БИОФИЗИКА, 2019, том 64, № 5, с. 988-993

БИОФИЗИКА CЛОЖНЫX CИCТЕМ

УДК 615.324:577.112.6:616.61-008.64-08-092.9

КОРРЕКЦИЯ PАБДОМИОЛИТИЧЕCКОГО ОСТРОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ

ПОЧЕК ПРИМЕНЕНИЕМ АДЕМЕТИОНИНА

Буковинский государственный медицинский университет, 58002, Черновцы, Театральная пл., 2, Украина

E-mail: igor.zamorskii@gmail.com

Поступила в редакцию 22.06.2019 г.

После доработки 22.06.2019 г.

Принята к публикации 12.07.2019 г.

На модели рабдомиолитического острого повреждения почек установлен выраженный нефропро-

текторный эффект адеметионина по способности устранять токсическое воздействие миоглобина,

о чем свидетельствует увеличение мочевыделения, скорости клубочковой фильтрации, уменьшение

ретенционной азотемии и протеинурии, наряду с нормализацией ионорегулирующей функции по-

чек, активацией клубочково-канальцевого и канальцево-канальцевого балансов, а также улучше-

нием энергообеспечения почек. Доказано выраженное антиоксидантное действие препарата, что

реализовалось увеличением активности каталазы и глутатионпероксидазы в ткани почек с досто-

верным снижением активности перекисного окисления липидов и белков, а также цитопротектор-

ная активность - по снижению активности гамма-глутамилтранспептидазы в моче эксперимен-

тальных животных.

Ключевые слова: рабдомиолитическое острое повреждение почек, нефропротекторная активность,

адеметионин.

DOI: 10.1134/S0006302919050211

токсическим действием на почки, вызывая об-

Несмотря на значительные достижения в ме-

струкцию канальцев и снижение скорости клу-

дикаментозном лечении и внедрение современ-

бочковой фильтрации (СКФ) [4,5]. На долю раб-

ных методов почечно-заместительной терапии,

домиолитического ОПП приходится около 15%

смертность от острого повреждения почек (ОПП)

всех случаев в общей структуре ОПП, а уровень

остается высокой и составляет около 25-70%

смертности при этом составляет 8% [6]. Суще-

[1,2], а его частое сочетание с мультиорганной па-

ствует множество причин возникновения рабдо-

тологией и недостаточная эффективность лече-

миолиза - травматический рабдомиолиз (краш-

ния требуют расширения направлений почечной

синдром, судороги, чрезмерные физические на-

протекции с внедрением альтернативных высо-

грузки) и нетравматический рабдомиолиз вслед-

коэффективных и безопасных нефропротекторов

ствие действия различных токсических и физиче-

для воздействия на этиологический, патогенети-

ских факторов (отравление соединениями тяже-

ческий и симптоматический компоненты заболе-

лых металлов, наркотическими веществами,

вания. В связи с этим основными требованиями,

лекарственными средствами), ишемия мышц,

выдвигаемыми к нефропротекторам, является

инфекции и т. п. Выделяют три основные патоге-

способность влиять на основные механизмы раз-

нетические механизмы развития рабдомиолити-

вития повреждения и защиты почечной ткани,

ческого ОПП: почечная вазоконстрикция, ише-

наличие антиоксидантных, противовоспалитель-

мия и окислительный стресс [7]. Окислительный

ных и мембранопротекторных свойств. Одной из

стресс возникает вследствие избытка железа, вы-

самых частых причин почечной формы ОПП

деляемого из миоглобина, который имеет прямое

является миоренальный синдром, вызванный

повреждающее действие на почечные канальцы.

массивным рабдомиолизом [3], при котором по-

Сдавливание тканей также индуцирует образова-

вреждение скелетных мышц приводит к лизису

ние свободных радикалов кислорода высокой ак-

миоцитов, в результате чего в плазму крови выде-

тивности, которые усиливают окислительный

ляется их внутриклеточное содержимое, включая

стресс и провоцируют перекисное окисление ли-

миоглобин, который обладает непосредственным

пидов и белков, в результате чего возникает кол-

Сокращения: ОПП — острое повреждение почек, СКФ —

ликвационный некроз мышечных волокон с де-

скорость клубочковой фильтрации.

струкцией сарколеммы и гибелью клетки [8].

988

КОРРЕКЦИЯ PАБДОМИОЛИТИЧЕCКОГО ОСТРОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ

989

Поскольку основой патогенеза почечной па-

крови, экскреции белка c мочой, реабсорбции и

тологии является развитие оксидативного стрес-

экскреции ионов натрия [17,19,20].

са, который характеризуется прооксидантно-ан-

Морфологическую верификацию изменений в

тиоксидантным дисбалансом, для исследования

почках проводили c использованием гистологи-

был выбран адеметионин - активный серосодер-

ческих препаратов, окрашенных гематоксилином

жащий метаболит метионина, природный анти-

и эозином, и компьютерной морфометрии объек-

оксидант, содержащийся во всех тканях организ-

тов (микроскоп Люмам-P8, объектив 10×, окуляр

ма [9-11]. Как лекарственное средство он отно-

10×) в среде компьютерной программы «Видео-

сится к группе гепатопротекторов, однако

Теcт-Pазмеp 5.0» (ООО «Видеотеcт», Россия).

благодаря плейотропным эффектам обладает

Статистическую обработку полученных результа-

мембранопротекторным, цитопротекторным,

тов проводили c помощью программы SPSS Sta-

антиоксидантным,

противовоспалительным,

tistics 17.0. Оценку различий между выборками

анальгезирующим, антидепрессантным и нейро-

проводили c использованием параметрического

протекторным свойствами [12-16].

t-критерия Стьюдента (при нормальном распре-

делении переменных) и непараметрического

U-критерия Манна-Уитни (в случае отсутствия

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

согласия данных c нормальным распределением).

Критический уровень значимости был принят за

Исследование проведено на белых беспород-

p ≤ 0,05.

ных половозрелых крысах-самцах массой 120-

180 г, которые находились в стандартных услови-

ях вивария со свободным доступом к воде и пище.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Животные были разделены на три группы по семь

особей в каждой: первая группа - контрольная,

В результате эксперимента на седьмые сутки

вторая - животные c pабдомиолитичеcким ОПП,

развития рабдомиолитической формы ОПП

третья - животные, которым вводили адеметио-

определяли признаки повреждения почечной

нин при ОПП. Pабдомиолитичеcкое поврежде-

ткани, что проявлялось снижением диуреза на

ние почек воспроизводили путем введения кры-

33,4%, СКФ - в два раза по сравнению с живот-

сам внутримышечно 50%-го раствора глицерола в

ными интактной группы (табл. 1). Несмотря на

дозе 8 мл/кг [17]. Адеметионин («Гептрал», Abbott

тенденцию к восстановлению экскреторной

S.p.A., Италия) вводили в дозе 20 мг/кг внутри-

функции почек, сохранялась гиперазотемия (уро-

брюшинно через 40 мин после моделирования

вень креатинина в плазме крови превышал пока-

ОПП и продолжали вводить ежедневно в течение

затель контроля в 1,7 раза) и выраженная протеи-

6 суток [18]. Забор материала осуществляли на

нурия (концентрация белка в моче выросла в три

седьмые сутки эксперимента в условиях водной

раза). Курсовое семисуточное введение адемети-

нагрузки [17].

онина способствовало улучшению функциональ-

ного состояния почек, что подтверждалось воз-

Протекторное действие препарата оценивали

растанием диуреза до уровня контроля и увеличе-

по показателям функционального состояния по-

нием СКФ в 1,6 раза. Креатининемия у леченных

чек, активности липидной и белковой пеpокcида-

животных снижалась до показателей нормы - в

ции и ферментов антиоксидантной защиты. В

1,4 раза. При этом отмечалось значительное (в

корковом веществе почек и в эритроцитах опре-

2,8 раза) уменьшение концентрации белка в моче.

деляли содержание малонового диальдегида по

Кроме того, адеметионин способствовал нор-

реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой, а содер-

мализации канальцевой функции, увеличивая

жание продуктов окислительной модификации

показатель абсолютной реабсорбции ионов на-

белков определяли в ткани почек по реакции c

трия в 1,6 раза с соответствующим уменьшением

2,4-динитpофенилгидpазином c образованием

показателя фракционной экскреции ионов на-

гидpазонов, имеющих характерный спектр по-

трия в 2,9 раза, что свидетельствует о снижении

глощения. Состояние антиоксидантной защиты

тубулярного повреждения и восстановлении ре-

оценивали по активности в ткани почек каталазы

абсорбционной способности эпителиоцитов ка-

и глутатионпероксидазы. Активность каталазы

нальцев.

определяли по реакции c молибдатом аммония,

глутатионпероксидазы - по количеству восста-

О глубоком нарушении взаимосвязей между

новленного глутатиона, который определяли

различными отделами нефрона в группе леченых

спектрофотометрически. Активность гамма-глу-

животных свидетельствует снижение показателей

тамилтранспептидазы в моче и сукцинатдегидро-

как проксимального (в 2,1 раза), так и дистально-

геназы в ткани почек определяли с помощью

го (в 1,6 раза) транспорта ионов натрия. Это

тест-наборов реактивов (ЗАО «Реагент», Украи-

сопровождалось ослаблением канальцево-ка-

на). Функциональное состояние почек оценива-

нальцевого баланса и подтверждено прямой кор-

ли по показателям диуреза, креатинина в плазме

реляцией между показателями (табл. 2). Корриги-

БИОФИЗИКА том 64

№ 5

2019

990

ЗАМОРСКИЙ и др.

Таблица 1. Показатели функционального состояния почек крыс при pабдомиолитичеcком остром повреждении

почек и применении адеметионина

ОПП +

Интактный

Показатель

ОПП

адеметионин,

контроль

20 мг/кг

Диурез, мл/2 ч · 100 г

4.76 ± 0.15

3.17 ± 0.19^##

4.67 ± 0.11**

Концентрация креатинина в плазме крови, мкмоль/л

59.51 ± 2.62

101.14 ± 1.31^##

70.97 ± 1.72**

Скорость клубочковой фильтрации, мкл/100 г

604.76 ± 38.24

306.6 ± 25.29^##

497.9 ± 25.97**

Концентрация белка в моче, г/л

0.011 ± 0.001

0.033 ± 0.002^##

0.012 ± 0.001**

Реабсорбция ионов натрия, мкмоль/мин

87.03 ± 5.33

42.82 ± 3.43^##

69.48 ± 4.44**

Фракционная экскреция ионов натрия, %

0.28 ± 0.02

1.05 ± 0.07^##

0.36 ± 0.02**

Проксимальный транспорт ионов натрия, ммоль/2 ч

11.85 ± 0.76

5.73 ± 0.49^##

9.36 ± 0.62**

Дистальный транспорт ионов натрия, ммоль/2 ч

682.14 ± 21.24

438.91 ± 24.43^##

646.70 ± 24.97**

Примечание. Данные представлены в виде М ± m (n = 7); ^## - статистически значимые различия с данными группы интакт-

ного контроля (р < 0.01), ** - с данными группы рабдомиолитического ОПП (р < 0.01).

Таблица 2. Влияние адеметионина на состояние клубочково-канальцевого и канальцево-канальцевого баланса

при рабдомиолитическом остром повреждении почек

Группа животных

СКФ ↔ T_pNa⁺

СКФ ↔ T_dNa⁺

TpNa⁺ ↔ TdNa⁺

Интактный контроль

r = 0.100; p < 0.01

r = 0.964; p < 0.01

r = -0.893, p < 0.05

ОПП

r = 0.964; p < 0.01

r = 0.575; p > 0.05

r = 0.643, p > 0.05

ОПП + Адеметионин

r = 0.964; p < 0.01

r = 0.929; p < 0.01

r = -0.875, p < 0.05

Примечание. T_pNa⁺ - проксимальный транспорт ионов натрия, T_dNa⁺ - дистальный транспорт ионов натрия, r - коэффи-

циент корреляции Спирмена.

рующее воздействие адеметионина способство-

подтвержденное корреляцией между СКФ и

вало восстановлению клубочково-канальцевого

проксимальной и дистальной реабсорбцией, а

и активации канальцево-канальцевого балансов,

также между проксимальным и дистальным

транспортом ионов натрия, которые увеличива-

лись в 1,6 и 1,5 раза соответственно.

Достоверное снижение активности гамма-глу-

тамилтранспептидазы - маркера повреждения и

некроза эпителиоцитов - в 5,2 раза по сравнению

с нелечеными животными, свидетельствует о ци-

топротекторной активности адеметионина (рис. 1).

Развитие рабдомиолитического ОПП также ха-

рактеризовалось снижением активности сукци-

натдегидрогеназы в ткани почек в 4,1 раза по

сравнению с контрольной группой, что указывает

на нарушение аэробного метаболизма и подтвер-

ждает развитие почечной ишемии со снижением

продукции АТФ в клетках почечных канальцев и

нарушением энергетического обмена (рис. 2).

Применение адеметионина обусловило увеличе-

ние активности сукцинатдегидрогеназы в 2,9 раза

по сравнению с группой ОПП. Учитывая полу-

ченные данные, можно утверждать, что примене-

Рис. 1. Активность гамма-глутамилтранспептидазы в

ние препарата способствует компенсаторной ак-

моче крыс с рабдомиолитическим ОПП при введении

тивации аэробного гликолиза и снижает степень

адеметионина, ммоль/(ч · л). # - Статистически

угнетения окислительных процессов в цикле

значимые различия с данными группы интактного

Кребса в условиях развития рабдомиолитическо-

контроля (р < 0,01), * - статистически значимые

различия с данными группы острого повреждения

го ОПП, что приводит к активации энергосинте-

почек (р < 0,01).

зирующей функции нефроцитов.

БИОФИЗИКА том 64

№ 5

2019

КОРРЕКЦИЯ PАБДОМИОЛИТИЧЕCКОГО ОСТРОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ

991

У крыс группы патологии сохранялась высо-

кая интенсивность процессов пероксидного

окисления наряду с истощением системы анти-

оксидантной защиты: содержание малонового

диальдегида и окислительно-модифицирован-

ных белков в ткани почек достоверно превышало

показатели контроля на 23,6% и 46,1% соответ-

ственно (табл. 3). Курсовое применение адемети-

онина содействовало угнетению окислительных

процессов (содержание малонового диальдегида

уменьшалось на 19,3%, а содержание окислитель-

но-модифицированных белков - на 31,7%), а так-

же активацией системы антиоксидантной защи-

ты, что реализовалось увеличением активности

глутатионпероксидазы на 58,8% и восстановле-

нием активности каталазы до уровня контроля.

На седьмые сутки развития рабдомиолитиче-

ского ОПП сохранялись существенные измене-

Рис. 2. Активность сукцинатдегидрогеназы в ткани

ния гистоструктуры почек (рис. 3). В части клу-

почек крыс с рабдомиолитическим ОПП при введе-

бочков выявлено расширение просвета Боумена.

нии адеметионина, нмоль сукцината/(мин·мг белка).

# - Статистически значимые различия с данными

В извитых канальцах коры почек 93,0 ± 1,0% эпи-

группы интактного контроля (р < 0,01), * - статисти-

телиоцитов имели признаки зернистой и гидро-

чески значимые различия с данными группы рабдо-

пической дистрофии, а 5 ± 0,5% эпителиоцитов

миолитического ОПП (р < 0,01).

находились в состоянии коагуляционного некро-

за, с уплотнением цитоплазмы и кариопикнозом.

нальцев коркового вещества имели признаки

В выводных трубочках мозгового вещества

гидропической дистрофии, у 1,5% клеток обнару-

71,2 ± 1,2% эпителиоцитов были поражены гид-

жены некробиотические изменения. Дегенера-

ропической дистрофией, что является обрати-

тивный процесс в виде зернистой дистрофии был

мым процессом. Выявлена закупорка миоглоби-

распространен только у 32,3 ± 0,3% клеток вы-

новыми цилиндрами 28,5 ± 0,7% просветов ка-

водных трубочек мозгового вещества, что свиде-

нальцев коры и 61,3 ± 1,1% выводных трубочек

тельствует о корригирующем действии препа-

мозгового вещества.

рата.

На фоне коррекции рабдомиолитического

ОПП адеметионином морфологическая картина

ВЫВОДЫ

почек значительно улучшилась (рис. 4). Миогло-

биновые цилиндры практически не встречались в

Адеметионин в условиях рабдомиолитическо-

просветах канальцев коры, в собирательных тру-

го ОПП проявляет нефропротекторные свойства,

бочках мозгового вещества обнаружены единич-

повышая СКФ и диурез, а также снижая проявле-

ные цилиндры. 43,1 ± 0,6% эпителиоцитов ка-

ния гиперазотемии, протеинурии, восстанавли-

Таблица 3. Влияние адеметионина на прооксидантно-антиоксидантный баланс в ткани почек при рабдомиоли-

тическом ОПП у крыс

Малоновый

Окислительно-

Глутатион-

Каталаза,

Показатель

диальдегид,

модифицированные

пероксидаза,

мкмоль/(мин · мг)

мкмоль/г

белки, ед./г

нмоль/(мин · мг)

Интактный контроль

55.05 ± 1.23

14.96 ± 0.38

6.22 ± 0.27

293.46 ± 11.57

ОПП

68.02 ± 2.57^##

21.86 ± 0.37^##

5.59 ± 0.28^#

192.89 ± 5.09^##

ОПП + адеметионин, 20 мг/кг

54.87 ± 1.37**

14.93 ± 0.34**

6.40 ± 0.14*

306.29 ± 9.28**

Примечание. Данные представлены в виде М ± m (n = 7); достоверные различия с данными группы: интактного контроля -

^# (р < 0.05), ^##(р <0.01), модельной патологии - *(р < 0.05), **(р < 0.01).

БИОФИЗИКА том 64

№ 5

2019

992

ЗАМОРСКИЙ и др.

Рис. 3. Микроснимки препаратов почки: (а) - корковое вещество, (б) - мозговое вещество крысы с рабдомиолитиче-

ским острым повреждением почек, седьмые сутки. Некроз эпителиоцитов (1), зернистая и гидропическая дистрофия

эпителиоцитов (2), миоглобиновые цилиндры (3), расширение просвета Боумена (4). Окрашивание гематоксилином

и эозином.

вая реабсорбционную способность нефронов и

лесообразности дальнейшего изучения адеметио-

нормализуя прооксидантно-антиоксидантный

нина как безопасного и эффективного лекар-

баланс. Полученные результаты исследований

ственного средства для профилактики и коррек-

являются экспериментальным обоснованием це-

ции патологии почек.

Рис. 4. Микроснимки препаратов почки: (а) - корковое вещество, (б) - мозговое вещество крысы с рабдомиолитиче-

скым острым повреждением почек при применении адеметионина, седьмые сутки. Дистрофия эпителиоцитов (2),

миоглобиновые цилиндры (3), расширение просвета Боумена (4). Окрашивание гематоксилином и эозином.

БИОФИЗИКА том 64

№ 5

2019

КОРРЕКЦИЯ PАБДОМИОЛИТИЧЕCКОГО ОСТРОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ

993

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

11. S. A. Lozano-Sepulveda, E. Bautista-Osorio, J. A. Me-

rino-Mascorro, et al., World J. Gastroenterol. 22 (14),

Эксперименты с животными проводили в со-

3746 (2016).

ответствии с положениями Директивы Европей-

12. A. L. King, S. K. Mantena, K. K. Andringa, et al., Re-

ского союза 2010/63/EU о защите животных, ис-

dox Biol. 9, 188 (2016).

пользуемых в научных целях [21].

13. T. Guo, L. Chang, Y. Xiao, et al., PLoS One 10 (3),

e0122124 (2015). DOI: 10.1371/journal.pone.0122124

14. B. Vincenzi, A. Russo, and A. Terenzio, Crit. Rev. On-

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

col. Hematol. 130, 70 (2018). DOI: 10.1016/j.critrev-

1. Y. Koza, J. Inj. Violence Res. 8 (1), 58 (2016).

onc.2018.06.019

2. В. Добронравов и А. В. Смирнов, Почки 2 (16), 63

15. A. Antoniv, N. Antofiychuk, T. Danylyshina, et al.,

(2016).

Georgian Med. News 273, 31 (2017).

3. K. Makris and L. Spanou, Clin. Biochem. 37 (2), 85

16. A. Sharma, P. Gerbarg, T. Bottiglieri, et al., J. Clin.

(2016).

Psychiatry 78 (6), 656 (2017).

4. P. Esposito, L. Estienne, N. Serpieri, et al., Am. J. Kid-

17. I. I. Zamorskii, V. M. Drachuk, and O. M. Goroshko,

ney Dis. 71 (6), 12 (2018).

Biophysics 61 (6), 1036 (2016).

5. R. Galeiras, М. Mourelo, S. Pértega, et al., Indian J.

18. R. Carrasco, М. Pérez-Mateo, А. Gutiérrez, et al.,

Crit. Care. Med. 20 (9), 504 (2016).

Methods Find. Exp. Clin. Pharmacol. 22 (10), 737

(2000).

6. S. Mas-Font, J. Ros-Martinez, C. Pérez-Calvo, et al.,

19. В. С. Камышников, Справочник по клинико-биохи-

Med. Intensiva 41 (2), 116 (2017).

мическим исследованиям и лабораторной диагности-

7. X. Bosch, E. Poch, J. M. Grau, N. Engl. J. Med. 361

ке (МЕДпресс, М., 2009).

(1), 62 (2009).

20. А. В. Арутюнян, Е. Е. Дубинина и Н. Н. Зыбина,

8. J. M. Dennis and P. K. Witting, Nutrients 9 (7), 718

Методы оценки свободнорадикального окисления и

(2017).

антиоксидантной системы организма (Фолиант,

9. R. A. Cavallaro, A. Fuso, M. d’Erme, et al., Int. J. Clin.

СПб., 2000).

Nutr. Diet. 2 (1), 109 (2016). DOI: 10.15344/2456-

21. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and

8171/2016/109

of the Council on the protection of animals used for sci-

10. Q. M. Anstee and C. P. Day, J. Hepatol. 57 (5), 1097

entific purposes, Official Journal of the European

(2012).

Union L276 (53), 332010 (2010).

Amelioration of Rhabdomyolysis-Induced Acute Kidney Injury by Ademetionine

I.I. Zamorskii, V.M. Drachuk, T.S. Shchudrova, O.M. Goroshko, and T.G. Kopchuk

Bukovinian State Medical University, Teatral’naya pl. 2, Chernivtsi, 58002 Ukraine

Using the model of rhabdomyolysis-induced acute kidney injury the results of our study demonstrate a sig-

nificant nephroprotective effect of ademetionine that target the harmful effect of myoglobin as manifested by

a rise in the urine output and glomerular filtration rate, reduction in retention azotemia and proteinuria,

along with normalization of the ion-regulating kidney function, realized by the activation of the glomerular-

tubular and tubular-tubular balance, as well as an adequate energy supply to the kidneys. A significant anti-

oxidant effect of ademetionine has been confirmed with evidence that catalase and glutathione peroxidase ac-

tivities were increased in kidney tissue with a significant decrease in lipid peroxidation and protein degrada-

tion and its cytoprotective efficacy was proven due to a decrease in gamma glutamyl transpeptidase activity in

the urine of experimental animals.

Keywords: rhabdomyolysis-induced acute kidney injury, nephroprotective activity, ademetionine

БИОФИЗИКА том 64

№ 5

2019