БИОФИЗИКА, 2019, том 64, № 6, с. 1088-1093

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОФИЗИКА

УДК 577.3

МЕТОД МУЛЬТИСЕНСОРНОЙ ИНВЕРСИОННОЙ

ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИИ ПРИ АНАЛИЗЕ ДЖЕНЕРИКОВ

ПРОТИВОГЛАУКОМНОГО ПРЕПАРАТА БЕТОПТИК

А.Н. Доронин***, Н.А. Бакунина*, Ю.Д. Кузнецова*^, **, С.Н. Удальцов*****

*НП Международный научно-практический Центр пролиферации тканей, 119034, Москва, ул. Пречистенка, 29/14

**Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздрава РФ,

117997, Москва, ул. Островитянова, 1

***Институт физической химии и электрохимии имени А.Н. Фрумкина PАН,

119071, Москва, Ленинский просп., 31/4

****Институт ядерной физики Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова,

119991, Москва, Ленинские горы, 1

*****Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН,

142290, Пущино Московской области, ул. Институтская, 2

E-mail: vnamiot@gmail.com

Поступила в редакцию 16.05.2019 г.

После доработки 16.05.2019 г.

Принята к публикации 08.07.2019 г.

Новым электрохимическим методом мультисенсорной инверсионной вольтамперометрии изучена

возможность определения в слезной жидкости дженериков препарата бетоптик - ксонефа, бетоф-

тана, беталинка ЕС. Измерения проводили на планарном электроде, имеющем трехэлектродную

конструкцией. Показано, что этот метод эффективен для определения дженериков. Рассмотрена

динамика изменения их концентрации во времени. Показано, что после инстилляции дженериков

у больных глаукомой их концентрация в слезной жидкости не меняется в течение 12 ч. Расширен пе-

речень органических веществ, которые можно определять методом мультисенсорной инверсион-

ной вольтамперометрии.

Ключевые слова: мультисенсорная инверсионная вольтамперометрия, планарные электроды, джене-

рики.

DOI: 10.1134/S0006302919060061

Глаукома - одна из наиболее тяжелых форм

си]-пропан-2-ола гидрохлорид, фармакотерапев-

офтальмопатологии, занимающая лидирующее

тическая группа - противоглаукомное средство,

место после катаракты среди причин слепоты и

селективный бета-1-адреноблокатор. Фармаколо-

слабовидения населения Земли. В Российской

гическое действие препарата - бетаксолол-селек-

Федерации в нозологической структуре слепоты

тивный бета-1-адреноблокатор без внутренней

и слабовидения доля глаукомы составляет 29%.

симпатомиметрической активности, не обладаю-

Распространенность глаукомы среди населения

щий мембраностабилизирующим (местноанесте-

России за последние годы выросла в 2,8 раза [1].

зирующим) действием. При местном применении

Глаукома занимает первое место в структуре пер-

бетаксолол снижает как повышенное, так и нор-

вичной инвалидности по зрению в большинстве

мальное внутриглазное давление вследствие

регионов Российской Федерации.

уменьшения продукции внутриглазной жидкости.

Основное действие большинства противоглау-

Наступление гипотензивного эффекта наблюдает-

комных препаратов связано со снижением внут-

ся через 30 мин после закапывания, а максималь-

риглазного давления. Одним из широко применя-

ное снижение офтальмотонуса по инструкции по

емых для снижения внутриглазного давления в ка-

применению препарата наступает примерно через

честве монотерапии или в сочетании с другими

два часа. После однократной инстилляции влия-

препаратами является бетоптик (бетаксолол).

ние на офтальмотонус сохраняется в течение 12 ча-

Его химическое название - (2RS)-3-(2-прополи-

сов. Бетаксолол, по сравнению с другими бета-ад-

амино)-1-[4-[2-(циклопропилметокси)этил]фенок-

реноблокаторами, не вызывает снижения кровото-

1088

МЕТОД МУЛЬТИСЕНСОРНОЙ ИНВЕРСИОННОЙ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИИ

1089

ка в зрительном нерве. Он также не вызывает

оцениваетcя изменение вcей вольтампеpогpам-

миоза, спазма аккомодации, гемералогии, эффек-

мы. Измеpения пpоводятcя на одном индика-

та «пелены» перед глазами (в отличие от миоти-

тоpном электpоде, что имеет большое пpеиму-

ков). Фармокинетика препарата: бетаксолол высо-

щеcтво по cpавнению c мультиcенcоpными мето-

ко липофилен, в результате чего хорошо проникает

дами, иcпользующими набоp электpодов. Пpи

через роговицу в переднюю камеру. Максимальная

pешении задачи идентификации оpганичеcкиx

концентрация в передней камере определяется че-

вещеcтв метод позволяет пpоводить иx опpеделе-

рез 20 мин после инстилляции. При местном при-

ние c помощью пpедваpительно cоcтавленной ба-

менении системная абсорбция низкая, концентра-

зы данныx.

ция в плазме ниже порога обнаружения (2 нг/мл).

Эффективноcть метода была показана пpи

Выведение осуществляется преимущественно че-

опpеделении ряда офтальмологичеcких пpепа-

рез почки.

pатов - визомитина, бетоптика и ланомакса [5-

Популярность бетоптика привела к появле-

7]. По калибpовочной завиcимоcти опpеделяли

нию ряда его дженериков. К достоинствам дже-

концентpацию визомитина в cлезной жидкоcти.

нериков можно отнести низкую стоимость (за

Методом мультиcенcоpной инвеpcионной вольт-

счет отсутствия затрат на разработку, клиниче-

ампеpометpии была иccледована динамика изме-

ские испытания и лицензионные выплаты), а

нения в слезной жидкости концентpации визо-

также уже существующие результаты клиниче-

митина во вpемени и показано, что чеpез два чаcа

ских испытаний и накопленный опыт практиче-

его концентpация cущеcтвенно уменьшилаcь.

ского применения лекарственного средства (дей-

Аналогичным образом исследовали возможное

ствующего вещества) в виде оригинального пре-

изменение концентрации бетоптика в слезной

парата, который дженерик копирует. Несмотря

жидкости, было показано, что его концентрация

на то что это не оригинальные препараты, к ним

через 12 ч после инстилляции не меняется.

также предъявляются свои требования: должно

Цель работы - с помощью мультисенсорной

соблюдаться соотношение активных фармацев-

инверсионной вольтамперометрии исследовать

тических веществ в препарате, их качественный и

фармокинетику дженериков бетоптика - ксоне-

количественный показатель. Необходимо, чтобы

фа, бетофтана и беталмика ЕС.

дженерик соответствовал требованиям установ-

ленных стандартов. Производиться он должен в

условиях надлежащей производственной практи-

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ки. Дженерик должен быть эквивалентен ориги-

В работе исследовали изменение концентра-

налу по степени и скорости всасывания. Часто у

ции в слезной жидкости после инстилляции сле-

одного и того же препарата имеется несколько

дующих препаратов-дженериков бетоптика

аналогов, но только выпущенные разными

ксонефа (Sentiss Pharma Pvt. Ltd., Индия), бетоф-

фирмами. Поэтому состав, а значит, и эффектив-

тана (ROMPHARM Company, Румыния) и бетал-

ность их могут отличаться. К тому же не все про-

мика ЕС (Unimed Pharma, Словацкая Республи-

изводители соблюдают условия по выпуску дже-

ка). В табл. 1 приведен состав этих препаратов в

нериков [2].

сравнении с составом оригинального бетоптика

В Институте физической химии и электрохи-

(Alcon-Couvreur N.V., Бельгия).

мии имени А.Н. Фрумкина PАН был pазpаботан

Как видно из табл. 1, препарат бетоптик имеет

один из ваpиантов электpоxимичеcкиx методов

гораздо более сложный набор вспомогательных

анализа оpганичеcкиx вещеcтв

- метод

веществ, хотя концентрация активного вещества

мультиcенcоpной инвеpcионной вольтам-

у всех препаратов одинакова (0,5 мг бетаксолола

пеpометpии. Этим методом опpеделяетcя измене-

гидрохлорида).

ние электpоxимичеcкой активноcти катионов ме-

Для проведения испытаний на планарные

таллов в pаcтвоpе в pезультате иx взаимодейcтвия

электроды производства ООО НПП «Автоком»

c оpганичеcкими вещеcтвами [3,4]. В pаcтвоp

(Москва) наносили 50 мкл тест-системы, состоя-

0,05 М KCl вводятcя катионы металлов (теcт-

щей из 0,05 М КС1 и набора катионов металлов

cиcтема), обладающие cпоcобноcтью обpазовы-

(Zn²⁺, Cd²⁺, Рb²⁺,Со²⁺, Hg²⁺) в концентрации

вать комплекcные cоединения c оpганичеcкими

вещеcтвами. Этим металлам cоответcтвуют пики

5∙10^-5 М для каждого катиона, затем снимали ин-

токов pаcтвоpения на вольтампеpогpаммаx. Пpи

версионную вольтамперограмму при потенциале

катодного осаждения металлов -1,55 В относи-

введении пpобы c анализиpуемым вещеcтвом в

pаcтвоp теcт-cиcтемы катионы металлов взаимо-

тельно хлорсеребряного электрода с последую-

дейcтвуют c оpганичеcкими cоединениями, пpи

щей разверткой в анодную сторону до значения

этом на инвеpcионной вольтампеpогpамме

потенциала 0,3 В. Полученная вольтамперограм-

фикcиpуетcя иx влияние на токи pаcтвоpения ме-

ма являлась фоновой (рис. 1, кривая 1).

таллов. Эти изменения опpеделяютcя для каждо-

Далее фильтровальной бумагой с поверхности

го из металлов теcт-cиcтемы или же интегpально

электрода удаляли тест-систему. Затем для изуче-

БИОФИЗИКА том 64

№ 6

2019

1090

БАЛАШОВА и др.

Таблица 1. Состав оригинального препарата «Бетоптик» и его дженериков лозы

№

Препарат

Основной состав 1 мл препарата

Бетоптик (Бельгия)

Активные вещества:

бетаксолола гидрохлорид - 5 мг

Вспомогательные вещества:

бензалкония хлорид - 0,1 мг, полистиренсульфониевая

кислота - 2,5 мг, карбомер 974Р - 4,5 мг, борная кислота -

4,0 мг, маннитол - 45,0 мг, динатрия эдетат - 0,1мг,

N-лаурилсаркозин - 0,3 мг, натрия гидрохлорид, вода

очищенная - до 1,0 мл

Ксонеф (Индия)

Активные вещества:

бетаксолола гидрохлорид - 5 мг

Вспомогательные вещества:

бензалкония хлорид - 0,1 мг, гипромеллоза - 2,0 мг, натрия

гидрохлорид - 8,0мг, натрия гидроксид - 0,5 мг, динатрия

эдетат - 1,0 мг, вода очищенная - до 1,0 мл

Бетофтан (Румыния)

Активные вещества:

бетаксолола гидрохлорид - 5 мг

Вспомогательные вещества:

натрия гидрофосфата додекагидрат, натрия

дигидрофосфата моногидрит, натрия хлорид, динатрия

эдатат дигидрат, бензалкония хлорид, вода очищенная

Беталмик ЕС (Словацкая Республика)

Активные вещества:

бетаксолола гидрохлорид - 5 мг

Вспомогательные вещества:

натрия хлорид, динатрия эдатат, бензалкония хлорид,

натрия гидроксид, вода очищенная

Рис. 1. Инверсионные вольтамперограммы тест-системы с бетофтаном в различных концентрациях: 1 - тест-система;

2 - слезная жидкость здоровых людей; 3 - 4 ∙ 10^-3% бетофтана; 4 - 3 ∙ 10^-3 %. бетофтана; 5 - 2 ∙ 10^-3 % бетофтана; 6 -

1 ∙ 10^-3 % бетофтана; 7 - 0,5 ∙ 10^-3 % бетофтана; 8 - 0,1 ∙ 10^-3 % бетофтана.

БИОФИЗИКА том 64

№ 6

2019

МЕТОД МУЛЬТИСЕНСОРНОЙ ИНВЕРСИОННОЙ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИИ

1091

Рис. 2. Инверсионные вольтамперограммы, показывающие влияние слезной жидкости и бетофтана на тест-систему: 1 -

тест-система, 2 - слезная жидкость, 3 - слезная жидкость после инстилляции бетофтана.

ния влияния дженериков на тест-систему на

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

электрод помещали 50 мкл свежего раствора тест-

Влияние бетофтана в разной концентрации на

системы и диск из пористого материала (филь-

тест-систему. На рис. 1 представлены инверсион-

тровальной бумаги) с нанесенным на него препа-

ные вольтамперограммы, снятые при воздей-

ратом дженерика в необходимой концентрации

ствии на тест-систему препарата бетофтана в раз-

и снова снимали инверсионную вольтамперо-

личных концентрациях.

грамму.

Видно, что с увеличением концентрации пре-

парата уменьшаются токи свинца - от 19 мкА до

Для изучения влияния на тест-систему слез-

12 мкА (φ = -0, 53 В) и кадмия - от 20 мкА до

ной жидкости в конъюктивальный мешок глаза

11 мкА (φ = -0,75 В). При этом токи цинка, ко-

помещали диск диаметром 8 мм из предваритель-

бальта и ртути практически не изменяются.

но обработанного пористого материала (филь-

Аналогичное влияние на тест-систему проде-

тровальной бумаги, которую предварительно

монстрировали и другие дженерики с тем же со-

тщательно промывали в спирте и дистиллирован-

держанием активного вещества (бетаксолола гид-

ной воде и сушили при температуре 80°С в тече-

рохлорид, 5 мг) - ксонеф и беталмик ЕС.

ние трех часов). Затем на электрод вновь наноси-

Таким образом, показано, что метод мульти-

ли 50 мкл тест-системы и помещали бумажный

сенсорной инверсионной вольтамперометрии

диск со слезной жидкостью, извлеченный из

может быть использован при определении кон-

конъюктивального мешка. Инверсионную вольт-

центрации дженериков в тест-системе.

амперограмму слезной жидкости снимали при

Влияние слезной жидкости здоровых людей на

тех же условиях, что и фоновую.

тест-систему. После регистрации вышеуказан-

ным методом фоновой инверсионной вольтампе-

При изучении влияния дженериков на слез-

рограммы (рис. 2, кривая 1) в тех же условиях

ную жидкость после их инстилляции раствор

снимали вольтамперограмму слезной жидкости.

дженерика вносили в конъюктивальный мешок

На рис. 2 (кривая 2) показана соответствующая

глаза и туда же помещали диск из фильтроваль-

усредненная вольтамперограмма слезной жидко-

ной бумаги. Через определенное время бумажный

сти, полученная от десяти здоровых людей. Ин-

диск извлекали из конъюктивального мешка и

дивидуальный разброс вольтамперограмм со-

помещали на электрод с нанесенной на него тест-

ставлял 12%.

системой. Измерения проводили через 30 мин, 1 ч

Содержание бетофтана в слезной жидкости по-

и далее через каждый час в течение 12 ч после ин-

сле инстилляции в зависимости от времени. Бетоф-

стилляции препарата.

тан по 1 капле вносили в конъюктивальный ме-

БИОФИЗИКА том 64

№ 6

2019

1092

БАЛАШОВА и др.

Таблица 2. Влияние на тест-систему слезной жидкости после инстилляции бетоптика и его дженериков с

одинаковой концентрацией активного вещества

Пики токов растворения металлов, мкА

Слезная жидкость

Здоровые люди

1,6

14,6

14,0

13,2

13,0

12,8

Больные глаукомой после инстилляции

1,6

11,2

12,4

10,0

5,6

4,6

бетоптика

Больные глаукомой после инстилляции

7,1

6,1

5,5

бетофтана

Больные глаукомой после инстилляции

9,5

11,5

10,4

5,0

4,2

ксонефа

Больные глаукомой после инстилляции

9,5

6,0

беталмика ЕС

Примечание. Вольтамперограммы слезной жидкости были измерены через 12 ч после инстилляции препаратов.

шок глаза и туда же помещали диск диаметром

ния при инстилляции препаратов в виде жжения

8 мм из фильтровальной бумаги. Через заданное

или пощипывания в области коньюнктивы.

время бумажный диск извлекали из конъюкти-

вального мешка и помещали на электрод с нане-

сенной на него тест-системой. Измерения прово-

ВЫВОДЫ

дили через 30 мин, 1 ч и далее через каждый час в

течение 12 ч после инстилляции препарата. Ока-

1. Показано, что по сравнению с вольтамперо-

залось, что при времени воздействии бетофтана

граммой слезной жидкости здоровых людей вли-

от 30 мин до 12 ч токи растворения металлов не

яние препаратов бетоптика, ксонефа, бетофтана

изменяются. Соответствующая вольтамперо-

и беталмика ЕС наблюдается в основном для рту-

грамма представлена на рис. 2 (кривая 3).

ти и кобальта - токи растворения этих металлов

уменьшаются от 12 до 6 мкА для кобальта и от 12

Из приведенных результатов измерений сле-

до 5 мкА - для ртути.

дует, что концентрация бетофтана в слезной жид-

кости в течениe 12 ч не меняется. Следовательно,

2. Изученные препараты достаточно устойчи-

препарат достаточно устойчив во времени и через

вы во времени и через 12 ч после инстилляции

12 ч после инстилляции продолжает оказывать

продолжают оказывать действие на слезную жид-

действие на слезную жидкость, а также на рогови-

кость.

цу глаза.

3. Применение дженериков бетоптика (ксоне-

Аналогичным образом была изучена концен-

фа, бетофтана и беталмика ЕС) вызывало незна-

трация ксонефа и беталмика ЕС в слезной жидко-

чительные неприятные ощущения при инстилля-

сти в зависимости от времени после инстилля-

ции в виде жжения или пощипывания в области

ции. В табл. 2 показано влияние на тест-систему

коньюнктивы.

бетоптика и трех его дженериков с одинаковой

концентрацией активного вещества (бетаксолола

4. Метод мультисенсорной инверсионной

гидрохлорид, 5 мг) через 12 ч после инстилляции.

вольтамперометрии позволяет анализировать в

формате «Электронный язык» действие различ-

Одинаковое влияние на тест-систему джене-

ных офтальмологических препаратов на слезную

риков с одинаковой концентрацией активного

жидкость во времени.

вещества указывает на то, что на тест-систему в

основном влияет именно бетаксолол, а не сово-

купность входящих в состав препаратов вспомо-

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

гательных компонентов.

Следует отметить, что применение дженери-

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

ков вызывало у испытуемых неприятные ощуще- интересов.

БИОФИЗИКА том 64

№ 6

2019

МЕТОД МУЛЬТИСЕНСОРНОЙ ИНВЕРСИОННОЙ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИИ

1093

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

3. И. И. Колеcниченко, А. Л. Клюев, В. М. Ганшин

и дp., Физикоxимия повеpxноcти и защита

Все процедуры, выполненные в исследовании

матеpиалов 50 (4), 440 (2014).

с участием человека, соответствовали этическим

стандартам Хельсинкской декларации 1964 г. и ее

4. Л. М. Балашова, И. И. Колеcниченко и Е. П. Кан-

последующим изменениям.

таpжи, Клин. геpонтология 23 (9-10), 6 (2017).

От участников исследования было получено

5. И. И. Колеcниченко, Л. М. Балашова и Е. П. Кан-

информированное добровольное согласие.

таpжи, Клин. геpонтология 23 (9-10), 36 (2017).

6. И. И. Колесниченко, А. Н. Доронин, Е. П. Кан-

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

таржи и Л. М. Балашова, Вестн. МГТУ

им. Н.Э. Баумана. Сер. Естеств. науки, № 2, 107

1. А. П. Нестеров, Глаукома (Медицинское

(2018).

информационное агенство, М., 2014).

2. И. Б. Бондарева, Клин. фармокинетика, № 1(2), 7

7. Л. М. Балашова, В. А. Намиот, И. И. Колеcни-

(2005).

ченко и др., Биофизика 63 (4), 825 (2018).

A Multisensory Stripping Voltammetry Method for Analysis

of Generic Anti-Glaucoma Drug Betoptic

L.M. Balashova*^, **, I.I. Kolesnichenko***, V.A. Namiot****,

A.N. Doronin***, N.A. Bakunina*, Yu.D. Kuznetsova*^, **, and S.N. Udaltsov****

*International Scientific and Practical Center for Tissue Proliferation, ul. Prechistenka 29/14, Moscow, 119034 Russia

**Pirogov Russian National Research Medical University, Ministry of Healthcare of the Russian Federation,

ul. Ostrovityanova 1, Moscow, 117997 Russia

***Frumkin Institute of Physical Chemistry and Electrochemistry, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119071

****Institute of Nuclear Physics, Moscow State University, Leninskie gory 1, Moscow, 119991 Russia

*****Institute of Physicochemical and Biological Problems in Soil Science, Russian Academy of Sciences,

ul. Institutskaya 3, Pushchino, Moscow Region, 142290 Russia

A new electrochemical method of multisensory stripping voltammetry has been used to know if it is appro-

priate for determination of generic medications of the preparation Betoptic such as Хonef, Betoftan, Betalink

EU in tear fluid. Measurements were carried out on a planar three-electrode interdigitated electrode. It has

been shown that this method is effective for determination of generics. The dynamics of changes in their con-

centrations over time are examined. After instillation of generics in glaucoma patients, their concentrations

in the lacrimal fluid remained unchanged within 12 hours. The list of organic substances, which can be de-

termined by the method of multisensory stripping voltammetry, is extended.

Keywords: multisensory stripping voltammetry, planar electrodes, generics

БИОФИЗИКА том 64

№ 6

2019