БИОФИЗИКА, 2019, том 64, № 5, с. 945-949

БИОФИЗИКА КЛЕТКИ

УДК 616.71-003.93, 57.089.67

АГРЕГАЦИЯ ЧАСТИЦ НАНОРАЗМЕРНОГО ГИДРОКСИАПАТИТА

И ИНГИБИРОВАНИЕ ИМ КЛЕТОЧНОЙ АДГЕЗИИ КАК КЛЮЧЕВЫЕ

ФАКТОРЫ ОГРАНИЧЕНИЯ ЕГО БИОИНТЕГРАЦИИ

И.С. Фадеева, В.С. Акатов

Инcтитут теоретической и экспериментальной биофизики РАН,

142290, Пущино Московской области, Институтская ул., 3

*Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы, 1

E-mail: fadeeva.iteb@gmail.com

Поступила в редакцию 05.07.2019 г.

После доработки 23.07.2019 г.

Принята к публикации 26.07.2019 г.

В реконструктивной хирургии костной ткани в качестве остеопластических материалов для запол-

нения дефектов костной ткани используются различные синтетические кальциево-фосфатные со-

единения. Особый интерес представляет наноразмерный гидроксиапатит благодаря своей схожести

с гидроксиапатитом костной ткани и потенциальной остеоиндуктивности. Однако известно, что

наноразмерный гидроксиапатит может ингибировать процессы биоинтеграции материалов, и в на-

стоящее время нет четкого представления о механизмах этого эффекта. Нами in vitro было показано,

что наноразмерный гидроксиапатит подавляет адгезивность клеток к нему, и это может быть при-

чиной аноикиса. Исследования в модели гетеротопической имплантации материалов под кожу

крысам показали, что наноразмерный гидроксиапатит в условиях in vivo образует слаборезорбиру-

ющийся агломерат, блокирующий миграцию клеток в материал, а также процессы неоколлагенеза

на нем, в том числе процессы инкапсуляции материала. При этом процессы неоколлагенеза по пе-

риферии образца наблюдаются только поверх плотного слоя мертвых клеток (клеточного дебриса),

окружающих агломерировавший наноразмерный гидроксиапатит. Добавление деминерализован-

ного костного коллагенового матрикса к наноразмерному гидроксиапатиту в качестве кондуктив-

ного компонента способствует заселению материала клетками, резорбции наноразмерного гидрок-

сиапатита и активному построению неоколлагенового матрикса. Представленные результаты ука-

зывают на необходимость модификации наноразмерного гидроксиапатита кондуктивным

компонентом с целью предотвращения его агломерации и повышения его биоинтеграции и остео-

индуктивного потенциала в организме.

Ключевые слова: остеопластические материалы, наноразмерный гидроксиапатит, биоинтеграция,

адгезия, аноикис.

DOI: 10.1134/S0006302919050156

кальциево-фосфатных соединений является гид-

На сегодняшний день в различных областях

роксиапатит [1]. Благодаря своей схожести с гид-

медицины, таких как ортопедия, травматология,

челюстно-лицевая хирургия и др., широко вос-

роксиапатитом костной ткани и природным

требованы остеопластические материалы для хи-

остеоиндуктивным свойствам особый интерес

представляет синтетический наноразмерный

рургического лечения повреждений костной тка-

ни различной этиологии (травмы, остеопороз,

гидроксиапатит (нГАп) [2,3]. Однако нГАп также

обладает рядом недостатков. Частицы нГАп мо-

новообразования и т.д.).

гут инициировать развитие воспалительного от-

Одним из подходов к созданию остеопласти-

вета на материал вплоть до его отторжения, усу-

ческих материалов является разработка имплан-

губляя, таким образом, процесс регенерации

тов на основе синтетических кальциево-фосфат-

костной ткани [4-7]. Подобные противоречия

ных соединений. На сегодняшний день одним из

говорят о недостаточности знаний о механизмах

наиболее используемых в медицинской практике

и факторах, определяющих успешную интегра-

Сокращения: нГАп

- наноразмерный гидроксиапатит,

цию подобных материалов в организме пациента

ДКК - деминерализованная костная крошка.

и необходимости их изучения для дальнейшего

945

946

МИНАЙЧЕВ и др.

совершенствования материалов на основе каль-

33342, 1 мкг/мл йодида пропидия и 2 мкМ каль-

циево-фосфатных соединений.

цеина АМ с последующей инкубацией в течение

Исходя из вышесказанного, целью настоящего

20 мин при температуре 37°С. После окрашива-

исследования являлось выявление биофизиче-

ния клетки отмывали раствором Хэнкса с добав-

лением 10 мМ органического буфера HEPES

ских факторов, влияющих на биоинтеграцию

нГАп в организме.

(«ПанЭко», Россия). Затем проводили оценку

морфологии и жизнеспособности клеток с ис-

пользованием конфокального микроскопа TCS

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

SP5 (Leica, Германия).

Синтез и определение физико-химических ха-

Экспериментальные животные. Для исследова-

рактеристик нанокристаллического гидроксиапати-

ния in vivo использовали самцов крыс стока Wistar

та. Синтез нГАп проводили по методике, описан-

массой 180-200 г, полученных из Клиники экспе-

ной ранее [8,9]. Средний размер частиц получен-

риментальных животных Института теоретиче-

ного нГАп составлял

20 нм. Полученный

ской и экспериментальной биофизики РАН (ИТ-

гидроксиапатит представлял собой пастообраз-

ЭБ РАН). В ходе эксперимента животных содер-

ную водную суспензию с массовой долей нГАп

жали в стандартных условиях (температура 21-

20%.

23°С, влажность

30-70%,

12-часовой период

Получение деминерализованной костной крош-

освещения, корм и вода - ad libitum). Все манипу-

ки. Деминерализованная костная крошка (ДКК)

ляции с животными осуществляли в соответствии

была получена путем измельчения деминерали-

с требованиями ГОСТ Р ИСО 10993-2-2009. Гете-

зованных костных блоков, изготовленных из губ-

ротопическую имплантацию биоматериалов про-

чатой костной ткани. Изготовление деминерали-

водили на срок в восемь недель в соответствии с

зованных костных блоков проводили по автор-

требованиями ГОСТ Р ИСО 10993-6-2011.

ской методике (Патент на изобретение

№ 2686309), включающей щадящую делипидиза-

цию и деминерализацию костной ткани [10]. По-

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

сле обработки осуществляли лиофильную сушку

Оценка выживаемости, прикрепления и распла-

материала на установке «ИНЕЙ-6» (ИБП РАН,

стывания клеток на нанокристаллическом гидрок-

Пущино, Россия) и его последующее измельче-

сиапатите in vitro. Цитотоксическое действие пас-

ние.

тообразного материала, а также прикрепление и

Культура клеток. Анализ биосовместимости

распластывание клеток на нем определяли, осно-

образцов нГАп в условиях in vitro проводили с ис-

вываясь на окрашивании клеток флуоресцентны-

пользованием стромальных клеток пульпы зуба

ми красителями Hoecst 33342 (окрашивает ядра

человека, полученных в соответствие с методи-

живых и погибших клеток в голубой цвет), йоди-

кой, описанной в работе [11]. Клетки культивиро-

дом пропидия (окрашивает ядра погибших кле-

вали в питательной среде DMEM/F12 (Sigma-Al-

ток в красный цвет) и кальцеином AM (окраши-

drich, США) с добавлением

10%-й эмбрио-

вает цитоплазму живых клеток в зеленый цвет).

нальной телячьей сыворотки (Gibco, США),

На рис. 1 представлена микрофотография клеток

80 мкг/мл сульфата гентамицина (Sigma-Aldrich,

через 24 ч после посева на покровное стекло и на

США) при 37°С, в условиях 5%-го содержания

покровное стекло, покрытое нГАп.

СО₂ в воздухе.

При микроскопическом анализе клеток, высе-

Цитотоксический тест и морфологический ана-

янных на покровные стекла (контрольные усло-

лиз адгезии и распластывания клеток in vitro. Для

вия), было обнаружено, что все клетки были при-

проведения экспериментов in vitro на покровное

крепленными и распластанными и имели типич-

стекло наносили тонкий слой пастообразного

ную фибробласто-подобную морфологию

нГАп. В качестве контроля использовали покров-

(рис. 1а). При анализе клеток, высеянных на

ные стекла, не покрытые материалом. Стекла по-

нГАп (рис. 1б), наблюдалось значительно мень-

мещали в чашку Петри, добавляли культураль-

шее число прикрепившихся клеток по сравнению

ную среду и производили посев клеток на поверх-

с контролем, при этом у прикрепившихся к мате-

ность покрытых и непокрытых нГАп стекол при

риалу клеток были нарушены процессы адгезии и

плотности посева 1 · 10⁴ клеток/см².

распластывания. Таким образом, было обнаруже-

но, что в условиях in vitro нГАп подавляет адгезию

Цитотоксический тест и морфологический

и распластывание клеток, что в конечном итоге

анализ адгезии и распластывания клеток на мате-

может приводить к индукции аноикиса - клеточ-

риале или вблизи него проводили через 24 ч после

ной гибели, опосредованной ингибированием

посева, используя флуоресцентные красители

прикрепления клеток к твердому субстрату.

Bisbenzimide Hoechst 33342, йодид пропидия и

кальцеин АМ. Клетки окрашивали путем добав-

Полученные in vitro результаты дают основа-

ления в культуральную среду 1 мкг/мл Hoechst

ние предполагать ограниченную биосовмести-

БИОФИЗИКА том 64

№ 5

2019

АГРЕГАЦИЯ ЧАСТИЦ НАНОРАЗМЕРНОГО ГИДРОКСИАПАТИТА

947

Рис. 1. Микрофотографии клеток, культивированных на покровном стекле (а) и на покровном стекле, покрытом

нГАп (б). Стрелками указаны ядра живых, нераспластанных клеток, утративших основную часть цитоплазмы.

мость наноразмерного гидроксиапатита вслед-

размерного гидроксиапатита была проведена ге-

ствие нарушения адгезии клеток к этому матери-

теротопическая имплантация образцов пастооб-

алу. Нарушение адгезии клеток к нГАп может

разного материала с содержанием нГАп, равным

ограничивать его биоинтеграцию и в условиях

20%. На основании полученных in vitro данных

in vivo.

было предложено использование деминерализо-

ванной костной крошки, полученной из демине-

Исследование остеогенных свойств пастообраз-

рализованных костных матриксов, в качестве ад-

ного нГАп и его сочетания с деминерализованным

гезивного проводника (кондуктивного компо-

костным коллагеновым матриксом в модели гетеро-

нента).

топической имплантации. С целью изучения

Через восемь недель гетеротопической им-

остеогенных свойств материалов на основе нано-

плантации в образцах пастообразного нГАп мате-

риала без дополнительных компонентов получе-

ние криосрезов образцов было невозможным, так

как нГАп, сливаясь в сплошной агломерат, бло-

кировал миграцию клеток в образец и процессы

неоколлагенеза, в результате чего вокруг матери-

ала ингибировался даже стандартный процесс об-

разования фиброзной капсулы. Также в данных

образцах материала не было обнаружено каких-

либо признаков биоинтеграции в организме экс-

периментальных животных. Помимо этого, было

отмечено развитие асептического воспаления на

месте имплантированных образцов и отторжение

материала через формирование кожной фистулы.

В свою очередь, результаты, полученные для

образцов группы нГАп с добавлением ДКК

(нГап/ДКК) на сроке восемь недель импланта-

ции, показали, что введение в пастообразный

нГАп остеокондуктивного компонента способ-

ствовало заселению материала клетками и ини-

Рис. 2. Микрофотографии криосрезов образцов груп-

циации начальных процессов биоинтеграции

пы нГАп/ДКК через 8 недель гетеротопической им-

нГАп в организме реципиента. В образцах

плантации крысам. Световая микроскопия, окраска

нГАп/ДКК наблюдались частичная резорбция

трихром по Лилли. * - Материал деминерализован-

ной костной крошки, стрелками указан зрелый нео-

гидроксиапатита и активные процессы неоколла-

коллаген.

генеза (рис. 2), однако образование соединитель-

БИОФИЗИКА том 64

№ 5

2019

948

МИНАЙЧЕВ и др.

обозначено тремя звездочками) с фрагментами

частично резорбированного нГАп (рис. 3б, стрел-

ки), под которым наблюдался следующий, про-

питанный ДНК, плотный слой агломерировав-

шего нГАп (интенсивно окрашенные гематокси-

лином области на рис. 3а, обозначены тройной

решеткой), в котором как клетки реципиента, так

и клетки клеточного дебриса не обнаружены. В

центральной части материала отсутствовали при-

знаки резорбции нГАп, а также признаки мигра-

ции клеток к фрагментам ДКК через слой плотно

агломерировавших частиц гидроксиапатита.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в проведенных исследованиях

показано, что биоинтеграция нГАп в организме

может быть лимитирована двумя основными

факторами - слабыми адгезивными свойствами

самого нГАп и образованием плотных, непрони-

цаемых для клеток агломератов частиц нГАп,

вследствие чего происходит ингибирование про-

цессов резорбции и биоинтеграции материала в

организме реципиента. В свою очередь, добавле-

ние биосовместимого кондуктивного компонен-

та обеспечивает заселение материала клетками и

построение неоколлагенового матрикса как на

фрагментах кондуктора, так и на месте резорби-

рованного гидроксиапатита.

Полученные данные указывают на необходи-

мость использования кондуктивного компонента

Рис. 3. Влияние кондуктора и нГап на миграцию кле-

совместно с нГАп и учета его оптимальной кон-

ток в материал. Микрофотографии криосрезов образ-

центрации для снижения степени агломерации

цов группы нГАп/ДКК через восемь недель имплан-

нГАп, уменьшения воспалительного ответа орга-

тации крысам. Световая микроскопия, окраска три-

низма и повышения степени биоинтеграции ма-

хром по Лилли. (а) - Гистотопограмма материала

нГАп/ДКК; (б) - увеличенный фрагмент материала

териала.

нГАп/ДКК в зоне клеточного дебриса. * - Деминера-

лизованная костная крошка, ** - неоколлагеновый

матрикс, *** - клеточный дебрис, ### - слой гидрок-

БЛАГОДАРНОСТИ

сиапатита, стрелками указаны агломераты гидрок-

сиапатита в клеточном слое.

Работа выполнена с использованием прибор-

ной базы ЦКП ИТЭБ РАН.

ной ткани происходило только по периферии об-

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

разца поверх плотного слоя клеточного дебриса и

непосредственно вблизи ДКК.

Работа выполнена при финансовой поддержке

Совета по грантам Президента РФ (СП-

На рис. 3 показано влияние кондуктивного

1275.2019.4) и Фонда содействия инновациям.

компонента и нГАп на миграцию клеток в мате-

риал. В образцах нГАп/ДКК наблюдалась выра-

женная гетерогенность: по периферии образца

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

наблюдалось частичное вытеснение ДКК

Все манипуляции с животными осуществля-

(рис. 3а, обозначено звездочкой) за счет агломе-

лись в соответствии с требованиями ГОСТ Р

рации частиц нГАп и формирование на фрагмен-

ИСО 10993-2-2009 и были одобрены этическим

тах ДКК и в контактных зонах зрелого неоколла-

комитетом ИТЭБ РАН.

гена (рис. 3а, обозначено двумя звездочками).

Ближе к центру образцов наблюдалось значи-

тельное уменьшение количества неоколлагена и

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

формирование зоны интенсивного скопления

1. A. S. Pankratov, I. S. Fadeeva, V. V. Minaychev, et al.,

клеточного дебриса (погибших клеток) (рис. 3а,

Genes and Cells XIII (3), 46 (2018).

БИОФИЗИКА том 64

№ 5

2019

АГРЕГАЦИЯ ЧАСТИЦ НАНОРАЗМЕРНОГО ГИДРОКСИАПАТИТА

949

2. X. Shi, K. Zhou, F. Huang, et al., Int. J. Nanomedicine

7. F. Velard, D. Laurent-Maquin, C. Guillaume, et al.,

13, 1457 (2018).

Acta Biomater. 5 (5), 1708 (2009).

8. V. V. Minaychev, A. T. Teleshev, V. N. Gorshenev,

3. M. N. Lee, H. S. Hwang, S. H. Oh, et al., Exp. Mol.

et al., IOP Conf. Series: Materials Science and Engi-

Med. 50, 142 (2018).

neering, 347, 012045 (2018).

4. N. J. Hallab and J. J. Jacobs, Bull. Hosp. Jt. Dis. 67 (2),

9. A. T. Teleshev, V. A. Fomichev, V. N. Gorshenev, et al.,

182 (2009).

Biomed. Eng. 52 (1), 19 (2018).

10. А. С. Сенотов, В. С. Акатов, И. С. Фадеева и др.,

5. P. Laquerriere, A. Grandjean-Laquerriere, S. Addadi-

Патент РФ №2686309, Б.И., №12 (2019).

Rebbah, et al., Biomaterials 25 (13), 2515 (2004).

11. Р. А. Полтавцева, Ю. А. Никонова, И. И. Селез-

6. J. M. Anderson and K. M. Miller, Biomaterials 5 (1), 5

нева и др., Клеточные технологии в биологии и

(1984).

медицине, № 3, 190 (2014).

Aggregation of Nanosized Hydroxyapatite Particles and Inhibition of Cell Adhesion

on This Bio-Active Material as Key Factors Limiting Its Biointegration

V.V. Minaychev*, P.O. Kirsanova*, A.I. Zvyagina*, A.S. Odintsova**, I.S. Fadeeva*, and V.S. Akatov*

**Institute of Theoretical and Experimental Biophysics, Russian Academy of Sciences,

Institutskaya ul. 3, Pushchino, Moscow Region, 142290 Russia

**Lomonosov Moscow State University, Moscow, Leninskie Gory 1, 119991 Russia

Different synthetic calcium phosphate compounds are used as osteoplastic materials for filling of bone de-

fects in surgical reconstruction of bone. Of particular interest is synthetic nanosized hydroxyapatite because

of its similarity to the chemical composition of the bone and osteoinductive potential. However, it is also

known that nanosized hydroxyapatite can inhibit the processes of biointegration of biomaterials but we have

no clear understanding of the mechanisms responsible for this effect. In our in vitro studies suppression of cell

adhesion on nanosized hydroxyapatite that may lead to anoikis was shown. Studies, in which rat subcutane-

ous heterotopic implantation methods were used, showed that nanosized hydroxyapatite in vivo formed a

slightly resorbable agglomerate that blocks cell migration into the material as well as neocollagenesis process-

es in it, including the processes of encapsulation of the material. In this case, the processes of neocollagenesis

along the periphery of the sample were observed only over of a dense layer of dead cells (cellular debris) sur-

rounding the agglomerated nanosized hydroxyapatite. An addition of demineralized bone collagen matrix to

nanosized hydroxyapatite as a conductive component contributed to colonization of the material by the cells,

resorption of nanosized hydroxyapatite and active construction of the neocollagen matrix. The presented re-

sults show that modification of nanosized hydroxyapatite with a conductive component is required in order

to prevent its agglomeration and thus increase its biointegration and osteoinductive potential in the body.

Keywords: osteoplastic materials, nanosized hydroxyapatite, biointegration, adhesion, anoikis

БИОФИЗИКА том 64

№ 5

2019