БИОФИЗИКА, 2019, том 64, № 4, с. 734-739

БИОФИЗИКА КЛЕТКИ

УДК 599.3:591.31:578.61

РАЗРУШЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПЛЕНКИ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИ

АКТИВИРОВАННЫМ ВОДНЫМ РАСТВОРОМ

А.И. Панаит, М.А. Погорелова

Инcтитут теоpетичеcкой и экcпеpиментальной биофизики PАН,

142290, Пущино Московской области, ул. Институтская, 3

Е-mail: agpogorelov@rambler.ru

Поступила в редакцию 13.03.2019 г.

После доработки 18.04.2019 г.

Принята к публикации 22.04.2019 г.

Исследовали действие электрохимически активированного водного раствора на тонкую структуру

биопленки, образованной планктонной формой композиции молочнокислых бактерий и кишеч-

ной палочки. Бактериальная пленка была сформирована на внутренней поверхности трубки цирку-

ляционного реактора, моделирующего трубопроводную коммуникацию. Ультраструктуру рельефа

биопленки визуализировали посредством сканирующей электронной микроскопии. Показано, что

обработка последовательно католитом и анолитом разрушает полимерный матрикс бактериальной

пленки и ее клеточную компоненту.

Ключевые слова: биопленка, сканирующая электронная микроскопия, циркуляционный реактор, E. coli,

молочнокислые бактерии, католит, анолит.

DOI: 10.1134/S0006302919040124

логически безопасными. Альтернативу традици-

Во многих отраслях формирование биопленки

онной очистке представляет обработка

на технологических поверхностях приводит к

поверхности электрохимически активированным

значительным потерям ресурсов и снижает эф-

водным раствором (ЭХАР), обладающим широ-

фективность производства, что заставляет искать

ким бактерицидным диапазоном действия [8-

способы ее удаления [1]. Микробная пленка об-

10]. Такой биофизический подход основан на

разуется во влажной среде на твердой поверхно-

том, что ЭХАР с измененными значениями рН и

сти в форме симбиоза клеток разного вида, погру-

окислительно-восстановительного потенциала

женных в полимерный матрикс [2-4]. Благопри-

(ОВП), находясь в метастабильном состоянии, со

ятной основой для биопленки является

временем восстанавливает свойства исходной во-

шероховатая подложка, которая способствует ме-

ды. Цель настоящей работы состояла в том, чтобы

ханическому закреплению микроорганизмов.

в модельном эксперименте в контролируемых ла-

По сравнению с планктонной формой

бораторных условиях исследовать эффект, кото-

биопленка, формируя собственный гомеостаз,

рый оказывает обработка ЭХАР на клеточную

обеспечивает клеточной компоненте защиту от

компоненту бактериальной пленки и ее матрикс.

антибиотиков, а также от механического разру-

шения внешним потоком жидкости [5-7]. Удале-

ние биопленки требует значительного увеличе-

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

ния концентрации антимикробных препаратов,

что оказывает дополнительную экологическую

Работа выполнена в условиях лабораторного

нагрузку на окружающую среду и удорожает ко-

эксперимента на бактериальной пленке, сформи-

нечный продукт. Поэтому актуальной является

рованной на внутренней поверхности пористой

разработка принципиально новых способов дез-

поливинилхлоридной (ПВХ) трубки циркуляци-

интеграции биопленки, которые были бы одно-

онного реактора [11-13]. Источником биопленки

временно экономичными, эффективными и эко-

служил водный поток, содержащий планктонную

форму бактерий. Начальную суспензию микро-

Сокращения: ЭХАР - электрохимически активированный

организмов получали из композиции высушен-

водный раствор, ОВП - окислительно-восстановитель-

ный потенциал, ПВХ - поливинилхлорид, PCR-RT - по-

ных штаммов молочнокислых бактерий, входя-

лимеразная цепная реакция в реальном времени.

щих в состав препарата «Эвиталия». Данный пре-

734

РАЗРУШЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПЛЕНКИ

735

парат рекомендован для реализации в качестве

Дезинфицирующую эффективность ЭХАР

биологически активной добавки к пище - источ-

также проверяли с помощью анализа методом

ника пробиотических микроорганизмов. В каче-

ПЦР в реальном времени (PCR-RT) по наличию

стве начальной планктонной формы кишечной

ДНК E. coli, которая содержится в исходной бак-

палочки использовали суспензию E. coli, полу-

териальной пленке. Ген uidA кишечной палочки

ченную

из

коллекции

лаборатории

является уникальным для данного микроорга-

Л.А. Железной (ИТЭБ РАН, Пущино). Удаление

низма, т.е. не встречается у эволюционно род-

бактериальной пленки осуществляли, обрабаты-

ственных видов или родов бактерий и не имеет

близких гомологов в геномах бактерий других ро-

вая внутреннюю поверхность трубки реактора

дов. Применяя Genomic DNA purification kit

потоком ЭХАР различного химического состава и

(Thermoscientific, #K0512), с внутренней поверх-

физико-химических свойств: католита (рН 13,5 ,

ности трубки экстрагировали ДНК. В получен-

ОВП ~ -50 мВ, удельная электропроводность

ном растворе предварительно с помощью Quant-

267 мСм/см) и анолита (рН 5,44, ОВП ~ 830 мВ,

iT dsDNA HS Assay kit (Invitrogen, США) опреде-

удельная электропроводность 1,9 мСм/см). Като-

ляли концентрацию ДНК посредством флуори-

лит (насыщенный водородом щелочной раствор с

метра Qubit. Наличие геномной ДНК E. coli ана-

отрицательным значением ОВП) получали элек-

лизировали методом PCR-RT, используя специ-

трохимической обработкой водного раствора

фичные праймеры, на приборе 7300 RealTime

гидроксида натрия. Анолит, содержащий ком-

PCR System (США) с длительностью программы

плекс метастабильных соединений активного

40 циклов. При подготовке пробы применили

хлора и активного кислорода (хлорноватистую

двухфазную температурную программу: вначале

кислоту, гипохлорит-ион, пероксид водорода и

денатурация при 95°С в течение 5 мин, затем де-

др.) в суммарной концентрации 500 ± 50 мг/л, по-

натурация при 94°С в течение 15 с, после чего от-

лучали электрохимической обработкой водного

жиг и элонгация при 60°С в течение 60 с. В каче-

раствора хлорида натрия. Анолит характеризует-

стве тест-объекта использовали препарат (Sigma,

ся высоким положительным значением ОВП.

США) с известным содержанием (0,001 нГ) ДНК

Для контроля использовали образец бактериаль-

кишечной палочки.

ной пленки, которую отмывали водой из бытово-

го водопровода (рН 7,4, ОВП ~ 260мВ, удельная

электропроводность 0,4 мСм/см). Для измерения

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

рН, ОВП и удельной электропроводности ис-

Сличительная экспертиза способов обеззара-

пользовали многопараметрический прибор Exel-

живания требует использования унифицирован-

lence S470 (Mettler Toledo, Швейцария); суммар-

ных подходов формирования биопленки. Эта за-

ную концентрацию соединений активного хлора

дача решается посредством специализированных

и активного кислорода в анолите определяли йо-

стендов, позволяющих в лабораторных условиях

дометрическим титрованием.

воспроизводить условия роста биопленки, а так-

же контролировать параметры протокола ее уда-

Изменение тонкой структуры образца изучали

ления. В настоящее время производство таких

с помощью сканирующей электронной микро-

установок не освоено биологическим приборо-

скопии. Основные принципы подготовки препа-

строением, поэтому для формирования и дезин-

рата для электронно-микроскопического иссле-

теграции биопленки нами разработан действую-

дования описаны ранее [14,15]. Они включают в

щий циркуляционный реактор (рис. 1).

себя следующее: отрезок трубки циркуляционно-

Для формирования пленки микроорганизмы

го реактора фиксировали в растворе 1,5% глюта-

используют два основных механизма - адгезию и

рового альдегида при 4ºС в течение 12 ч, затем в

механическое закрепление на поверхности по-

растворе 1% OsO₄при комнатной температуре.

средством специальных клеточных устройств

После фиксации образец дегидратировали в бата-

(жгутик, псевдоподия, вырост цитоплазматиче-

рее этилового спирта возрастающей концентра-

ской мембраны, ворсинка). Для моделирования

ции (50%, 75%, 80%, 90% и 98%). Для удаления

указанных механизмов создали композицию, со-

спирта образцы переносили в гексаметилдисила-

стоящую из двух видов бактерий. Молочнокис-

зан, после чего сушили на воздухе. Готовый пре-

лые бактерии относят к группе представителей

парат крепили к держателю микроскопа с после-

микрофлоры, формирующих пленку посред-

дующим нанесением на его поверхность пленки

ством адгезии. Второй способ закрепления за счет

платины (10 нм) в установке JFC-1600 (Jeol, Япо-

механического сцепления с микрорельефом с по-

ния). Тонкую структуру рельефа поверхности

мощью жгутика использует кишечная палочка.

изучали в сканирующем электронном микроско-

В нашем исследовании подложкой для роста

пе JSM-6390A (Jeol, Япония) при ускоряющем

биопленки была трубка из ПВХ-полимера, на по-

напряжении 10 кВ, используя режим вторичных

ристой поверхности которой бактериальная

электронов.

пленка растет относительно быстро, но по причи-

БИОФИЗИКА том 64

№ 4

2019

736

ПОГОРЕЛОВ и др.

не пористости ее труднее удалить. Характерным

критерием дезинтеграции биопленки является

разрушение клеточной компоненты и матрикса.

Поэтому, используя сканирующую электронную

микроскопию, мы сравнивали строение

биопленки, а также чистоту поверхности после ее

обработки ЭХАР. На рис. 2 представлены микро-

фотографии препарата бактериальной пленки,

полученные с помощью сканирующей электрон-

ной микроскопии. Образец сформирован в цир-

куляционном реакторе на внутренней поверхно-

сти пористой трубки из ПВХ. Удаление слоя бак-

терий проводили с помощью обработки

фракцией восстановленного ЭХАР (католит).

Сравнение микрофотографий показывает ка-

Рис. 1. Блок-схема лабораторного стенда для модели-

чественное различие структуры препарата в зави-

рования процесса формирования и дезинтеграции

бактериальной пленки, разработанного в виде цирку-

симости от клеточного состава бактериальной

ляционного реактора: 1 - резервуар, 2 - кран, 3 -

пленки. Рассмотрим действие католита на плен-

циркуляционный насос, 4 - трубопровод с расшире-

ку, состоящую только из молочнокислых бакте-

нием, 5 - кран, 6 - резервуар, 7 - трубопровод, 8 -

рий. На микрофотографии контрольного образца

кран, 9 - резервуар, 10 - кран, 11 - резервуар, 12 -

(рис. 2а) нельзя различить виды молочнокислых

кран, 13 - резервуар, 14 - кран, 15 - резервуар, 16 -

трубопровод.

бактерий, но плотная многослойная упаковка

Рис. 2. Микрофотографии бактериальной пленки на внутренней поверхности ПВХ-трубки циркуляционного реакто-

ра. Изображения получены посредством сканирующей электронной микроскопии в режиме вторичных электронов:

(а) - пленка сформирована молочнокислыми бактериями, отмыта потоком воды из бытового трубопровода; (б) -

пленка сформирована молочнокислыми бактериями, отмыта потоком католита (фракция восстановленного ЭХАР);

(в) - пленка сформирована композицией молочнокислых бактерий и кишечной палочки, отмыта потоком воды из

бытового трубопровода; (г) - пленка сформирована композицией молочнокислых бактерий и кишечной палочки, от-

мыта потоком католита (фракция восстановленного ЭХАР).

БИОФИЗИКА том 64

№ 4

2019

РАЗРУШЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПЛЕНКИ

737

Рис. 3. Микрофотографии бактериальной пленки на внутренней поверхности ПВХ-трубки циркуляционного

реактора. Изображения получены с помощью сканирующей электронной микроскопии в режиме вторичных

электронов: (а) - пленка сформирована композицией молочнокислых бактерий и кишечной палочки, отмыта

протоком воды из бытового трубопровода; (б) - пленка сформирована композицией молочнокислых бактерий и

кишечной палочки, отмыта потоком 10% водного раствора NaOH; (в) - пленка сформирована композицией

молочнокислых бактерий и кишечной палочки, отмыта потоком католита (восстановленная фракция ЭХАР); (г) -

пленка сформирована композицией молочнокислых бактерий и кишечной палочки, отмыта потоком

последовательно католита и анолита (окисленная фракция ЭХАР).

клеток свидетельствует о формировании зрелого

ции бактериальной пленки следует комбиниро-

матрикса. Отметим полное удаление клеточного

вать действие обеих фракций ЭХАР. Результаты

состава после промывки просвета трубки католи-

такого эксперимента иллюстрируют микрофото-

том (рис. 2б). Похожая картина наблюдается в

графии на рис. 3.

присутствии E. coli, когда обычная вода по-преж-

Видно (рис. 3а), что для контрольного препа-

нему не оказывает действия на биопленку

(рис. 2в), а католит удаляет лактобактерии

рата характерна структура в виде колоний с выра-

(рис. 2г). Однако католит оставляет нетронутой

женным присутствием на поверхности препарата

популяцию кишечной палочки (рис. 2г).

молочнокислых бактерий. В результате обработ-

ки 10%-м раствором NaOH, что принято в пище-

Таким образом, можно прийти к следующему

вой промышленности, вид пленки значительно

заключению. Обработка католитом оказывает

меняется (рис. 3б), при этом видна многослойная

дезинфицирующий эффект на пленку, образо-

структура. После применения католита ожидаемо

ванную молочнокислыми бактериями, хотя на

поверхности остаются микронные частицы мат-

наблюдается полное удаление пула молочнокис-

лых бактерий (рис. 3в), но остаются клетки E. coli,

рикса. Эти фрагменты не визуализируются по-

средством оптической микроскопии, но наличие

закрепленные нитевидными придатками за мик-

на подложке остаточной органической массы

рорельеф поверхности. Наиболее эффективным

служит фактором, провоцирующим заселение

оказалось последовательное действие католита и

de novo поверхности микроорганизмами. Католит

анолита (рис. 3г). В этом случае матрикс и клеточ-

не оказывает действия на кишечную палочку. В

ная фракция удаляются полностью, так что визу-

этом случае, возможно, для полной дезинтегра-

ально идентифицируется очищенная поверх-

БИОФИЗИКА том 64

№ 4

2019

738

ПОГОРЕЛОВ и др.

Рис. 4. Микрофотографии внутренней поверхности ПВХ-трубки циркуляционного реактора после обработки

бактериальной пленки, содержащей молочнокислые бактерии и кишечную палочку. Изображения получены методом

сканирующей электронной микроскопии в режиме вторичных электронов: (а) - биопленка отмыта потоком воды из

бытового трубопровода; (б) - биопленка отмыта 10%-м водным раствором NaOH; (в) - биопленка отмыта католитом;

(г) - поверхность после лизирования биопленки, предварительно отмытой потоком воды из бытового трубопровода;

(д) - поверхность после лизирования биопленки, предварительно отмытой 10%-м водным раствором NaOH;

(е) поверхность после лизирования биопленки, предварительно отмытой католитом.

ность ПВХ трубки с характерной пористой струк-

новых кислот в исследуемых образцах бактери-

турой.

альной пленки в разы меньше, чем в тест-объекте

с минимальным содержанием ДНК в пробе

Ультраструктурный анализ показывает слож-

(0,001 нГ). Самый низкий уровень ДНК реги-

ную многослойную архитектуру бактериальной

стрируется в образце биопленки, отмытой водой

пленки, сформированной двумя видами микро-

из бытового трубопровода, что практически не

организмов (рис. 3), где нижний уровень заселя-

оказывает дезинфицирующего эффекта. Этот

ют клетки E. coli. Из двух видов бактерий, моде-

факт можно объяснить тем, что популяция ки-

лирующих разные механизмы закрепления на по-

шечной палочки находится на дне бактериальной

верхности подложки, кишечная палочка более

пленки, что затрудняет доступ к ней лизирующе-

устойчива к действию католита, чем молочнокис-

го раствора. Другими словами, наблюдается ха-

лые бактерии. Удаление кишечной палочки тре-

рактерная ситуация, когда матрикс биопленки

бует комплексной обработки обеими фракциями

купирует внешнее воздействие. Такую трактовку

ЭХАР. Отметим, что этот микроорганизм сосу-

результатов PCR-RT подтверждают данные ска-

ществует в симбиозе с человеком и легко распро-

нирующей электронной микроскопии (рис. 4).

страняется во многих сферах его деятельности,

поэтому в пищевом и сельскохозяйственном про-

На микрофотографиях (рис. 4) представлены

изводстве E. coli является санитарно-показатель-

изображения поверхности трубки циркуляцион-

ным микроорганизмом. На молекулярном уровне

ного реактора после лизирования клеточной мас-

наличие гена кишечной палочки является крите-

сы для PCR-RT-анализа. Видно, что качество

рием качества удаления сформированной

удаления кишечной палочки зависит от способа

биопленки. Следовательно, кишечную палочку

обработки биопленки. В образце, отмытом водой,

следует рассматривать в качестве молекулярного

наблюдается полная сохранность бактериальной

теста на качество удаления биопленки в модель-

пленки (рис. 4а), но после лизирования на по-

ном эксперименте. Источником бактериальной

верхности остались отдельные клетки и их фраг-

ДНК могут служить оставшиеся на поверхности

менты (рис. 4г). Препарат, обработанный 10%-м

клетки E. coli или их фрагменты, что оценивали

водным раствором NaOH, выглядит менее плот-

PCR-RT-анализом.

ным (рис. 4б), чем контрольный образец (рис. 4а),

Расчет, проведенный на основе данных PCR-

но все равно содержит большой объем клеточной

RT-анализа, показывает, что содержание нуклеи- массы. После лизирования на поверхности не на-

БИОФИЗИКА том 64

№ 4

2019

РАЗРУШЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПЛЕНКИ

739

блюдается кишечная палочка, но видны фрак-

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

тальные структуры неопределенной природы

1. T. R. Garrett, M. Bhakoo, and Z. Zhang, Progr. Natu-

(рис. 4д). Возможно, это следы повреждения по-

ral Sci. 18, 1049 (2008).

верхности в результате длительного взаимодей-

2. M. E. Shirtliff, J. T. Mader, and A. K. Camper, Chem.

ствия материала ПВХ-трубки с сильной щело-

Biol. 9, 859 (2000).

чью. Видно (рис. 4в), что обработка биопленки

3. J. W. Costerton, Int. J. Antimicrob. Agents 11, 217

католитом удаляет молочнокислые бактерии,

(1999).

оставляя фракцию E. coli. После лизирования на

4. W. M. Dunne, Clin. Microbiol. Rev. 15, 155 (2002).

поверхности трубки не остается клеточной ком-

5. A. Bridier, R. Briandet, V. Thomas, and F. Dubois-

поненты (рис. 4е).

Brissonnet, Biofouling 27, 1017 (2011).

Завершая обсуждение, можно отметить следу-

6. D. Nguyen, A. Joshi-Datar, F. Lepine, et al., Science

ющее. В комплексе ультраструктурный и генети-

334, 982 (2011).

ческий подходы могут быть использованы для

7. K. Drescher, Y. Shen, B. L. Bassler, and H. A. Stone,

изучения эффективности процедуры удаления

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110, 4345 (2013).

бактериальной пленки с поверхности. В этом слу-

8. N. D’Atanasio, A. Capezzone de Joannon, G. Manga-

чае критерием служит визуализация клеточной

no, et al., Wounds 27, 265 (2015).

фракции или наличие ДНК характерной бакте-

9. T. E. Cloete, M. S. Thantsha, M. R. Maluleke, and R.

рии. В данном исследовании использовали E. coli

Kirkpatrick, J. Appl. Microbiol. 107, 379 (2009).

в качестве такого микроорганизма-маркера, ко-

10. V. M. Bakhir and A. G. Pogorelov, Int. J. Pharm. Res.

торый демонстрирует качество, полезное для мо-

& Allied Sci. 7, 41 (2018).

дельного эксперимента. Помимо адгезии кишеч-

11. C. Ludecke, K. D. Jandt, D. Siegismund, et al., PLOS

ная палочка крепится механически посредством

One 9, e84837 (2014).

отростка, используя его в качестве якоря. Поэто-

12. S. A. Crusz, R. Popat, M. T. Rybtke, et al., Biofouling

му для разрушения биопленки, содержащей эту

28 (8), 835 (2012).

бактерию, дезинфицирующий раствор должен

13. C. Rollet, L. Gal, and J. Guzzo, FEMS Microbiol.

обладать более универсальными свойствами, чем

Lett. 290, 135 (2009).

при удалении пленки, сформированной только

14. A. G. Pogorelov, V. B. Gavrilyuk, V. N. Pogorelova,

молочнокислыми бактериями.

and B. K. Gavrilyuk, Bull Exp Biol Med. 154, 167

Исследование выполнено при финансовой

(2012).

поддержке Российского научного фонда (проект

15. A. G. Pogorelov, I. V. Chebotar, and V. N. Pogorelova,

№ 17-76-20014).

Bull. Exp. Biol. Med. 157, 711 (2014).

Biophysical Approach for Disintegration of Bacterial Film Formed on the Surface

A.G. Pogorelov, A.L. Kuznetsov, V.N. Pogorelova, O.A. Suvorov, A.I. Panait, and M.A. Pogorelova

Institute of Theoretical and Experimental Biophysics, Russian Academy of Sciences,

Institutskaya ul. 3, Pushchino, Moscow Region, 142290 Russia

The action of electrochemically activated water on the fine structure of biofilms generated by the plankton

forms of lacto bacteria and E. coli was investigated. Bacterial films have been grown on the inner tuber surface

of flow reactor imitating pipeline. Applying scanning electron microscopy approaches, the detailed relief of

biofilms was visualized. The catholite treatment followed with anolite was exhibited to destroy both the or-

ganic polymer matrix of biofilms and bacterial cells embedded in the matrix. This work was supported by the

Russian Science Foundation grant № 17-76-20014.

Keywords: biofilm, scanning electron microscopy, flow cell reactor, E. coli, lactate bacteria, catholite, anolite

БИОФИЗИКА том 64

№ 4

2019