БИОФИЗИКА, 2019, том 64, № 5, с. 999-1002

БИОФИЗИКА CЛОЖНЫX CИCТЕМ

УДК 577.29

ЭФФЕКТЫ ТЯЖЕЛОЙ ГИПОБАРИЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ

И ИНГИБИРОВАНИЯ ИНДУЦИРУЕМОГО ГИПОКСИЕЙ

ФАКТОРА HIF-1 НА МАРКЕРЫ ПОВРЕЖДЕНИЯ СЕРДЕЧНОЙ

И СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ КРЫС

*Санкт-Петербургский государственный университет, 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9

**Санкт-Петербургский государственный морской технический университет,

190121, Санкт-Петербург, ул. Лоцманская, 3

E-mail: iilhj@yandex.ru

Поступила в редакцию 28.06.2019 г.

После доработки 02.07.2019 г.

Принята к публикации 12.07.2019 г.

Для исследования молекулярных механизмов повреждения сердечных и скелетных мышц

использована модель тяжелой гипобарической гипоксии - трехчасовой сеанс пребывания крыс-

самцов линии Wistar массой 200-250 г при давлении 180 мм рт. ст. (5% О₂). Показано достоверное

превышение уровня сердечного биомаркера тропонина I в плазме крови крыс, подвергнутых

трехчасовой тяжелой гипоксии по сравнению с контролем, что свидетельствует о повреждении

миокарда после сеанса тяжелой гипобарической гипоксии. При этом введение животным

ингибитора транскрипционного фактора HIF-1α не оказывало значимого влияния на

концентрацию тропонина I в плазме. Напротив, в случае использования малоспецифичного

биомаркера миоглобина не было обнаружено значимого увеличения выхода его в кровь после

гипоксии по сравнению с контролем. Эксперимент с использованием ингибитора HIF-1α

топотекана показал, что количество миоглобина в плазме крови крыс через сутки после сеанса

тяжелой гипобарической гипоксии было достоверно меньше, чем в отсутствие ингибитора. Можно

полагать, что блокирование транскрипционного фактора HIF-1α за 10 мин до сеанса тяжелой

гипобарической гипоксии уменьшает повреждение скелетных мышц. Обсуждаются механизмы,

влияющие на адаптацию сердечной и скелетных мышц к гипоксии.

Ключевые слова: гипоксия, миоглобин, тропонин I, топотекан, гипоксия-индуцируемый фактор-1

(альфа), миокард.

DOI: 10.1134/S0006302919050235

бо помогают выживанию в гипоксической среде.

Хорошо известно, что у аэробных организмов

Центральную роль в этом процессе играет семей-

нарушение снабжения клеток кислородом ведет к

ство индуцируемых гипоксией транскрипцион-

нарушению их функционирования, а при полном

ных факторов HIF (гипоксия-индуцируемых

отсутствии кислорода клетки погибают. Особен-

факторов). Один из белков этого семейства -

но важен кислород для таких специализирован-

HIF-1 - изменяет экспрессию генов, контроли-

ных систем, как нервная, сердечно-сосудистая и

рующих транспорт глюкозы и гликолиз, что обес-

дыхательная. Подобного рода нарушения наблю-

печивает адаптацию клеток к условиям гипоксии,

даются также при подъеме на высоту, т.е. при ги-

а также обеспечивающего повышение экспрес-

побарической гипоксии. Модель гипобарической

сии фактора роста эндотелия сосудов и его рецеп-

гипоксии широко используется при изучении мо-

торов в ответ на уменьшение содержания кисло-

лекулярных механизмов повреждения нейронов

рода (гипоксию) [2]. HIF-1 также может вносить

центральной нервной системы [1]. В ходе эволю-

и неблагоприятный вклад в формирование пост-

ции многоклеточных организмов их клетки при-

гипоксических патологий [3,4].

обрели способность «чувствовать» недостаточ-

HIF-1 является гетеродимером и состоит из

ность снабжения кислородом и осуществлять

нестабильной альфа-субъединицы (HIF-1α) и

адаптивные изменения в экспрессии генов, кото-

стабильной бета-субъединицы (HIF-1β). Димер

рые либо усиливают снабжение кислородом, ли-

связывается с ДНК в специфических участках,

Сокращения: HIF

- гипоксия-индуцируемый фактор,

которые называют элементами, ответственными

NO - монооксид азота.

за гипоксию. В условиях достаточного снабжения

999

1000

ФЕДОРОВ и др.

клеток кислородом HIF-1α гидроксилируется по

первому или по второму высококонсервативным

остаткам лизина доменом пролилгидроксилазно-

го семейства белков [5]. В результате образуется

связывающий сайт для белка, который является

компонентом убиквитин-лигазного комплекса, в

результате HIF-1α полиубиквитинируется и под-

вергается протеасомной деградации, если кисло-

рода достаточно (состояние нормоксии). При

умеренной гипоксии скорость гидроксилирова-

ния HIF-1α уменьшается, в результате он медлен-

нее подвергается протеасомной деградации, на-

капливается, димеризуется с HIF-1β и перено-

сится в ядро, где активирует транскрипцию от ста

до двухсот генов, в том числе участвующих в

эритропоэзе, ангиогенезе, аутофагии и энергети-

ческом метаболизме. Имеется еще одно семей-

Рис. 1. Изменения концентрации тропонина I в плаз-

ство белков - факторы, ингибирующих HIF-1, -

ме крови крыс, не подвергнутых (1) и подвергнутых

(2) действию тяжелой гипоксии в течение трех часов,

которые действуют подобно пролилгидроксилаз-

через сутки после сеанса тяжелой гипоксии. По оси

ному семейству белков, но при более низкой кон-

ординат - концентрация тропонина I в нг/1 мл плаз-

центрации кислорода [2,6].

мы крови.

В последние годы стало очевидно, что на меха-

низм регуляции активности HIF-1 действуют раз-

личные факторы, в том числе активные формы

бина относили к концентрации общего белка. Дан-

кислорода и окись азота [2]. Поэтому в настоя-

ные по биомаркерам получали в двух независимых

щей работе была предпринята попытка изучить

сериях исследований, содержащих не более шести

влияние ингибирования транскрипции HIF-1 на

животных в каждой серии. Данные обрабатывали

повреждение, которое вызывает тяжелая гипоба-

методами дисперсионного анализа (использовали

ричекая гипоксия в двух типах мышц - сердеч-

критерий достоверности разности средних для

ных и скелетных.

малочисленных выборок

[10]). Иллюстрации

были созданы с помощью программы StatSoft Sta-

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

tistica 6.0.

В представленной работе использована модель

тяжелой гипобарической гипоксии - трехчасовой

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

сеанс пребывания крыс-самцов линии Wistar мас-

Согласно полученным данным, было показано

сой 200-250 г при давлении 180 мм рт. ст. (5% О₂)

достоверное превышение уровня сердечного бел-

[7]. Для оценки роли HIF-1 использовали ингиби-

ка тропонина I в плазме крови крыс, подвергну-

тор топоизомеразы I топотекан [8,9], который в

тых трехчасовой тяжелой гипоксии (рис. 1), что

смеси «диметилсульфоксид - 0,09% NaCl» вводи-

свидетельствовало о наличии повреждения мио-

ли внутрибрюшинно (5 мг/кг массы ) за 10 мин до

карда. При этом блокирование перед тяжелой ги-

каждого гипоксического сеанса. В качестве инъек-

поксией транскрипции HIF-1α не оказывало ста-

ционного контроля вводили смесь «диметилсуль-

тистически значимого влияния на этот результат

фоксид - 0,09% NaCl». После сеанса тяжелой ги-

(данные не представлены).

поксии у крыс были взяты образцы крови для

Создается впечатление, что HIF-1 не влияет на

измерения концентрации специфического био-

повреждение миокарда и что, скорее всего, это

маркера повреждения сердечной мышцы - сердеч-

повреждение связано с активными формами кис-

ного тропонина I и менее специфического биомар-

лорода, образующимися в миокарде во время тя-

кера повреждения мышечной ткани - миоглоби-

желой гипоксии и реоксигенации, наступающей

на, а также суммарной концентрации белка в

после тяжелой гипоксии. Как уже было отмечено

плазме крови. Плазму крови замораживали при -

в разделе «Введение», активные формы кислоро-

80°С до момента определения значений биомарке-

да могут влиять на механизм регуляции активно-

ров (миоглобин, тропонин I) с помощью анализа-

сти HIF-1 при гипоксии - гидроксилирование

тора иммунохемилюминисценции DXI (Beckman

посредством белков пролилгидроксилазного се-

Coulter, США). Тропонин I анализировали с помо-

мейства и семейства факторов, ингибирующих

щью набора Access TnI A 78803, миоглобин - с по-

HIF-1 [11,12].

мощью набора Access Immunoassay Systems Myo-

globin 973243, произведеных компанией Beckman

Вторым компонентом, который мог бы повли-

Coulter. Общий белок определяли биуретовым ме-

ять как непосредственно на компоненты кардио-

тодом на биохимическом анализаторе DXC Unicell

миоцитов, так и на механизм регуляции активно-

(Beckman Coulter, США). Концентрацию миогло-

сти HIF-1, является монооксид азота (NO).

БИОФИЗИКА том 64

№ 5

2019

ЭФФЕКТЫ ТЯЖЕЛОЙ ГИПОБАРИЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ

1001

ноксидоредуктаза. Нитритредуктазной активно-

стью обладают цитоглобин и электрон-транс-

портная цепь митохондрий, которая проявляет

нитритредуктазная активность как при гипоксии,

так и при нормоксии. Дополнительные экспери-

менты с кардиомиоцитами показали, что только

генерация NO в митохондриях регулирует уро-

вень циклического гуанозинмонофосфата, опо-

средующего сократимость кардиомиоцитов [13].

В свете полученных данных об увеличении вы-

хода в кровь сердечного тропонина I при тяжелой

гипоксии было бы интересно узнать, повреждает-

ся ли какая-либо из нитритредуктаз сердца при

тяжелой гипоксии. Известно, что вещества, нару-

шающие ферментативную активность ксантиок-

сидоредуктазы, митохондриальное дыхание, бло-

кирующие гемы и тиолы, в той или иной мере

Рис. 2. Изменения концентрации миоглобина в плаз-

ме крови крыс, подвергнутых действию тяжелой ги-

уменьшают также степень превращения нитрита

поксии в отсутствие (1) и в присутствии топотекана

в окись азота в условиях гипоксии [14] .

(2), через сутки после сеанса тяжелой гипоксии. По

После трехчасовой тяжелой гипоксии не было

оси ординат - концентрация миоглобина в микро-

обнаружено достоверно значимых изменений

граммах, отнесенная к одному грамму общего белка

плазмы крови.

выхода в кровь неспецифического мышечного

биомаркера повреждения миоглобина (рис. 2).

Это можно объяснить меньшим увеличением со-

При нормоксии NO ведет к стабилизации ин-

держания активных форм кислорода в скелетных

дуцированного гипоксией фактора, возможно,

мышцах по сравнению с кардиомиоцитами, так

путем прямого ингибирования гидроксилирова-

как значительная часть скелетных мышц млеко-

ния, осуществляемого доменом пролилгидрокси-

питающих представлена белыми мышечными во-

лазного семейства белков.

локнами с малым количеством миоглобина и ци-

тохромов, которым свойственен неокислитель-

При гипоксии NO ослабляет индукцию HIF-

ный тип обмена. В связи с этим при стрессорных

1α (возможно, за счет уменьшения потребления

условиях, таких как тяжелая гипоксия, количе-

кислорода митохондриями), повышая таким об-

ство активных форм кислорода увеличивается не

разом доступность внутриклеточного кислорода

столь значительно, как в сердечной мышце, и они

[13].

оказываются менее чувствительными к гипоксии

Оксид азота является ключевым компонентом

[19,20].

в регуляции гемодинамических параметров, та-

Эксперимент с использованием ингибитора

ких как периферическое сопротивление, артери-

HIF-1α топотекана показал, что концентрация мио-

альное давление, сократимость миокарда, частота

глобина (в нг/1 мл плазмы крови крыс) через сутки

сокращений сердца, и, как следствие, - перфузи-

после сеанса тяжелой гипоксии была в 2,2 раза

рования тканей [14]. При нормоксии основным

меньше, чем в отсутствие ингибитора. Данные каза-

источником NO являются различные изоформы

лись не совсем достоверными из-за большого раз-

NO-синтазы. Однако NO-синтаза становится не-

броса значений, но после приведения к концентра-

эффективной при гипоксических условиях, так

ции общего белка разность средних была уже досто-

как активность этого семейства ферментов зави-

верной (рис. 2). Что касается тропонина I, то

сит от кислорода. Нитрит, второй главный источ-

разность средних у него оказалась достоверной как

ник NO, становится важным именно при гипо-

для концентрации в нг/1 мл, так и для концентра-

ксических условиях [15,16]. Оказалось, что имен-

ции в мкг, отнесенной к 1 г общего белка плазмы

но гипоксия облегчает восстановление нитрита в

крови. Таким образом, можно полагать, что блоки-

NO, процесс, катализируемый так называемыми

рование транскрипционного фактора HIF-1 во вре-

нитритредуктазами, существующими как допол-

мя тяжелой гипоксии уменьшает повреждение ске-

нение к кислород-зависимым NO-синтазам. Об-

летных мышц. При этом следует, вероятно, упомя-

разующийся монооксид азота, в свою очередь,

нуть и мнение автора работы [20] о том, что

служит вазодилятатором сосудов мышц и увели-

клеточная гипоксия и HIF-1α не играют главной ро-

чивает снабжение тканей кислородом. [17]

ли в адаптации скелетных мышц к гипоксии [17].

К нитритредуктазам прежде всего относятся

Поэтому наблюдаемое уменьшение повреждения

миоглобин, содержание которого повышено в

мышц, возможно, является побочным эффектом

сердце, где он наиболее активен в качестве нит-

использованного ингибитора. Что касается данных

ритредуктазы [18], гемоглобин, находящийся в

о защитном действии блокирования HIF-1 во время

эритроцитах, и локализированная там же ксанти-

тяжелой гипоксии, недавно было показано [4], что

БИОФИЗИКА том 64

№ 5

2019

1002

ФЕДОРОВ и др.

такое блокирование приводит в гиппокампе к от-

2. W. Kaelin and P. Rateliffe, Mol. Cell. 30, 393 (2008)

сроченному уменьшению и активности глюкозо-6-

3. Y. Sun, X. Chen, et al., Front. Mol. Neurosci. 10, 257

фосфатдегидрогеназы, в то же время способствует

(2017).

увеличению количества восстановленного никоти-

4. О. В. Ветровой, Автореф. дисс

канд. биол. наук

намидадениндинуклеотидфосфата, нормализации

(СПбГУ, СПб, 2018).

уровня общего глутатиона предотвращению про-

5. W. Kaelin, Ann. Rev. Biochem. 74, 115 (2005).

цессов развития состояния окислительного стресса

6. K. Janke, U. Brockmeier, et al., J. Cell Sci. 126 (12),

и процессов клеточной гибели. Возможно, что ана-

2629 (2013).

логичная ситуация имеет место и в мышечной тка-

ни. В дальнейших исследованиях стоило бы изучить

7. E. Rybnikova, N. Sitnik, et al., Brain Res. 1089 (1), 195

действие введения топотекана на состояние легоч-

(2006).

ной ткани, которая более подвержена повреждению

8. H. Ban, Y. Uto, and H. Nakamura, Expert Opin. Ther.

после тяжелой гипоксии.

Pat. 21, 131 (2011).

Таким образом, можно полагать, что тяжелая ги-

9. О. В. Ветровой, Дисс

канд. биол. наук (СПбГУ,

поксия оказывает повреждающее влияние на серд-

СПб, 2018).

це, а блокирование транскрипционного фактора

10. Н. А. Плохинский, в сб. Актуальные вопросы

HIF-1 с использованием ингибитора HIF-1α топо-

современной генетики, под ред. С. И. Алиханяна

текана за 10 мин до сеанса тяжелой гипоксии умень-

(Изд-во МГУ, М., 1966), сс. 564-602.

шает повреждение скелетных мышц. Эти результа-

11. J. K. Brunelli, E. Bell, et al., Cell Metab. 1, 409 (2005).

ты стоит рассматривать как предварительные и не-

12. K. Mansfield, R. Gury, et al., Cell Metab. 1, 393

обходимо подтвердить другими методами.

(2005).

БЛАГОДАРНОСТИ

13. R. Hagen, C. Taylor, et al., Science 302, 1975 (2003).

Выражаем благодарность О.В. Ветровому за

14. R. Dangel, O. Bernardette, et al., Sci. Reports 7:12092,

организацию экспериментов с животными по тя-

p. 1 (2017)

желой гипобарической гипоксии.

15. M. Feelisch, C. Pensenstadler, et al., J. Biol. Chem.

283, 33927 (2008).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

16. Н. В. Кулева и И. В. Красовская, Цитология 57 (8):

Все применимые международные, националь-

563 (2015).

ные и институциональные принципы ухода и ис-

17. Н. В. Кулева, Д. А. Федоров и И. Е. Красовская,

пользования животных при выполнении работы

Цитология 60 (1), 5 (2018).

были соблюдены.

18. Н. В. Кулева и И. Е. Красовская, Биофизика 61 (5),

861 (2016).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

19. T. Clanton, J. Appl. Physiol. 102, 2379 (2007).

1. E. Rybnikova and M. Samoilov, Front. Neurosci. 23

(9), 388 (2015).

20. T. Chaillou, Front. Physiol. 9 (1450), 1 (2018).

Effects of the Exposure to Severe Hypobaric Hypoxia and Inhibition

of Hypoxia-Inducible Factor-1 (HIF-1) on Biomarkers of Cardiac

and Skeletal Muscles Injury in the Rat

D.A. Fedorov* **, M.Yu. Frolova*, I.E. Krasovskaya*, and N.V. Kuleva*

*St. Petersburg State University, Universitetskaya nab. 7, St. Petersburg, 199034 Russia

**St. Petersburg State Marine Technical University, Lotsmanskaya ul. 3, St. Petersburg, 190121 Russia

The aim of this study was to investigate the molecular mechanisms underlying heart and skeletal muscle dam-

age in male Wistar rats weighing from 200 to 250 g at 180 mm Hg exposed to three hours of severe hypobaric

hypoxia (5% O2) used as a model. Rats exposed to three hours of severe hypoxia presented a significant in-

crease in plasma cardiac troponin I as compared to control, thus reflecting damage to the myocardium after

exposure of rats to severe hypobaric hypoxia. At the same time, the administration of the HIF-1α transcrip-

tion factor inhibitor into animals did not significantly affect plasma concentration of troponin I. On the con-

trary, in the case of the use of a none-specific myoglobin biomarker, there was no significant increase in its

release into the blood after hypoxia compared with the control. At the same time, an experiment using topo-

tecan as an inhibitor of HIF-1α showed that the amount of myoglobin in rat blood plasma one day after ex-

posure of rats to severe hypobaric hypoxia was significantly less than in the absence of the inhibitor. Thus, it

can be assumed that blocking the transcription factor HIF-1α for 10 minutes before exposure of animals to

severe hypobaric hypoxia reduces damage to skeletal muscles. The mechanisms affecting the adaptation of

heart and skeletal muscles to hypoxia are discussed.

Keywords: hypoxia, myoglobin, troponin I, topotecan, hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF1α), myocardium

БИОФИЗИКА том 64

№ 5

2019