БИОФИЗИКА, 2019, том 64, № 4, с. 716-719

БИОФИЗИКА КЛЕТКИ

УДК 576.32/.36

ИЗМЕНЕНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ЛИМФОЦИТОВ

В УСЛОВИЯХ МЕХАНИЧЕСКОГО СТРЕССА

Белгородский национальный исследовательский университет, 308015, Белгород, ул. Победы, 85

E-mail: sladkova@bsu.edu.ru

Поступила в редакцию 28.02.2019 г.

После доработки 14.04.2019 г.

Принята к публикации 22.04.2019 г.

Изучены биофизические свойства лимфоцитов в условиях механической деформации клеток

крови. Модель механического «стресса» in vitro позволяет активировать элементы пуринергической

сигнальной системы форменных элементов крови посредством АТФ-зависимых рецепторов.

Установлено, что в условиях механического стресса уровень АТФ в крови увеличился в 2,3 раза по

сравнению с контролем, заряд клеточной поверхности лимфоцитов снижается, жесткость

увеличивается, а сила адгезии между лимфоцитом и эритроцитом возрастает. Полученные данные

указывают на участие молекулы АТФ в регуляции биофизических свойств плазмалеммы

лимфоцитов, что, в свою очередь, может приводить к изменению рецепторных комплексов на

поверхности иммунокомпетентных клеток.

Ключевые слова: механический стресс, пуринергическая сигнальная система, поверхностный

потенциал, адгезия, модуль Юнга, лимфоциты.

DOI: 10.1134/S0006302919040094

свойств плазмалеммы (жесткость, заряд, адгезия)

В микроциркуляторном сосудистом русле

лимфоцитов в условиях активации пуринергиче-

форменные элементы крови подвергаются сило-

ской сигнальной системы посредством механиче-

вому воздействию со стороны смещающихся сло-

ев движущейся плазмы. В результате чего клетки

ского стресса.

претерпевают так называемый механический

Цель работы

- изучить изменение

«стресс» [1]. Показано, что эритроциты в услови-

биофизических свойств лимфоцитов в условиях

ях механической деформации освобождают мо-

механического стресса.

лекулы аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ),

которые в результате взаимодействия с эндонук-

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

леотидазами [2] образуют лиганды для пуринер-

гических рецепторов, локализованных на различ-

Исследования выполнены на крови здоровых

ных клеточных популяциях, в том числе и на лим-

людей (n = 30) зрелого возраста (36-59 лет), про-

фоцитах. В ряде работ показано, что на

ходивших диспансеризацию на базе областной

плазмалемме лимфоцитов присутствуют рецеп-

клинической больницы Белгорода. Забор крови

торы пуринергической сигнальной системы двух

проводили путем венепункции с участием специ-

типов - Р2Х и Р2Y [3], которые реагируют на эк-

ализированного медперсонала. Кровь собирали в

зогенные молекулы АТФ, что приводит к усиле-

вакуумные пробирки Vacuette K3E, содержащие

сухую ЭДТА·К₃ в концентрации

2,0 мг

нию притока ионов Са²⁺ через мембранные кана-

(0,006843 моль/литр) на 1 мл крови.

лы [2]. Кроме того, сама стимуляция Р2Х- и Р2Y-

рецепторов лимфоцитов способна вызвать вы-

Каждую пробу крови делили на две части -

свобождение внутриклеточного АТФ через кана-

контрольную и опытную. Опытные пробы крови

лы, образованные паннексином-1 [4]. Эффектом

подвергали механическому стрессу. Механиче-

такого процесса являются изменения продукции

ский стресс in vitro моделировали согласно мето-

цитокинов иммунокомпетентными клетками [5].

ду, описанному в работе [6]. Для этого 500 мкл

В связи с этим актуальным является изучение во-

цельной крови набирали в одноразовый туберку-

просов, связанных с изменением биофизические

линовый шприц с внутренним диаметром 4 мм

(SF-Medical, Германия). Воздушные пузырьки при

Сокращения: АТФ - аденозинтрифосфорная кислота.

этом были тщательно удалены. Суспензию клеток

716

ИЗМЕНЕНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ЛИМФОЦИТОВ

717

пропускали через одноразовую иглу 25-го калибра

(длина 30 мм и внутренний диаметр 0,5 мм). Про-

хождение крови через иглу осуществляли путем

размещения груза массой 1 кг на верхнем конце

вертикально закрепленного поршня шприца.

Кровь собирали в одноразовые пятимиллилитро-

вые полипропиленовые центрифужные пробир-

ки. Расстояние от конца иглы до дна пробирки

составляло 15 мм. В опытных и контрольных про-

бах измеряли концентрацию АТФ колориметри-

ческим методом [7].

Лейкоциты из цельной крови в опытных и

контрольных пробах выделяли путем центрифу-

гирования при 1500 об/мин в течение 5 мин. За-

тем из полученной суспензии лейкоцитов с помо-

щью магнита для клеточной сепарации EasySep

Концентрация АТФ в крови: опыт - под влиянием

Magnet и набора для выделения лимфоцитов

механического стресса in vitro, контроль - интактная

EasySep/EasySep Direct Human Total Lymphocyte

кровь. * - Статистически значимые различия между

показателями в опытной и контрольной группах по

Isolation Kit (StemCell Technologies, Канада) выде-

критерию Стьюдента (p < 0,05).

ляли популяцию лимфоцитов.

Жесткость плазмалеммы клеток крови оцени-

вали по числовым данным модуля Юнга. В осно-

межклеточной адгезии измеряли в системе «эрит-

ве метода регистрации модуля Юнга лежит изме-

роцит-лимфоцит», регистрируя силовые кривые

рение степени деформации поверхности образца

с поверхности 20 клеток. Силы адгезии рассчиты-

при взаимодействии его с вершиной зонда атом-

вали с помощью программного обеспечения

но-силового микроскопа [8]. В работе использо-

Nova.

ваны модифицированные зонды, изготовленные

Достоверность различий между контрольны-

коллективом авторов на основе полимерных

ми и опытными пробами определяли с использо-

микросфер с радиусом закругления 5 мкм. Изме-

ванием t-критерия Стьюдента при p < 0,05 с уче-

рение модуля Юнга осуществляли на атомно-си-

том нормального распределения данных. В рабо-

ловом микроскопе ИНТЕГРА ВИТА (конфигура-

те приведены средние величины (М) и величины

ция на базе инвертированного оптического мик-

статистической ошибки среднего (m).

роскопа Olympus IX-71; производитель NT MDT,

Зеленоград, Россия). Измерения выполнены в

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

режиме силовой спектроскопии согласно спосо-

И ОБСУЖДЕНИЕ

бу, изложенному в работе [9]. Из каждой пробы

сканировали по 20 клеток.

В условиях механической деформации клеток

крови in vitro установлено увеличение концентра-

Электрические свойства мембраны лимфоци-

ции АТФ в крови в 2,3 раза по сравнению с кон-

тов оценивали, выполняя измерения поверхност-

тролем (рисунок).

ного потенциала в режиме зонда Кельвина на

атомно-силовом микроскопе. Суспензию клеток

При активации элементов пуринергической

для измерения поверхностного потенциала и

сигнальной системы произошло изменение био-

процедуру измерения осуществляли согласно ал-

физических свойств плазмалеммы лимфоцитов.

горитму, описанному в работе [10]. Использовали

Модуль Юнга, характеризующий жесткость по-

кантилеверы с токопроводящим титановым по-

верхности клеток, увеличился на 26% (р < 0,05) по

крытием серии NSG03/TiN (Nanoworld, США).

сравнению с контролем (таблица).

Из каждой пробы сканировали по 20 лимфоци-

В опытных пробах крови потенциал поверхно-

тов, проводили обработку полученных сканов в

сти лимфоцитов стал более отрицательный -

программе Nova (NT-MDT, Зеленоград, Россия).

снизился на 27% (р < 0,05), что сопровождается

Для измерения сил адгезии между эритроци-

увеличением адгезивной активности в системе

том и лимфоцитом конструировали биосенсор-

«эритроцит-лимфоцит» на 49,7% (р < 0,05; таб-

лица).

ный чип, изготовленный на основе нативного

эритроцита и типлесса CSG11 (США) согласно

В представленной работе изучено влияние си-

способу, изложенному в работе [11]. Выбор эрит-

лового воздействия in vitro, моделирующего меха-

роцита в качестве биосенсора основан на идее о

нической стресс клеток крови в микроциркуля-

том, что в микроциркуляторном русле популяция

торном сосудистом русле, на биофизические

эритроцитов самая многочисленная и активно

свойства плазмалеммы лимфоцитов. Установле-

взаимодействует с другими клетками крови. Силу

но, что в условиях механической деформации

БИОФИЗИКА том 64

№ 4

2019

718

СЛАДКОВА и др.

Таблица 1. Биофизические свойства клеточной поверхности лимфоцитов

Показатели

Контроль

Опыт

Сила адгезии в системе “эритроцит-лимфоцит”, нН

35.9 ± 0.2

71.5 ± 0.8*

Модуль Юнга лимфоцитов, мкПа

9.16 ± 0.01

11.56 ± 0.02*

Потенциал поверхности лимфоцитов, мВ

-19.72 ± 0.23

-27.15 ± 0.32*

клеток крови происходит выделение в межкле-

ского стресса in vitro. При активации пуринерги-

точное пространство молекул АТФ, что согласу-

ческой сигнальной системы посредством

ется с данными работы [12].

механической деформации клеток крови увели-

чилась жесткость плазмалеммы лимфоцитов, в то

Показано, что эффекты экзогенного АТФ за-

же время клеточная поверхность приобрела более

ключались в изменении биофизических свойств

выраженный отрицательный заряд, что в итоге

клеточной поверхности лимфоцитов - снижении

способствовало увеличению сил адгезии в систе-

поверхностного потенциала плазмалеммы и уве-

ме «эритроцит-лимфоцит». Полученные данные

личении ее жесткости, а также возрастании силы

указывают на важную роль молекулы АТФ и ее

адгезии между лимфоцитом и эритроцитом. Из-

производных в регуляции работы лимфоцитов

менение биофизических свойств клеточной по-

через связывание с рецепторами Р2-семейства.

верхности может быть связано с активацией пу-

Исследование

изменений

биофизических

ринергической сигнальной системы, рецепторы

свойств лимфоцитов при активации пуринерги-

которой запускают целый каскад сигнальных ре-

ческой сигнальной системы позволит установить

акций посредством механизма аутокринной об-

новые эффекты пуриновых соединений в иммун-

ратной связи [13].

ных реакциях. В том числе, полученные результа-

В ряде работ описаны рецепторы P2X семей-

ты могут быть учтены при поиске и разработке

ства, локализованные на поверхности лимфоци-

лигандов, селективных к Р2-рецепторам, для те-

тов, взаимодействие молекул АТФ с этими рецеп-

рапии воспалительных заболеваний.

торами влечет за собой открытие Са²⁺-ионных

Исследование выполнено при финансовой

каналов [14]. Молекулярный механизм реализа-

поддержке гранта Российского научного фонда

ции данного пути может быть связан с работой

по мероприятию «Проведение инициативных ис-

фосфолипазы С, которая активирует фосфатиди-

следований молодыми учеными» 2018-2020 гг.

линозитол-4,5-бифосфат, а он, в свою очередь,

(соглашение № 18-75-00041).

мобилизует внутриклеточный Са²⁺ [15], что со-

гласуется с установленным изменением потенци-

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ала поверхности лимфоцитов.

1. R. Sprague, A. Stephenson, and M. Ellworth, Trends

Показанное в нашем исследовании увеличе-

Endocrin. Metabol. 18 (9), 350 (2007).

ние жесткости и адгезии клеточной поверхности

2. N. Montalbetti, M. F. L. Denis, O. P. Pignataro, et al.,

лимфоцитов может быть связано с функциональ-

J. Biol. Chem. 286 (44), 38397 (2011).

ной активностью рецепторного комплекса имму-

3. D. H. Lee, K. S. Park, I. D. Kong, et al., BMC Immu-

нокомпетентных клеток и реализацией ими сиг-

nol. 7, 22 (2006).

нальных каскадов. Так, в работе [16] был описан

4. T. Woehrle, L. Yip, M. Manohar, et al., J. Leukoc. Biol.

механизм двойного эффекта стимуляции рецеп-

88 (6), 1181 (2010).

торов P2X7, зависящий от уровня их экспрессии

5. L. Yip, T. Woehrle, R. Corriden, et al., FASEB J. 23

на поверхности лимфоцитов. Стимуляция рецеп-

(6), 1685 (2009).

торов P2X7 молекулами АТФ приводит к запуску

6. T. Oonishi, K. Sakashita, and N. Uyesaka, J. Physiol.

MAPK-сигнальных путей и усилению транскрип-

Soc. 273, 1828 (1997).

ции гена IL-2 [17], в то время как при избыточной

7. Т. Л. Алейникова и Г. В. Рубцова, Руководство к

экспрессии рецепторов P2X7 на поверхности

практическим занятиям по биохимии (Высш. шк.,

М., 1988).

лимфоцитов активация их АТФ может иниции-

8. J. L. Alonso and W. H. Goldman, Life Sci. 72, 2553

ровать митоптоз, с последующей интоксикацией

(2003).

и гибелью клетки [16].

9. М. Ю. Скоркина, М. З. Федорова, А. В. Муравьев

Таким образом, установлено увеличение кон-

и др. Клет. техн. в биол. и мед. 3, 172 (2012).

центрации АТФ в крови и изменение биофизиче-

10. Е. А. Сладкова и М. Ю. Скоркина, Биофизика 59

ских свойств лимфоцитов в условиях механиче-

(2), 310 (2014).

БИОФИЗИКА том 64

№ 4

2019

ИЗМЕНЕНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ЛИМФОЦИТОВ

719

11. М. Ю. Скоркина, Е. А. Шамрай и Е. А. Сладкова,

15. J. Meshki, F. Tuluc, O. Bredetean, et al., Purinergic

Клет. техн. в биол. и мед. 4, 213 (2017).

Signal. 2 (3), 537 (2006).

12. J. Evans, W. Gratzer, N. Mohandas, et al., Biophys. J.

16. E. Adinolfi, M. G. Callegari, D. Ferrari, et al., Mol. Bi-

94 (10), 4134 (2008).

ol. Cell. 16 (7), 3260 (2005).

13. W. G. Junger, Nat. Rev. Immunol. 11 (3), 201 (2011).

14. R. A. North, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol Sci.

17. T. Woehrle, L. Yip, M. Manohar, et al., J. Leukoc. Biol.

371 (1700), 20150427 (2016).

88 (6), 1181 (2010).

Changes in Biophysical Properties of Lymphocytes under Mechanical Stress

E.A. Sladkova, E.A. Shamray, A.Yu. Tishchenko, and M.Yu. Skorkina

Belgorod National Research University, ul. Pobedy, 85, Belgorod, 308015 Russia

The biophysical properties of lymphocytes under mechanical deformations were investigated. An in vitro

model of mechanical “stress” provides a means to activate components of the purinergic signaling system of

blood cells through the ATP-dependent receptors. It was established that under mechanical stress, the level

of ATP in blood increased 2.3 times against control, cell surface charge of lymphocytes decreases, stiffness

increases, and the strength of adhesion between lymphocytes and erythrocytes becomes stronger. Our find-

ings indicate that the ATP molecules are involved in the regulation of biophysical properties of the plasma-

lemma of lymphocytes that, in turn, may lead to a change in the receptor complexes on the surfaces of the

immunocompetent cells.

Keywords: mechanical stress, purinergic signaling system, surface potential, adhesion, Young's modulus, lympho-

cytes

БИОФИЗИКА том 64

№ 4

2019