БИОФИЗИКА, 2019, том 64, № 5, с. 866-868

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОФИЗИКА

УДК 577.3

Са²⁺-СВЯЗЫВАЮЩИЙ БЕЛОК, РЕГУЛИРУЮЩИЙ ВРЕМЯ ЖИЗНИ

АКТИВНОГО СОСТОЯНИЯ ТРАНСДУЦИНА

Инcтитут теоретической и экспериментальной биофизики РАН,

142290, Пущино Московской области, Институтская ул., 3

E-mail: norlov46@mail.ru

Поступила в редакцию 19.07.2019 г.

После доработки 25.07.2019 г.

Принята к публикации 02.08.2019 г.

Ранее при исследовании кинетического поведения cGMP-специфичной фосфодиэстеразы в

препаратах наружных сегментов палочек сетчатки быка, кратковременно активированной 2 мкМ

GTP при высоких и низких концентрациях (100 мкМ и <10 нМ, соответственно) свободных ионов

Ca²⁺, было показано, что время жизни cGMP-специфичной фосфодиэстеразы в активном

состоянии заметно (≈2 раза) уменьшалось при использовании низких концентраций свободных

ионов кальция Ca²⁺. Это предполагало, что в наружных сегментах палочек сетчатки быка

присутствует Ca²⁺-связывающий белок, способный взаимодействовать с так называемым

«свободным» трансдуцином и регулировать скорость гидролиза связанного в его активном центре

GTP в зависимости от концентрации свободных ионов Ca²⁺. Настоящая работа посвящена

обсуждению вопроса о том, какой из известных существующих в наружных сегментах палочек

сетчатки быка Ca²⁺-связывающих белков мог бы играть роль искомого регулятора.

Ключевые слова: наpужные cегменты палочек cетчатки, cиcтема фототpанcдукции, cGMP-

cпецифичная фоcфодиэcтеpаза, G-белки, тpанcдуцин, Ca²⁺-связывающие белки фоторецепторов

сетчатки, аффинная хроматография, кальмодулин-сефароза, pегуляция ионами Mg²⁺ и Ca²⁺.

DOI: 10.1134/S0006302919050053

при ее взаимодействии с ингибиторной γ-субъ-

Ранее методом рН-метрии в препаратах свето-

единицей cGMP-специфичной фосфодиэстера-

адаптированных наружных сегментов палочек

зы, но и до известной степени зависит также от

(НСП) сетчатки быка мы исследовали кинетиче-

ское поведение cGMP-специфичной фосфодиэс-

концентрации свободных ионов Ca²⁺ [1]. Это со-

теразы, активированной 2 мкМ GTP при высоких

гласовывалось с представлениями, полученными

и низких концентрациях (100 мкМ и < 10 нМ со-

нами ранее в результате прямых измерений вре-

мени гидролиза GTP в активном центре трансду-

ответственно) свободных ионов Ca²⁺ [1]. Такой

цина, выполненных в так называемом «однообо-

подход показал, что время жизни cGMP-специ-

ротном» режиме ([GTP] << [трансдуцин]) с помо-

фичной фосфодиэстеразы в активном состоянии

заметно (в полтора-два раза) уменьшалось при

щью препарата

[α-³²P]GTP c удельной

активностью ≈ 500 Ки/ммоль [3,4]. Синтез этих

низких концентрациях свободных ионов Ca²⁺ [1].

результатов и представлений послужил основой

Полученные результаты укладывались в точку

для формирования точки зрения, согласно кото-

зрения, согласно которой время жизни активного

состояния G-белка трансдуцина, посредника в

рой Ca²⁺-зависимой инактивации подвергается

популяция так называемого «свободного» транс-

передаче возбуждения от молекулы фотоактиви-

дуцина, т. е. белка, который активировался при

рованного родопсина на молекулы cGMP-специ-

фичной фосфодиэстеразы, определяется не толь-

взаимодействии с родопсином, но не успел всту-

пить во взаимодействие с cGMP-специфичной

ко функционированием известной системы

фосфодиэстеразой за время, определяемое дли-

RGS-белков (RGS9-1, R9AP, Gtβ5-L) (см., на-

тельностью развития ответа фоторецептора [1].

пример, работу [2]), ускоряющих скорость гидро-

Такая ситуация, возникающая потому, что кон-

лиза GTP в активном центре его α-субъединицы

центрация активированного трансдуцина значи-

Сокращения: НСП - наружные сегмента палочек сетчатки,

тельно превышает концентрацию фермента-ми-

GCAP - Са²⁺-зависимый активатор гуанилатциклазы.

шени (cGMP-специфичной фосфодиэстеразы),

866

Са²⁺-СВЯЗЫВАЮЩИЙ БЕЛОК

867

была подтверждена в результате моделирования

дованию трансдуцина, присутствие кальмодули-

диффузионного поведения молекул, являющихся

на и рековерина в составе трансдуцинового ком-

главными участниками системы фототрансдук-

плекса отмечено не было. Кроме того, по данным

ции, методом Монте-Карло [5].

независимого определения

[8] концентрации

этих белков в НСП значительно уступают кон-

Полученные результаты предполагают, что в

центрации трансдуцина.

НСП присутствует Ca²⁺-связывающий белок,

способный взаимодействовать со «свободным»

Все это заставляет сомневаться в том, что роль

трансдуцином и регулировать скорость гидролиза

искомого регулятора могли бы играть кальмоду-

связанного в его активном центре GTP в зависи-

лин или рековерин и позволяет предположить,

что данную роль может играть еще один из при-

мости от концентрации свободных ионов Ca²⁺. В

связи с этим наше внимание привлекли получен-

сутствующих в НСП Са²⁺-связывающих белков,

ные ранее данные, согласно которым трансдуцин

идентифицированный ранее как регулятор ак-

способен взаимодействовать с кальмодулином

тивности гуанилатциклазы (GCAP-белок). Дан-

Ca²⁺-зависимым образом. Это было продемон-

ный белок, в отличие от других Са²⁺-связываю-

стрировано нами, в частности, методом аффин-

щих белков НСП, является функционально-ак-

ной хроматографии на кальмодулин-сефарозе [6]

тивным в комплексе с ионами Mg²⁺. Такой

и согласовывалось с результатами ряда работ, вы-

комплекс образуется при падении концентрации

полненных с помощью различных методов и под-

свободных ионов Са²⁺ в цитоплазме НСП в ответ

ходов, в которых было продемонстрировано вза-

на свет. Поэтому можно предположить, что в

имодействие между кальмодулином и комплекса-

комплексе с ионами Mg²⁺ он не только активиру-

ми βγ-субъединиц ряда других G-белков (см.,

ет гуанилатциклазу [11], но и, присутствуя в НСП

например, работу [7]).

в заметной концентрации, составляющей около

Совокупность этих данных создавала впечат-

20% от концентрации трансдуцина [11], способен

ление, что искомым регулятором времени жизни

комплексироваться со «свободным» трансдуци-

свободной формы трансдуцина может быть каль-

ном и активировать гидролиз GTP в активном

модулин. Однако кальмодулин далеко не един-

центре его α-субъединицы. Возможная бифунк-

ственный присутствующий в НСП представитель

циональность этого белка выглядит дополнитель-

семейства Са²⁺-связывающих белков. В частно-

но привлекательной, поскольку способна обеспе-

сти, в конце 1990-х годов методом аффинной хро-

чить синхронную регуляцию процесса синтеза

матографии на мелиттин-сефарозе нами было

cGMP гуанилатцилазой и инактивацию процесса

показано, что в НСП, помимо кальмодулина,

гидролиза cGMP фосфодиэстеразой в ответ на

присутствуют белки с кажущейся молекулярной

индуцированное светом падение концентрации

массой 26 и 23 кДa, взаимодействующие с сорбен-

свободных ионов Са²⁺ в цитоплазме НСП.

том Са²⁺-зависимым образом [8]. В результате

Предполагалось [12], что ускорение задней

большого количества последующих работ эти

фазы фотоответа при действии на фоторецептор

белки были идентифицированы соответственно

фонового облучения обусловлено фосфорилиро-

как Са²⁺-зависимый активатор гуанилатциклазы

ванием белков RGS-комплекса, что и ускоряет

(GCAP-белок) и как рековерин - Са²⁺-зависи-

процесс инактивации трансдуцина. Фосфорили-

мый регулятор активности протеинкиназы, фос-

рование осуществляется родопсинкиназой, акти-

форилирующей родопсин (см., например, работы

вирующейся в ответ на опосредованное рекове-

[9-11]). В связи с этим настоящая работа посвя-

рином фотоиндуцированное падение концентра-

щена обсуждению вопроса о том, какой именно

ции свободных ионов Са²⁺ в цитоплазме НСП.

из существующих в НСП Ca²⁺-связывающих бел-

Эта экзотическая точка зрения, предполагающая

ков мог бы играть роль искомого регулятора.

мультифункциональность родопсинкиназы, од-

В рамках традиционных представлений о ме-

нако, не получила подтверждения - делеция гена

ханизмах функционировании кальмодулина и ре-

рековерина не оказала ожидаемого влияния на

коверина

[9-11], функционально-активных в

характеристики фотоответов. Это и привело к

комплексе с кальцием, а также схемах их взаимо-

предположению [12] о том, что, помимо регули-

действия с белком-мишенью легко допустить, что

руемых концентрацией свободных ионов Са²⁺

при так называемых «высоких» концентрациях

процессов синтеза cGMP и инактивации родоп-

свободных ионов Са²⁺, характерных для работы

сина родопсинкиназой, в НСП существуют до-

полнительные механизмы, которые регулируют

фоторецептора в темноте, кальмодулин и рекове-

рин должны входить в состав трансдуцинового

каскад фототрансдукции и, таким образом, обес-

комплекса и играть роль ингибитора процесса

печивают процесс адаптации к фоновой подсвет-

инактивации. Следовательно, их концентрация

ке. Наше предположение о возможном участии

должна быть не меньше чем концентрация транс-

Ca²⁺-зависимого GCAP-белка в процессе инак-

дуцинового комплекса. Однако, несмотря на

тивации «свободной» формы трансдуцина при

многочисленные работы по выделения и иссле-

понижении концентрации свободных ионов Са²⁺

БИОФИЗИКА том 64

№ 5

2019

868

ПЕТРУХИН и др.

в ответ на фоновую подсветку и может быть од-

5. О. В. Петрухин, Т. Г. Орлова, А. Р. Незвецкий и

ним из указаний в пользу существования таких

Н. Я. Орлов, Биофизика 61, 1128 (2016).

механизмов.

6. В. М. Грищенко, Т. Г. Орлова, А. А. Фрейдин и

Н. Я. Орлов, Биофизика 51, 817 (2006).

7. T. Asano, N. Ogasawara, S. Kitajima, and M. Sano,

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

FEBS Lett. 203, 135 (1986).

1. О. В. Петрухин, Т. Г. Орлова, А. Р. Незвецкий и

8. В. М. Грищенко, Т. Г. Орлова, А. А. Фрейдин, и

Н. Я. Орлов, Биофизика 59, 854 (2014).

Н. Я. Орлов, Докл. АН СССР 307, 1498 (1989).

2. V. Yu. Arshavsky and T. P. Wenzel, Invest. Ophthalmol.

9. A. M. Dizhoor, S. Ray, S. Kumar, et al., Science 251,

Vis. Sci. 54, 7725 (2013).

915 (1991).

3. В. Г. Тищенков, Автореф. дис

канд. биол. наук

10. E. N. Gorodovikova, A. A. Gimelbrant, I. I. Senin, and

(Пущино-Минск, 1984).

P. P. Philippov, FEBS Lett. 349, 187 (1994).

4. Н. Я. Оpлов, Cиcтемы фототpанcдукции палочек и

11. H.-G. Lambrecht and K.-W. Koch, EMBO J. 10, 793

колбочек cетчатки позвоночныx. Молекуляpные меx-

(1991).

анизмы (LAP LAMBERT Academic Publishing Gm-

12. Ch.-K. Chen, M. L. Woodruff, and G. L. Fain, J. Gen.

bH & Co KG, Saarbrücken, Deucschland, 2011).

Physiol. 145, 213 (2015).

Ca²⁺-Binding Protein that Regulates Lifetime of Transducin Active State

O.V. Petrukhin, T.G. Orlova, A.R. Nezvetsky, and N.Ya. Orlov

Institute of Theoretical and Experimental Biophysics, Russian Academy of Sciences,

Institutskaya ul. 3, Pushchino, Moscow Region, 142290 Russia

It has been shown by earlier study on the kinetic behavior of bovine retinal rod outer segment cGMP-specific

phosphodiesterase, activated by 2 μM GTP at high and low (100 μM and 10 nM, respectively) concentration of

free Ca²⁺ ions that an approximately twofold decreases in the lifetime of cGMP-specific phosphodiesterase in

an active state was notable at low concentrations of free Ca²⁺ ions. It has been suggested that retinal rod outer

segments contain Ca²⁺-binding protein that interacts with so called free transducin and regulates the rate of

GTP hydrolysis in its active site depending on the free Ca²⁺ ion concentration. This study is devoted to a discus-

sion of the question about what kind of retinal rod outer segments Ca²⁺-binding proteins may play a role of a

regulator of interest.

Keywords: bovine retinal rod outer segment, system of phototransduction, cGMP-specific phosphodiesterase, G-pro-

teins, transducin, Ca²⁺-binding proteins of retinal photoreceptors, affinity chromatography, calmodulin-sepharose,

regulation with Mg²⁺ and Ca²⁺ ions

БИОФИЗИКА том 64

№ 5

2019