БИОФИЗИКА, 2019, том 64, № 5, с. 950-956

БИОФИЗИКА CЛОЖНЫX CИCТЕМ

УДК 577.354

МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ЭКЗОГЕННЫХ ПОЛОВЫХ

СТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ У ПЛАНАРИИ Girardia tigrina

(TURBELLARIA, TRICLADIDA)

Балтийский федеральный университет им. И. Канта, 236016, Калининград, ул. А. Невского, 14

*Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН,

142290, Пущино Московской области, ул. Институтская, 3

E-mail: nkudikina@kantiana.ru

Поступила в редакцию 01.07.2019 г.

После доработки 01.07.2019 г.

Принята к публикации 08.07.2019 г.

Изучены морфогенетические эффекты двух экзогенных половых стероидных гормонов тестостеро-

на и эстрадиола в ходе регенерации планарий. Наибольшей чувствительностью к введенным гормо-

нам обладал передний регенерант, сохранивший после перерезки головной ганглий. Исследован-

ные стероиды разнонаправлено влияли на скорость роста его бластемы: эстрадиол стимулировал, а

тестостерон, наоборот, ингибировал процесс регенерации. У задних регенерантов ингибирующий

эффект тестостерона сохранялся, а эстрадиол практически не влиял на скорость его восстановле-

ния. Оба гормона заметно увеличивали активность митозов в теле переднего и заднего регенеран-

тов. Максимальные величины митотического индекса были обнаружены в зонах наиболее удален-

ных от среза и в непосредственной близости от него. В качестве рабочей гипотезы можно предполо-

жить, что выявленные нами особенности воздействия каждого гормона связаны с образованием

специфических гормон-рецепторных комплексов и характером дисто-проксимального распределе-

ния рецепторов гормонов в теле планарий.

Ключевые слова: планарии, регенерация, стероидные гормоны, тестостерон, эстрадиол, необласты.

DOI: 10.1134/S0006302919050168

Понимание механизмов регенерации имеет

зрения эволюции они являются первыми живот-

большое значение для разных областей науки и

ными с централизованной нервной системой и

практики, особенно для медицины, так как это

при этом обладают сравнительно простой орга-

позволит решить множество проблем, касающих-

низацией в целом [3]. Высокоразвитые восстано-

ся здоровья человека, например, при изучении

вительные возможности планарий обеспечива-

нейродегенеративных заболеваний, поражающих

ются присутствием в их теле необластов - сома-

тических стволовых клеток. Известно, что

центральную нервную систему, при разработке

необласты могут самообновляться и давать нача-

методов выращивания органов и тканей для

ло всем типам клеток планарий, включая зароды-

трансплантации или снабжении организма ство-

шевую линию [4].

ловыми клетками, выращенными in vivo [1]. Изу-

чение процессов пролиферации и дифференци-

Наряду с нервной системой у плоских червей

ровки стволовых клеток, участвующих в регене-

существуют два способа гуморальной регуляции

рации модельных организмов, помогает понять

различных функций организма - с помощью

механизмы работы стволовых клеток у человека и

нейросекреторных соединений (нейропептидов),

позволяет изучить их связь с механизмами воз-

синтезируемых в разных участках нервной систе-

никновения раковых заболеваний [2]. Кроме то-

мы и разных групп стероидных гормонов, также

имеющих эндогенную природу [5]. Результаты

го, регенерация представляет собой модель эм-

изучения морфогенетической функции нейро-

бриогенеза и соматического роста животных, что

секреторных соединений показали, что экзоген-

позволяет использовать ее показатели для оценки

ные нейропептиды разной химической природы

динамики этих процессов.

способны оказывать на регенерацию планарий

Популярным модельным объектом для изуче-

весь возможный спектр воздействий - стимуля-

ния механизмов регенерации являются свобод-

цию, торможение, а также отсутствие действия на

ноживущие плоские черви планарии. С точки

морфогенез [6].

950

МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ

951

Данных о способности эндогенных нейрогор-

мость планарий. Растворы стандартов гормонов

монов включаться в сложный механизм регуля-

(Sigma-Aldrich, США) соответствующих концен-

ции восстановления тканей после ампутации го-

траций вносили в среду содержания планарий. В

раздо меньше. Известно, что динамика расходо-

дальнейшем в качестве исследуемой концентра-

вания нейросекреторных гранул синтезируемых в

ции тестостерона использовали концентрацию

церебральных ганглиях планарий тесно связана с

10^-3 мг/мл, рабочая концентрация эстрадиола -

ходом восстановительного процесса, а обнару-

10^-4 мг/мл. Контрольную группу планарий со-

женные нейропептиды обладают разной актив-

держали в растворе водопроводной и дистилли-

ностью в отношении скорости регенерации [7].

рованной воды (в соотношении 2 : 1). Экспери-

Выраженным морфогенетическим эффектом об-

ментальные и контрольные группы планарий со-

ладают и некоторые регуляторные пептиды, син-

стояли из 30 особей. Опыт проводили в трех

тезируемые в разных тканях планарий. Эти со-

независимых повторностях.

единения также являются частью комплексной

Морфометрический анализ. Для количествен-

сигнальной сети, представленной эндокринной

ной оценки результата регенерации использова-

системой [8].

ли метод прижизненной компьютерной морфо-

Морфогенетические свойства стероидных

метрии [13]. Для измерения площади образовав-

гормонов у плоских червей мало изучены, хотя у

шейся бластемы и регенерирующего фрагмента

ряда свободноживущих и паразитических червей

изображения обрабатывали в программе Plana

описаны количественные профили стероидных

4.4. Измерения проводили через каждые 24 ч в пе-

гормонов и элементы системы их эндогенного

риод с третьих по седьмые сутки эксперимента. В

синтеза [9-11], а также подтверждена их физио-

качестве количественного критерия роста ис-

логическая значимость в организме [12].

пользовали коэффициент регенерации R, вычис-

В связи с этим целью нашего исследования

ляемый по следующей формуле:

стало изучение морфогенетических эффектов

двух экзогенных стероидных гормонов тестосте-

R = s/S,

(1)

рона и эстрадиола у регенерирующих планарий

где s - площадь бластемы, S - общая площадь ре-

Girardia tigrina.

генеранта.

Для выполнения указанной цели нами были

Иммуногистохимический анализ. Количествен-

поставлены следующие задачи:

ную оценку митотической активности стволовых

1) изучение влияния экзогенных стероидных

клеток под влиянием гормонов проводили с по-

гормонов тестостерона и эстрадиола на процесс

мощью иммуногистохимического маркирования

репаративной регенерации головной и хвостовой

необластов. Для выявления митотических клеток

бластемы исследуемого вида;

в теле планарий использовали первичные антите-

2) изучение влияния экзогенных стероидных

ла на фосфорилированный гистон Н3 (Santa

гормонов тестостерона и эстрадиола на процесс

Cruz, США) в разведении 1/300 и вторичные ан-

пролиферации стволовых клеток планарий - не-

титела с флуоресцентным красителем FITC (Jack-

областов.

son ImmunoResearch, США) в разведении 1/500.

Подсчет количества митотических клеток и

площади животных осуществляли с помощью

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

программы ImageJ. Для детального изучения рас-

Объект исследований. В эксперименте исполь-

пределения стволовых клеток (необластов) в теле

зовали лабораторную культуру бесполой расы

планарии и влияния гормонов на их пролифера-

планарий Girardia tigrina (Turbellaria, Tricladida).

тивную активность в разных областях тела, реге-

Животных содержали в затемненных пластико-

нерирующие животные (передний и задний реге-

вых емкостях с «искусственной прудовой водой»

неранты) были условно разделены на 10 равных

(смесь водопроводной и дистиллированной воды

зон вдоль переднезадней оси. В каждой зоне реге-

в соотношении 2 : 1) при температуре 19-21°С.

неранта подсчитывали митотическую активность

Червей кормили один раз в неделю личинками

делящихся клеток у планарий в контрольных и

хирономид (Katrinex, Польша). Перед проведе-

экспериментальных группах.

нием опыта отбирали планарий длинной 9-11 мм

Для оценки митотической активности необла-

и выдерживали голодными в течение недели.

стов использовали митотический индекс МИ, ко-

Для оценки степени чувствительности плана-

торый рассчитывали по следующей формуле:

рий к разным концентрациям гормонов и опреде-

МИ = n/S,

(2)

ления рабочих концентраций проводили предва-

где n - количество клеток, S - площадь регене-

рительный эксперимент. Изучали действие те-

ранта [14].

стостерона в диапазоне концентраций от 10^-1 до

Статистическая обработка данных. Обработку

10^-3 мг/мл и эстрадиола в диапазоне концентра-

результатов проводили в программе SigmaPlot 11 с

ций от 10^-2 до 10^-5 мг/мл. Оценивали влияние

использованием параметрического t-критерия

различных концентраций гормонов на выживае-

Стьюдента для уровня значимости 0,95%. Резуль-

БИОФИЗИКА том 64

№ 5

2019

952

КУДИКИНА и др.

Рис. 1. Влияние тестостерона и эстрадиола на коэффициент регенерации передних (а) и задних (б) регенерантов; * -

p < 0,05.

таты представлены в виде средних значений ±

вотных уже на третьи сутки после ампутации. Ве-

стандартное отклонение. Общий объем материа-

личина различий R у восстанавливающихся

ла составил 1140 особей планарий.

участков животных сравниваемых групп достигла

максимальной за весь исследуемый период вели-

чины (в 1,2 раза, p < 0,05). Выраженное стимули-

РЕЗУЛЬТАТЫ

рующее действие гормона на рост ампутирован-

ного участка зарегистрировано и на пятые сутки

Динамика изменения коэффициента регенера-

опыта. Численные показатели R у эксперимен-

ции переднего и заднего регенерантов под влиянием

тальных животных превышали контрольные ве-

тестостерона и эстрадиола. Внесение тестостерона

личины в 1,1 раза (p < 0,05). На завершающем эта-

в среду содержания регенерирующих планарий

пе процесса регенерации (шестые-седьмые

привело к торможению восстановительных про-

сутки) тенденция в характере воздействия эстра-

цессов в течение всего эксперимента. Наиболее

диола на активность восстановительного процес-

выраженное ингибирующее действие на актив-

са сохранялась, особенно заметно на седьмые

ность роста и координацию осей тела восстанав-

сутки, однако выявленные различия не были зна-

ливающихся участков было зарегистрировано в

чимыми (рис. 1а).

период с пятых по седьмые сутки опыта. Интен-

сивность воздействия тестостерона в этот период

У задних регенерантов ингибирующий эффект

сохранялась примерно на одном уровне, но была

тестостерона наблюдался в течение всего экспе-

несколько выше, чем сразу после операции: зна-

римента. При этом обнаружено, что гормон в

чения R у экспериментальных планарий были ни-

большей степени тормозил восстановление ампу-

же контрольных в 1,2 раза (p < 0,05). В ходе вос-

тированного участка на начальных этапах регене-

становления хвостовой бластемы эстрадиол

рации (третьи-четвертые сутки), по сравнению с

вызвал увеличение R у экспериментальных жи-

более поздними сроками. Наибольшие различия

БИОФИЗИКА том 64

№ 5

2019

МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ

953

между показателями R у опытных и контрольных

опыта он стимулировал митотическую актив-

животных были обнаружены на третьи сутки по-

ность необластов в зоне фоторецепторов. Тесто-

сле ампутации. Величина R в группе интактных

стерон не оказывал влияния на активность про-

планарий была больше, чем в экспериментальной

лиферации стволовых клеток (рис. 3в).

группе, в 1,2 раза (p < 0,05). В дальнейшем восста-

новление утраченных участков тела у планарий

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

сопровождалось резким увеличением значений

коэффициента регенерации к пятым суткам как в

Результаты нашего исследования показали,

контроле, так и в опыте. Ингибирующий харак-

что тестостерон и эстрадиол способны влиять на

тер воздействия тестостерона на величину R во

ход морфогенетического процесса у планарий.

второй половине опыта сохранялся, но его интен-

Характер восстановления ампутированного

сивность снижалась. Эстрадиол, введенный по-

участка под воздействием гормонов зависел от

сле операции в среду содержания регенерирую-

специфики физиологической активности каждо-

щих планарий, практически не влиял на скорость

го из гормонов, а также от регенерирующего

восстановления задних регенерантов: значения R

фрагмента - головного или декапитированного

у экспериментальных животных в течение всего

участка. Обнаруженный у планарий морфогене-

опыта оставались на уровне контрольных значе-

тический эффект тестостерона и эстрадиола

ний (рис. 1б).

вполне согласуется с данными о способности

Динамика изменения митотического индекса под

этих гормонов проявлять подобную активность у

влиянием тестостерона и эстрадиола в различных

позвоночных животных [15,16]

зонах передних и задних регенерантов. Изучение

Полученные нами результаты подтверждаются

характера воздействия гормонов на активность

также литературными данными о влиянии на ход

пролиферации необластов в отдельных зонах па-

восстановительных процессов у планарий целого

ренхимы показало, что через 24 ч в теле передних

ряда экзо- и эндогенных соединений гормональ-

регенерантов оба гормона увеличивали митоти-

ной природы [8,17]. Данные о наличии и физио-

ческую активность в зонах, расположенных близ-

логической активности эндогенных стероидных

ко к ране. Одновременно с этим они увеличивали

гормонов касаются только паразитических плос-

число делящихся необластов на участках, наибо-

ких червей. Так, было показано, что введение эк-

лее удаленных от раны, - зоне фоторецепторов и

зогенных половых стероидов одному из предста-

участке, следующем за нею. При этом количество

вителей этой группы - ленточному червю Taenia

делящихся необластов в области глотки у экспе-

crassiceps - снижало фертильность и жизнеспо-

риментальных животных не менялось по сравне-

собность цестод, а женские половые стероиды

нию с контрольными (рис.

2а). Митогенная

17β-эстрадиол и прогестерон стимулировали ско-

активность тестостерона имела устойчивый ха-

рость его роста [18]. Кроме плоских червей мор-

рактер - через 48 ч гормон по-прежнему стиму-

фогенетические эффекты половых стероидов и

лировал пролиферацию как в области раны, так и

других гормонов этой группы описаны у ряда бес-

в двух названных выше участках предглоточной

позвоночных других таксономических групп -

паренхимы. Стимулирующая активность эстра-

моллюсков и ракообразных [19,20].

диола на этом сроке проявлялась только в зоне

Выявленные нами особенности воздействия

расположения фоторецепторов (рис. 2б). К трем

гормонов на ход восстановления передних и зад-

суткам наблюдения оба гормона не оказывали су-

них участков тела можно объяснить, во-первых,

щественного воздействия на митотическую ак-

различиями клеточного состава передних и зад-

тивность необластов (рис. 2в).

них регенерантов и механизмов формирования

Характер воздействия гормонов на митотиче-

головных и хвостовых бластем [21]. Во-вторых,

скую активность необластов задних регенерантов

эти особенности, по-видимому, связаны с нали-

отличался от передних регенерирующих участ-

чием и характером дисто-проксимального рас-

ков. Через сутки после ампутации заметное сти-

пределения рецепторов половых стероидов в

мулирующее действие на митотическую актив-

клетках-мишенях разных участков тела планарий

ность оказывал только эстрадиол. Он достоверно

[22,23].

увеличивал значение МИ в паренхиме на границе

Оценку митогенной активности тестостерона

с бластемой и в следующей за фоторецепторами

и эстрадиола проводили с помощью иммуноги-

зоне. Тестостерон стимулировал пролиферацию

стохимического маркирования необластов. Для

необластов только в зоне перед фоторецепторами

этого использовали антитела к фосфорилирован-

(рис. 3а). Эффект гормона усиливался во време-

ному гистону Н3. Эта форма гистона является

ни. Через 48 ч он существенно увеличивал число

маркером перехода от фазы G2 к фазе M в клеточ-

делящихся необластов в области раны и на другом

ном цикле. Полученные нами результаты об уве-

конце тела в зоне глаз. В это же время митоген-

личении количества делящихся необластов под

ный эффект эстрадиола проявлялся только в об-

воздействием гормонов позволяют предполо-

ласти раны (рис. 3б). Митогенная активность эст-

жить, что оба половых стероида сокращают про-

радиола сохранялась дольше — на третьи сутки

должительность интерфазы в клеточном цикле

БИОФИЗИКА том 64

№ 5

2019

956

КУДИКИНА и др.

2. Оба половых стероида увеличивали число

Т. А. Малютина, Н. Б. Теренина и Н. Д. Крещенко,

делящихся необластов в паренхиме планарий.

Ученые записки Казанского ун-та 155 (3), 129

(2013).

Максимальные эффекты воздействия гормонов

на величину митотического индекса были обна-

P. Jiménez, R. A. Valdez, and M. C. Romano, J. Ste-

ружены в зонах, наиболее удаленных от раны, и в

roid Biochem. Mol. Biol. 99 (4-5), 203 (2006).

непосредственной близости от нее. Интенсив-

10.

J. M. Correia da Costa, N. Vale, M. J. Gouveia, et al.,

ность и продолжительность воздействия каждого

Gene function in schistosomes: recent advances to-

из гормонов в передних и задних регенерантах

wards a cure 5, 9 (2014).

различались.

11.

M. C. Romano, P. Jiménez, C. Miranda, et al., Front.

Neurosci. 9, 224 (2015).

3. Выявленные нами особенности воздействия

каждого гормона, возможно, связаны с образова-

12.

W. C. Gornig and S. Keller, J. Physiol. 2 (4), 1 (1971).

нием специфических гормон-рецепторных ком-

13.

Х. П. Тирас и К. Б. Асланиди, Современные

плексов и особенностями дисто-проксимального

проблемы науки и образования 6, 515 (2016).

распределения рецепторов в теле планарий.

14.

О. Н. Ермакова, А. М. Ермаков, Х. П. Тирас и др.,

Онтогенез 40 (6), 449 (2009).

15.

D. Z. Mazdeh, P. Mirshokraei, M. Emami, et al., Res.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Veterinary Sci. 118, 11 (2018).

1. B. Chen, С. Liebman, P. Rabbani, et al., Stem Cell Tis-

16.

J. G. MacKrell, B. C. Yaden, H. Bullock, et al., Nucle-

sue Engineering and Regenerative Medicine: Role of Im-

ar Receptor Signaling 1, 13005 (2015).

aging (John Wiley & Sons, NY, 2017).

17.

Х. П. Тирас, Дис

д-ра биол. наук (ИТЭБ РАН,

2. F. Marongiu, M. P. Serra, M. Fanti, et al., Cell

Пущино Московской обл., 2016).

transplantation 9, 1530 (2017).

18.

G. Escobedo, C. Larralde, A. Chavarria, et al., J. Para-

3. R. H. Roberts-Galbraith and P. A. Newmark, Curr.

sitology 6, 1235 (2004).

Opin. Genetics & Development 32, 37 (2015).

19.

Н. П. Кудикина, Онтогенез 42 (3), 213 (2011).

4. S. J. Zhu and B. J. Pearson, Curr. Opin. Genetics &

20.

Н. П. Кудикина, Вестн. Балтийского федерально-

Development 40, 74 (2016).

го ун-та им. И. Канта. Сер.: Естественные и меди-

цинские науки 1, 122 (2015).

5. Н. П. Кудикина, в сб. Материалы VI Съезда парази-

тологического общества «Современная паразитоло-

21.

Х. П. Тирас, О. Н. Петрова, С. Н. Мякишева и др.,

гия — основные тренды и вызовы» (Санкт-Петер-

Фундаментальные исследования 7, 493 (2015).

бург, 2018), с. 131.

22.

P. W. Reddien, Cell 175 (2), 327 (2018).

6. Х. П. Тирас и И. М. Шейман, Онтогенез 15 (4), 374

23.

A. Belfiore and D. LeRoith, Principles of Endocrinology

(1984).

and Hormone Action (Springer, NY, 2018).

7. Н. Д. Крещенко и И. М. Шейман, Биомедицина 1

24.

J. Pellettieri, P. Fitzgerald, S. Watanabe, et al., Dev.

(1), 79 (2008).

Biol. 338 (1), 76 (2010).

Morphogenetic Effects of Exogenous Sex Steroid Hormones

in the Planarian Girardia tigrina (Turbellaria, Tricladida)

N.P. Kudikina*, А.М. Ermakov**, E.А. Omelnitskaya*, and I.А. Skorobogatykh*

*Immanuel Kant Baltic Federal University, ul. A. Nevskogo 14, Kaliningrad, 236016 Russia

**Institute of Theoretical and Experimental Biophysics, Russian Academy of Sciences,

Institutskaya ul. 3, Pushchino, Moscow Region, 142290 Russia

The morphogenetic effects of two exogenous sex steroid hormones testosterone and estradiol during planar-

ian regeneration have been studied. The anterior regenerant which retained the head ganglion after cutting

was most sensitive to the introduced hormones. Studied steroids exerted different influence on the growth

rate of its blastema: estradiol stimulated and testosterone inhibited the regeneration process. In the posterior

regenerants the inhibitory effect of testosterone persisted and estradiol had virtually no influence upon the

rate of its recovery. Both hormones significantly increased mitotic activity in the anterior and posterior re-

gions of the regenerants. The highest mitotic index values were observed in regions that were most remote

from and in the immediate vicinity of the cutting zone. On the level of a working hypothesis it can be sup-

posed that peculiarities of the effect of each hormone were related to the formation of specific hormone-re-

ceptor complexes and the distribution pattern of hormone receptors in the proximal and distal regions of the

planarian body.

Keywords: planarian, regeneration, steroid hormones, testosterone, estradiol, neoblasts

БИОФИЗИКА том 64

№ 5

2019