БИОФИЗИКА, 2019, том 64, № 5, с. 837-840

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОФИЗИКА

УДК 577.3

К ВОПРОСУ ОБ ОСОБЕННОСТЯХ АГРЕГАЦИИ МУЛЬТИДОМЕННЫХ

МЫШЕЧНЫХ БЕЛКОВ

Н.Н. Салмов*, А.Г. Бобылёв*, И.М. Вихлянцев* ***

*Инcтитут теоpетичеcкой и экcпеpиментальной биофизики PАН,

142290, Пущино Моcковcкой облаcти, Инcтитутcкая ул., 3

**Инcтитут физико-химических и биологических проблем почвоведения PАН,

142290, Пущино Моcковcкой облаcти, Инcтитутcкая ул., 2

***Пущинcкий гоcудаpcтвенный еcтеcтвенно-научный инcтитут,

142290, Пущино Моcковcкой облаcти, пpоcп. Науки, 3

E-mail: liamar@rambler.ru, bobylev1982@gmail.com, ivanvikhlyantsev@gmail.com

Поступила в редакцию 26.07.2019 г.

После доработки 26.07.2019 г.

Принята к публикации 02.08.2019 г.

Светлой памяти Зои Александровны Подлубной посвящается

Предположение, которое легло в основу данной работы, сделано на основании проведенных нами

исследований, которые показали, что гигантские мультидоменные мышечные белки семейства ти-

тина (изоформы титина и паралоги миозинсвязывающего белка С) формируют амилоидные агрега-

ты in vitro. С помощью набора методов, в том числе рентгеновской дифракции, мы выявили ряд осо-

бенностей амилоидной агрегации вышеупомянутых белков: 1) способность агрегировать при сни-

жении ионной силы и значении pH 7,0; 2) высокую скорость агрегации; 3) формирование агрегатов,

имеющих четвертичную структуру, напоминающую кросс-β-структуру, свойственную многим ами-

лоидам; 4) отсутствие изменений во вторичной структуре при формировании амилоидо-подобных

агрегатов; 5) частичную обратимость амилоидной агрегации. В данной работе мы задаемся вопро-

сами: «Возможна ли амилоидная агрегация этих белков in vivo? И если да, то в чем может заключать-

ся функциональное значение подобной агрегации в мышечной клетке?» Мы полагаем, что в про-

цессе мышечного сокращения в саркомере могут формироваться временно образующиеся амилои-

до-подобные структуры при взаимодействии отдельных молекул мультидоменных мышечных

белков. Такие изменения, несомненно, будут сопровождаться увеличением жесткости саркомеров

и мышцы в целом, что может играть положительную роль в предотвращении неблагоприятных по-

следствий для мышцы при экстремальных физических нагрузках.

Ключевые слова: мультидоменные мышечные белки, титин, миозин-связывающий белок С, амилоиды,

амилоидная агрегация, функциональные амилоиды.

DOI: 10.1134/S0006302919050016

роким распространением у человека и животных

Предположение, которое легло в основу дан-

амилоидозов - заболеваний, при которых в раз-

ной работы, сделано на основании проведенных

ных органах и тканях находят амилоидные отло-

нами исследований, которые показали, что ги-

жения, в состав которых входят агрегаты непра-

гантские мультидоменные мышечные белки се-

мейства титина (изоформы титина и паралоги

вильно свернутых белков. В настоящее время

миозинсвязывающего белка С) формируют ами-

идентифицированы 36 таких белков/пептидов, в

лоидные агрегаты in vitro. Агрегация белков яв-

частности, Aβ-пептид, тяжелые цепи иммуно-

ляется достаточно распространенным процес-

глобулина, β2-микроглобулин и другие. В число

сом, происходящим в клетках живого организ-

заболеваний, ассоциированных с амилоидными

ма. В свою очередь, агрегация может быть

отложениями, входят амилоидоз печени/по-

амилоидной и неамилоидной. Агрегация белков

чек/селезенки, болезнь Альцгеймера, Паркин-

по амилоидному типу вызывает большой инте-

сона, диабет II типа, прионные заболевания, си-

рес у исследователей во всем мире, в связи с ши-

стемные амилоидозы и другие [1-5]. Однако все

больше исследователей обращают внимание на

Сокращения:

другой тип амилоидных агрегатов - функцио-

MyBP-C - миозинсвязывающий белок С.

837

838

БОБЫЛЁВА и др.

нальные амилоиды, формирование которых не

поперечнополосатых мышц позвоночных. В

связано с заболеваниями, а наоборот, необходи-

быстрых и медленных волокнах скелетных

мо для выполнения определенных функций, на-

мышц, а также в сердечной мышце экспрессиру-

пример защитной у бактерий. К таким белкам,

ются три паралога MyBP-C [22,23]. Каждый пара-

формирующим функциональные амилоиды,

лог кодируется отдельным геном, но все эти бел-

входящие в состав биопленок бактерий, отно-

ки имеют сходную структурную организацию и

сятся: курлин у E. coli [6], тафи у Salmonella spp.

состоят из последовательности иммуноглобулин-

[7], чаплины у Streptomyces coelicolor [8]. К функ-

подобных и фиброннектин III-подобых доменов

циональным амилоидам относятся фибриллы

[23]. Предполагаeтся, что этот белок может нести

спидроина, которые входят в состав нитей пау-

структурную функцию и участвовать в регуляции

тины [9], фибриллы Orb2 в синапсах нейронов

актин-миозинового взаимодействия.

Drosophila [10], а также фибриллы Pmel17 в мела-

В 2003 г. З.А. Подлубной было сделано предпо-

носомах человека [11]. Известно, что для всех

ложение, что титин и MyBP-C могут формиро-

амилоидных агрегатов характерно наличие чет-

вать амилоидные агрегаты in vitro. Это предполо-

вертичной кросс-β-структуры [12]. Однако до

жение было высказано на основании морфологи-

сих пор неясно, какие молекулярные механизмы

ческого сходства амилоидных фибрилл Аβ-

регулируют процесс образования патологиче-

пептида и спирально-скрученных фибрилл

ских или функциональных амилоидов.

MyBP-C (Х-белка), обнаруженных ранее в работе

Изучение процесса амилоидной агрегации

[24]. Проведенные нами впоследствии экспери-

белков in vitro является широко распространен-

менты по связыванию агрегатов титина и MyBP-

ным подходом. Объектом наших исследований

C поперечнополосатых мышц кролика с красите-

были гигантские мультидоменные мышечные

лями на амилоиды Конго красным и тиофлави-

белки семейства титина.

ном Т подтвердили их амилоидную природу [25-

Титин (тайтин/коннектин) был открыт в конце

27]. Однако, учитывая неспецифичность связы-

70-х годов ХХ века [13,14]. К настоящему времени

вания вышеуказанных красителей, в частности

показано, что альтернативный сплайсинг гена ти-

Конго красного, с амилоидами [28], полученных

тина (TTN) приводит к образованию в поперечно-

данных было недостаточно, чтобы с уверенно-

полосатых мышцах изоформ с молекулярной мас-

стью утверждать, что исследуемые нами белки

сой 700-3700 кДа [15]. В гладких мышцах позво-

формируют амилоидные агрегаты. Из литератур-

ночных обнаружены изоформы титина с

ных источников известно, что основной особен-

молекулярной массой 500-2000 кДа [16,17]. Все

ностью всех амилоидных агрегатов является на-

изоформы титина имеют общее строение: белок

личие у них четвертичной кросс-β-структуры

состоит из последовательности повторяющихся

[29]. Поиск ответов на вопросы о том, происходит

тандемов гомологичных фиброннектин III-подоб-

ли формирование четвертичной кросс-β-структу-

ных и иммуноглобулин-подобных доменов [18,19].

ры при агрегации in vitro титина и MyBP-C и ка-

В саркомерах сердечной и скелетных мышц позво-

кие структурные изменения при этом происходят

ночных титин является третьим по количеству

в молекулах этих белков, стал целью наших даль-

(после актина и миозина) белком. Его молекулы

нейших исследований.

длиной около 1 мкм и диаметром 3-4 нм перекры-

Для исследования агрегации титина и MyBP-C

вают половину саркомера от М-зоны до Z-диска,

in vitro нами были применены следующие методы:

формируя третий тип нитей, получивших назва-

атомно-силовая и электронная микроскопия, ди-

ние эластичных [19]. В А-зоне саркомера титин

намическое светорассеяние, рентгеновская ди-

связан с миозиновыми нитями. В I-зоне эластич-

фракция, малоугловое рентгеновское рассеяние,

ная часть молекулы титина способна развивать

круговой дихроизм, инфракрасная спектроско-

пассивное напряжение при растяжении и возврат-

пия с преобразованием Фурье. Мы показали на-

ную силу при сокращении саркомера. Биофизиче-

личие кросс-β-структуры у агрегатов титина

ские исследования показали, что эта часть молеку-

[30,31], а также получили предварительные дан-

лы титина ведет себя как «нелинейная энтропий-

ные о наличии кросс-β-структуры в агрегатах

ная пружина», которая распрямляется при

MyBP-C (неопубликованные данные). Были вы-

воздействии на нее силы от 20 до 30 пН и оказыва-

явлены также следующие особенности амилоид-

ет упругое сопротивление при сжатии с силой 2,5

ной агрегации титина и MyBP-C, которые в сово-

пН [20]. Титин - полифункциональный белок.

купности не были показаны ни для одного из из-

Обсуждается его роль в поддержании высокоупо-

вестных амилоидных белков:

1) способность

рядоченной саркомерной структуры, в регуляции

агрегировать при снижении ионной силы и зна-

актин-миозинового взаимодействия и процессов

чении pH 7,0; 2) высокую скорость агрегации;

клеточной сигнализации [21].

3) частичную обратимость амилоидной агрега-

Миозинсвязывающий белок С (MyBP-C) от-

ции;

4) отсутствие изменений во вторичной

носится к белкам семейства титина. Белок лока-

структуре при формировании амилоидных агре-

лизуется на поверхности миозиновых нитей в се-

гатов с кросс-β-структурой. Обращая внимание

редине каждой половины А-диска в саркомерах

на последнюю особенность амилоидной агрега-

БИОФИЗИКА том 64

№ 5

2019

К ВОПРОСУ ОБ ОСОБЕННОСТЯХ АГРЕГАЦИИ

839

ции мультидоменных мышечных белков, следует

может происходить формирование кросс-β-

отметить, что в некотором смысле мы получили

структуры. Это, несомненно, будет сопровож-

парадоксальные результаты, которые не уклады-

даться увеличением жесткости саркомеров и

ваются в рамки существующей концепции ами-

мышцы в целом, поскольку известно, что амило-

лоидогенеза. Ведь по существующим представле-

идные структуры обладают высокой жесткостью

ниям формирование кросс-β-структуры в про-

[40]. Функциональное значение подобных изме-

цессе амилоидной агрегации белков происходит с

нений может заключаться в противодействии

увеличением процентного содержания β-склад-

сверхрастяжению саркомеров и, вследствие это-

чатой структуры и уменьшением содержания

го, в предотвращении неблагоприятных послед-

α-спиральных и неупорядоченных участков [32].

ствий для мышцы при экстремальных физиче-

Подобные изменения не наблюдались во вторич-

ских нагрузках. Учитывая наши данные об обра-

ной структуре исследуемых нами белков при их

тимости амилоидной агрегации титина

[31],

амилоидной агрегации [30,31]. Кроме того, во

можно полагать, что формирование функцио-

вторичной структуре агрегированных молекул

нально-значимых кросс-β-структур будет вре-

титина и MyBP-C остается большое количество

менное, без перехода в патологическую агрега-

неупорядоченных участков (более 30%). Можно

цию, которая является необратимой.

предположить, что при формировании кросс-β-

Справедливости ради нужно отметить, что нет

структуры в процессе амилоидной агрегации

прямых доказательств для сделанных нами пред-

мультидоменных мышечных белков происходят

положений и вряд ли в ближайшее время появит-

незначительные внутримолекулярные пере-

ся техническая возможность для регистрации in

стройки, возможно, с частичным раскрытием до-

vivo амилоидной агрегации мультидоменных мы-

менов. Этих трансформаций достаточно, чтобы

шечных белков. Однако мы надеемся, что полу-

сформировать кросс-β-структуру при сохране-

ченные нами данные вносят вклад в расширение

нии вторичной структуры белка. В пользу этого

фундаментальных представлений об особенно-

предположения можно привести следующие дан-

стях белковой агрегации.

ные. Известны результаты in vitro исследований,

свидетельствующие о возможности разворачива-

ния доменов титина и MyBP-C [33-38]. В частно-

БЛАГОДАРНОСТИ

сти, показано, что для разворачивания доменов

Работа выполнена с использованием оборудо-

титина требуется приложить силу ~10 пН [37,38] и

вания Центров коллективного пользования

~30 пН - для разворачивания доменов MyBP-C

ИТЭБ РАН и ИБК РАН.

[33]. На основании измерений in situ растяжимо-

сти молекул титина в саркомерах изолированных

миофибрилл, высказано предположение о воз-

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

можности разворачивания иммуноглобулин-по-

Работа выполнена при финансовой поддержке

добных доменов титина в I-зоне интактной мыш-

Российского фонда фундаментальных исследова-

цы [37]. По мнению этих авторов, подобные

ний (грант № 18-015-00268).

трансформации в титине могут вносить вклад в

генерацию силы при развитии мышечного сокра-

щения. Однако возможна ли при этом амилоид-

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ная агрегация этих белков и в чем может заклю-

чаться функциональное значение подобной агре-

1. J. D. Sipe, M. D. Benson, J. N. Buxbaum, et al., Amy-

loid 23 (4), 209 (2016).

гации в мышечной клетке?

2. T. P. Knowles, M. Vendruscolo, and C. M. Dobson,

Впервые предположение о возможной амило-

Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (6), 384 (2014). DOI:

идной агрегации мультидоменных мышечных

10.1038/nrm3810.

белков in vivo и возможном функциональном зна-

3. C. M. Dobson, Methods 34, 4 (2004).

чении подобной агрегации было сделано

4. J. N. Buxbaum and R. P. Linke, J. Mol. Biol. 421, 142

З.А. Подлубной в 2012 г. [39]. В частности, она

(2000).

сделала допущение о том, что существует вероят-

5. C. M. Dobson, Semin. Cell Dev. Biol. 15, 3 (2004).

ность перехода саркомерных белков семейства

6. A. Olsen, A. Jonsson, and S. Normark, Nature 338, 652

титина в некое суперструктурированное состоя-

(1989).

ние (подобное амилоидной агрегации) для того,

чтобы избежать повышенного протеолиза этих

7. U. Römling, Z. Bian, M. Hammar, et al., J. Bacteriol.

180, 722 (1998).

белков при изменении физиологических усло-

вий, например, при зимней спячке. Учитывая по-

8. D. Claessen, R. Rink, W. de Jong, et al., Genes Dev. 17,

лученные нами новые данные и результаты ис-

1714 (2003).

следований вышеупомянутых авторов [33-38],

9. U. Slotta, S. Hess, K. Spiess, et al., Macromol. Biosci.

мы можем предполагать, что в саркомерах за счет

7, 183 (2007).

взаимодействия β-цепей частично развернутых

10. R. Hervás, L. Li, A. Majumdar, et al., PLoS Biol. 14

доменов соседних молекул титина или MyBP-C

(1), e1002361 (2016).

БИОФИЗИКА том 64

№ 5

2019

840

БОБЫЛЁВА и др.

11. D. M. Fowler, A. V. Koulov, C. Alory-Jost., et al.,

26. Л. Г. Марсагишвили, М. Д. Шпагина, Ю. В. Ша-

PLoS Biol. 4 (1), e6 (2006). DOI: 10.1371/journal.

талин и др., Биофизика 51 (5), 799 (2006).

pbio.0040006.

27. З. А. Подлубная, Л. Г. Марсагишвили и Л. М. Чай-

12. R. Nelson and D. Eisenberg, Adv. Prot. Chem. 73, 235

лахян, Докл. РАН 418 (4), 553 (2008).

(2006).

28. E. I. Yakupova, L. G. Bobyleva, I. M. Vikhlyantsev, and

A. G. Bobylev, Biosci. Rep. 39 (1), pii: BSR20181415

13. K. Wang, J. McClure, and A. Tu, Proc. Natl. Acad. Sci.

(2019). DOI: 10.1042/BSR20181415.

USA 76 (8), 3698 (1979).

29. A. E. Langkilde and B. Vestergaard, FEBS Lett. 583

14. K. Maruyama, S. Kimura, K. Ohashi, and Y. Kuwano,

(16), 2600 (2009).

J. Biochem. 89, 701 (1981).

30. A. G. Bobylev, O. V. Galzitskaya, R. S. Fadeev, et al.,

15. W. Guo, S. J. Bharmal, K. Esbona, and M. L. Greaser,

Biosci. Rep.

(3), pii: e00334

(2016). DOI:

J. Biomed. Biotechnol. 2010, 753675 (2010). DOI:

10.1042/BSR20160066.

10.1155/2010/753675. Epub 2010 Mar 21.

31. E. I. Yakupova, I. M. Vikhlyantsev, L. G. Bobyleva,

16. K. Kim and T.C. Keller, 3^rd, J. Cell Biol. 156, 101

et al., J. Biomol. Structure & Dynamics 36 (9), 2237

(2002).

(2018). DOI: 10.1080/07391102.2017.1348988.

17. S. Labeit, S. Lahmers, C. Burkart, et al., Mol. Biol.

32. R. Nelson and D. Eisenberg, Adv. Prot. Chem. 73, 235

362, 664 (2006).

(2006).

18. S. Labeit and B. Kolmerer, Science 270, 293 (1995).

33. Á. Karsai, M. S. Z. Kellermayer, and S. P. Harris, Bio-

phys. J.

101

(8):

1968

(2011). DOI:

10.1016/

19. L. Tskhovrebova and J. Trinick, Nat. Rev. Mol. Cell Bi-

j.bpj.2011.08.030.

ol. 4, 679 (2003).

34. P. Bianco, Z. Mártonfalvi, K. Naftz, et al., Biophys. J.

20. M. S. Kellermayer, S. B. Smith, H. L. Granzier, and

109 (2), 340 (2015).

C. Bustamante, Science 276 (5315), 1112 (1997).

35. Z. Mártonfalvi, P. Bianco, K. Naftz, et al., Prot. Sci.

21. I. M. Vikhlyantsev and Z, A. Podlubnaya, Biochemis-

26, 1380 (2017). DOI: 10.1002/pro.3117.

try (Moscow)

(13),

1515

(2012). doi: 10.1134/

36. D. Giganti, K. Yan, C. L. Badilla, et al., Nature Com-

S0006297912130093.

munications 9, 185 (2018). DOI: 10.1038/s41467-017-

22. K. Yamamoto and C. Moos, J. Biol. Chem. 258, 8395

02528-7.

(1983).

37. J. A. Rivas-Pardo, E. C. Eckels, I. Popa, et al., Cell Re-

23. L. Carrier, G. Bonne, and K. Schwartz, Circ. Res. 80,

ports 14, 1339 (2016).

427 (1997).

38. E. C. Eckels, Sh. Haldar, R. Tapia-Rojo, et al., Cell Re-

24. P. Bennett, R. Craig, R. Starr, and G. Offer, J. Muscle

ports 27, 1836 (2019).

Res. Cell Motil. 7 (6), 550 (1986).

39. З. А. Подлубная и А. Г. Бобылёв, Биофизика 57 (5),

25. Л. Г. Марсагишвили, М. Д. Шпагина, В. И. Емель-

751 (2012).

яненко и З. А. Подлубная, Биофизика 50 (5), 803

40. E. I. Yakupova, I. M. Vikhlyantsev, M. Y. Lobanov,

(2005).

et al., Biochemistry (Moscow) 82 (13), 1675 (2017).

On Peculiarities of the Aggregation of Multidomain Muscle Proteins

L.G. Bobyleva*, E.I. Yakupova*, A.D. Ulanova*, S.N. Udaltsov**, S.A. Shumejko*, N.N. Salmov*,

A.G. Bobylev*, and I.M. Vikhlyantsev* ***

*Institute of Theoretical and Experimental Biophysics, Russian Academy of Sciences,

Institutskaya ul. 3, Pushchino, Moscow Region, 142290 Russia

**Institute of Physicochemical and Biological Problems in Soil Science, Russian Academy of Sciences,

Institutskaya ul. 2, Pushchino, Moscow Region, 142290 Russia

***Pushchino State Institute of Natural Sciences, Prosp. Nauki 3, Pushchino, Moscow Region, 142290 Russia

This article is based on our previous studies which have shown that giant multidomain muscle proteins from

the titin family (isoforms of titin and myosin-binding protein C) form amyloid aggregates in vitro. Using dif-

ferent methods, including X-ray diffraction, we identified a number of features of amyloid aggregation of the

above-mentioned proteins: (1) the ability to aggregate with a decrease in ionic strength of a solution and at a

pH value of 7.0; (2) a high protein aggregation rate; (3) formation of aggregates with a quaternary structure

like cross-β, which is considered to be a common property of many amyloids; (4) no changes in the secondary

structure during the formation of amyloid-like aggregates; (5) partial disaggregation of amyloid aggregates. In

this article we ask questions“Is amyloid aggregation of these proteins possible in vivo? If so, what could be the

functional significance of such aggregation in the muscle cells? We suppose that individual molecules of mul-

tidomain muscle proteins may interact together and form temporarily amyloid-like structures during muscle

contraction. In this case, an increase in stiffness of the sarcomeres and the muscle as a whole would be ob-

served, which can play a positive role in preventing adverse effects on the muscle during intense physical ex-

ercise.

Keywords: multidomain muscle proteins, titin, myosin-binding protein C, amyloids, amyloid aggregation, func-

tional amyloid

БИОФИЗИКА том 64

№ 5

2019