического ретикулума и ап-

Отличия в клеточных механизмах фотоцито-

парата Гольджи свидетельствуют о преимуще-

токсичности Хл е₆ и его производных не связаны

ственной локализации ФС и их ЛФ в этих

с различной интенсивностью фотосенсибилизи-

компартментах клетки. Проведенные исследова-

рованного воздействия на клетки вследствие от-

ния с лизосомальным зондом показали низкий

личий количества накопленных ими фотосенси-

уровень корреляции между флуоресценцией ли-

билизаторов. При уменьшении в 3-10 раз кон-

зосомальных зондов и флуоресценцией ПХл е₆ и

центрации ДМЭ и ТМЭ в клеточных суспензиях

их ЛФ. На основании этого можно предполо-

фотоповреждения клеток протекают преимуще-

БИОФИЗИКА том 64

№ 4

2019

684

ЗОРИНА и др.

ственно по механизму апоптоза (данные не при-

Работа выполнена при финансовой поддержке

ведены).

Белорусского республиканского фонда фунда-

ментальных исследований, проект № Б17-106.

Следует отметить, что основные фотофизиче-

ские характеристики всех исследованных соеди-

нений в мономерной форме, в том числе при

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

включении их в липосомы, практически совпада-

Y. Li, Y. Yu, L. Kang, and Y. Lu, Int. J. Clin. Exp. Med.

ют. В выбранных условиях экспериментов для

7 (12), 4867 (2014).

Хл е₆ и его производных практически отсутству-

А. А. Красновский мл., в кн.

«Проблемы

ют различия в генерации синглетного кислорода,

регуляции в биологических системах», под ред.

основного интермедиатора фотохимических по-

А. Б. Рубина (М.-Ижевск, 2006), cc. 223-244.

вреждений в клетках [12,14]. Можно предполо-

жить, что различия в механизмах повреждения

M. H. Teiten, L. Bezdetnaya, P. Morliere, et al., Brit. J.

обусловлены особенностями внутриклеточной

Cancer 88, 146 (2003).

локализации и, как следствие, различиями в ми-

H. Abrahamse, M. R. Hamblin, Biochem. J. 473, 4,

шенях фотосенсибилизированного действия ис-

347 (2016).

следуемых ФС в клетках. В этой связи следует об-

V. P. Zorin, V. P. Savitskiy, and M. P. Potapnev, Exper-

ратить внимание на отличия в локализации Хл е₆

iment. Oncol. 24, 142 (2002).

и его производных в митохондриях клетки. Ряд

экспериментальных данных свидетельствует, что

Т. Е. Зорина, А. А. Далидович, Л. Н. Марченко и

сенсибилизированное фотовоздействие на мито-

др., Офтальмология. Восточная Европа

хондрии клеток активизирует преимущественно

(2011).

апоптотические пути их гибели [15,20]. Повы-

M. K. Riaz, M. A. Riaz, X. Zhang, et al, Int. J. Mol.

шенное сродство ПХл е₆к митохондриям при бо-

Sci. 19, 195 (2018).

лее высоком общем уровне накопления в клетках

L. A. S. Abu and T. Ishida, Biol. Pharm. Bull. 40, 1

обеспечивает значительно более высокую интен-

(2017).

сивность (степень) сенсибилизированного воз-

действия на эти органеллы и, как следствие, пре-

H. Fischer and H. Orth, Die chemie des pyrrolis (Acad.

имущественную гибель клеток по механизму апо-

Verlag, 1937).

птоза.

10.

R. Taylor, J. Liagn. Med. Sonogr. 6, 35 (1990).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

11.

А. П. Шпакова, К. С. Палова и Т. И. Булычева,

Иммунология 2, 20 (2000).

1. Физико-химические свойства ФС и фарма-

кологические формы их введения определяют

12.

Т. Е. Зорина, И. В. Янковский, И. Е. Кравченко и

уровень и кинетику накопления ФС в клетках.

др., Биофизика 60, 922 (2015).

2. Липосомальные формы позволяют предот-

13.

V. P. Zorin., I. I. Khludeyev, T. E. Zorina, et al., Proc.

вратить агрегацию хлоринов и не приводят к сни-

SPIE. Lazer Use in Oncology II. 4059, 139 (2000).

жению их фотосенсибилизирующей активности.

14.

В. П. Зорин, И. И. Хлудеев и Т. Е. Зорина,

3. Этерифицированные производные хлорина е₆ -

Биофизика 45, 313 (2000).

ДМЭ и ТМЭ и их ЛФ преимущественно локализу-

15.

E. Bastein, R. Schneider, S. Hackbarth, et al., Photo-

ются в эндоплазматическом ретикулуме клетки и

chem. Photobiol. Sci. 14, 2203 (2015).

комплексе Гольджи, а также имеют умеренную ло-

кализацию в митохондриях. Установлено более низ-

16.

В. П. Савицкий, В. П. Зорин, М. П. Потапнев и

кое значение ККП для митохондриального зонда и

А. Я. Потапенко, Бюл. эксперим. биологии и

Хл е₆ по сравнению с его производными и их ЛФ. В

медицины 138 (8), 180 (2004).

лизосомах отмечен низкий уровень локализации

17.

В. П. Савицкий. Автореферат дис. … канд. биол.

для Хл е₆, его производных и их ЛФ.

наук (РНПЦ детской онкологии,гематологии и

4. Различия в механизмах повреждения клеток

иммунологии, Минск, 2008).

Хл е₆, его производными и их ЛФ определяются

18.

В. П. Зорин, И. C. Михаловский, Т. Е. Зорина и

различной векторизацией (направленностью)

др., Биофизика 40, 328 (1995).

сенсибилизированного действия исследуемых

ФС в клетках К562: более высокая апоптотиче-

19.

I. O. Basselar, T. M. Tsubone, C. Pavani, and

ская активность ПХл е₆и их ЛФ, по сравнению с

M. S. Baptista, Int. J. Mol. Sci. 16, 20523 (2015).

Хл е_6,обусловлена различиями в уровне накопле-

20. J. Wu, Q. Xiao, Na Zhang, et al., Phtodiagnosis and

ния в митохондриях клетки.

Photodynamic Therapy 15 (2016).

БИОФИЗИКА том 64

№ 4

2019