БИОФИЗИКА, 2019, том 64, № 6, с. 1094-1102

БИОФИЗИКА КЛЕТКИ

УДК 578/579.6

МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСОВ

И БИОСЕНСОРНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ

*Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН,

410049, Саратов, просп. Энтузиастов, 13

**Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова,

410012, Саратов, Театральная пл., 1

***Саратовский филиал Института радиотехники и электроники им. В.А. Котельникова РАН,

410019, Саратов, ул. Зеленая, 38

E-mail: guliy_olga@mail.ru

Поступила в редакцию 13.03.2019 г.

После доработки 13.03.2019 г.

Принята к публикации 03.09.2019 г.

Приводится краткий обзор современных методов обнаружения вирусов, в том числе на примере

бактериофагов. Уделено внимание скрининговым методам для определения вирусов при анализе

большого количества образцов, которые позволяют избежать серьезных затрат при детекции виру-

сов. Одним из наиболее востребованных направлений в микробиологии является разработка био-

сенсорных методов определения вирусов, в том числе на основе методов электрофизического ана-

лиза. Интерес к биосенсорным системам для обнаружения вирусов в водных растворах обусловлен

их простотой, быстротой, экономичностью и относительно высокой чувствительностью. Показана

перспективность применения электроакустических датчиков при разработке биосенсорных мето-

дов определения вирусов.

Ключевые слова: детекция вирусов, бактериофаги, антитела, биосенсоры.

DOI: 10.1134/S0006302919060073

щих измерительных приборов. Кроме этого, даже

Детекция вирусных частиц имеет большое

при наличии измерительных приборов велика до-

практическое значение, поскольку вирусные ин-

фекции на сегодняшний день остаются одной из

ля ручных операций, требующих высокой квали-

фикации обслуживающего персонала. Поэтому

глобальных проблем современности. Для опреде-

разработка новых и эффективных экспресс-мето-

ления и идентификации вирусов используют раз-

дов для решения вопросов быстрого анализа ви-

личные подходы, такие как микробиологические

и биохимические тесты, методы генной инжене-

русных частиц является актуальной. Приборная

рии и иммунологические методы.

реализация этих методов должна обеспечивать

высокую точность измерений, а измерения долж-

Существующие методы определения вирус-

ны проводиться в автоматическом режиме персо-

ных частиц можно разделить на следующие груп-

налом средней квалификации. Важным критери-

пы:

ем при разработке новых методов определения

1) Детекция (идентификация, определение

вирусов является их универсальность и возмож-

концентрации, размеров и иных физико-химиче-

ность использования для различных объектов.

ских свойств) вирусных частиц (вирионов) и

Бактериофаги являются прекрасной моделью для

определение вирусной инфекционности;

разработки систем детекции вирусов, а инстру-

2) Определение вирусных антигенов;

ментом для распознавания вирусов могут слу-

3) Определение вирусных нуклеиновых кислот [1].

жить специфичные им антитела и микробные

Несмотря на значительное число разработан-

клетки [2]. Для детекции вирусов используется

ных методов детекции вирусных частиц, их прак-

довольно широкий спектр методов, каждый из

тическое использование затруднено из-за слож-

которых имеет свои преимущества и недостатки

ности, дороговизны и малого числа существую-

[1,3-6].

Сокращения: АСМ

- атомно-силовая микроскопия,

В работе представлен краткий обзор современ-

ПЦР - полимеразная цепная реакция.

ных методов, используемых для определения ви-

1094

МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСОВ

1095

русов, в том числе на примере бактериофагов.

У методов, основанных на подсчете количе-

Особое внимание уделено перспективам приме-

ства «бляшек», есть ограничения, поскольку бак-

нения методов электроакустического анализа для

териофаг может вызывать образование слишком

определения вирусов.

маленьких негативных колоний или колонии об-

разуются довольно медленно, что значительно за-

трудняет определение титра фага путем подсчета

КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ

негативных колоний. Чтобы преодолеть этот не-

ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИОФАГОВ

достаток, в нижний слой агара добавляют краси-

тель, например генцианвиолет. При этом нега-

Бактериофаги являются самой многочислен-

тивные колонии будут менее окрашенными, так

ной группой среди вирусов, характеризующейся

как краситель будет диффундировать только в

высоким уровнем генетического разнообразия.

живые клетки [8].

Используемые методы обнаружения бактериофа-

гов условно можно разделить на качественные и

Преимуществом вышеперечисленных методов

является то, что для их проведения не требуется

количественные. Большинство качественных ме-

дорогостоящее оборудование. К недостаткам сле-

тодов обнаружения вирусов в исследуемом мате-

риале основаны на принципе бактериофагии

дует отнести тот факт, что не все бактериофаги

Д’Эрелля, когда анализируемый материал засева-

(например, умеренные) способны образовывать

ют совместно с чувствительными микробными

негативные колонии и вызывать просветление

бактериальной суспензии, как и не все бактерии-

клетками на жидкие и плотные питательные сре-

хозяева могут образовывать сплошной рост газо-

ды. К качественным методам можно отнести сле-

дующие: метод прямого выделения бактериофа-

ном [11].

гов из анализируемого материала; выделение бак-

териофагов путем обогащения «без подсева»;

ПРЯМЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

выделение бактериофагов посредством обогаще-

БАКТЕРИОФАГОВ

ния с подсевом.

К прямым методам определения бактериофа-

К качественным микробиологическим мето-

гов можно отнести электронную микроскопию,

дам можно также отнести и пробы определения

которая популярна среди вирусологов и является

бактериофагов на плотных питательных средах

одним из необходимых этапов в процедуре иссле-

по методу Отто и методу Фюрта; а также индика-

дования вирусов [12].

цию бактериофагов в жидкой питательной среде

[7,8].

Г. Акерманн и М. Хэлдал [13] при помощи

электронной микроскопии идентифицировали

Для количественного определения содержа-

ряд водных вирусов изометрической, плеоморф-

ния вируса (титра) предложены различные мето-

ной и нитевидной формы. К. Ашелфорд с соавт.

ды и подходы, но наиболее доступным является

[14] применили метод трансмиссионной элек-

подсчет негативных колоний бактериофага на га-

тронной микроскопии для подсчета общего ко-

зоне индикаторной культуры по Грациа (метод

личества бактериофагов почв. Для контроля эф-

бляшек) и титрование фага в жидкой питательной

фективности подсчета использовали тестовый

среде, предложенное Аппельманом [7,9,10].

бактериофаг, выделенный из Serratia quinivorans.

Одной из доступных форм количественного

Концентрация вирусных частиц, определенная

определения вируса является подсчет количества

методом прямого подсчета, оказалась в 350 раз

вирусных «бляшек» (стерильных пятен) на моно-

больше концентрации, рассчитанной при помо-

слое клеток культуры. Дульбекко и Фогт модифи-

щи классического метода бляшек.

цировали данный метод и показали возможность

Использование электронной микроскопии

его применения для определения вирусов живот-

для детекции вирусов ограничивается тем, что

ных. Разработанный метод бляшек по Дульбекко

количество вирусов в анализируемом образце

имеет несколько модификаций.

должно составлять не менее 10⁶ вирусных частиц

В том случае, когда вирусы не вызывают ги-

в 1 мл. Чтобы повысить чувствительность данно-

бель клеток, инфекционность определяют мето-

го метода, исследователи применяют подложки с

дами трансформации, гемадсорбции или интер-

повышенными адсорбционными свойствами.

ференции. К примеру, ряд онкогенных вирусов,

Например, А.К. Сироткин [15] разработал метод

которые способны лизировать культуру клеток

обнаружения вирусов с помощью электронной

одного вида, могут «трансформировать» другие

микроскопии, модифицировав подложки синте-

типы клеток без их лизиса. В результате такие

тическими полимерами. Им было выявлено срод-

трансформированные клетки приобретают свой-

ство поверхностных антигенов вирусов к амино-

ства злокачественных клеток и становятся явно

кислотным последовательностям синтетических

отличимыми от клеток, не инфицированных ви-

полимеров. В результате эффективность обнару-

русом.

жения вирусных частиц увеличилась на 25%.

БИОФИЗИКА том 64

№ 6

2019

1096

ГУЛИЙ и др.

К недостаткам метода электронной микроско-

ка и совершенствование автоматизированных си-

пии можно отнести тот факт, что данная процеду-

стем анализа результатов [17].

ра занимает много времени и для ее проведения

К экспресс-методам количественного опреде-

требуется подготовка квалифицированных спе-

ления бактериофагов можно отнести и эпифлуо-

циалистов [16]. К тому же некоторые вирусы

ресцентную микроскопию. Данный метод явля-

очень трудно различить по морфологии в преде-

ется более быстрым по сравнению с электронной

лах одного семейства, что затрудняет их иденти-

микроскопией [23]. В основу метода положено

фикацию. Данный недостаток может быть устра-

свойство некоторых красителей поглощать свет

нен с помощью метода иммунной электронной

при определенной длине волны, а при связыва-

микроскопии, основанной на образовании им-

нии с нуклеиновыми кислотами - излучать свет с

мунных комплексов при добавлении к вирусным

большей длиной волны. В результате свет, испус-

частицам специфической сыворотки. Кроме то-

каемый ярко окрашенными частицами, значи-

го, метод иммунной электронной микроскопии

тельно превышающими фактический размер ви-

более чувствителен [3].

русных частиц, делает возможным их подсчет при

гораздо меньшем увеличении по сравнению с не-

Прогресс в изучении вирусов был достигнут и

окрашенными вирусными частицами [12]. Недо-

благодаря использованию для детекции и визуа-

статком метода является то, что для полного

лизации вирусов атомно-силовой микроскопии

окрашивания вирусных частиц красителем требу-

(АСМ). При помощи данного метода вирусы мо-

гут исследоваться в жидкой среде в естественном

ется 48 ч, к тому же не исключено возникновение

помех при использовании фиксаторов на основе

состоянии, а сам метод обладает высокой разре-

альдегидов [24]. Кроме того, метод эпифлуорес-

шающей способностью (от нанометров до сотен

центной микроскопии не дает представления об

микрометров). При этом можно получить сведе-

инфекционной способности бактериофагов. Бо-

ния о высоте, структуре и поверхностных свой-

ствах вирусных частиц и нет необходимости ис-

лее того, для получения достоверных результатов

требуется сократить время между обработкой об-

пользовать метки [17,18].

разца и его анализом в ходе микроскопирования,

АСМ может применяться для количественной

поскольку вирусные частицы разрушаются с те-

и качественной оценки вирусных частиц и позво-

чением времени.

ляет отличать целые вирионы от пустых вирусных

капсидов. На основе АСМ предлагается создание

биочипов для детекции вирусов и бактерий. При

ДЕТЕКЦИЯ БАКТЕРИОФАГОВ

этом предлагается использовать разнообразные

С ПРИМЕНЕНИЕМ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ

сенсорные покрытия с использованием антител

КРАСИТЕЛЕЙ

[19].

Применение флуоресцентных красителей по-

При помощи АСМ группой американских ис-

лучило распространение в методе проточной ци-

следователей была продемонстрирована возмож-

тометрии, с помощью которой можно быстро об-

ность идентификации бактериофага fd, парвови-

наружить и подсчитать количество вирусов, обла-

русов и вирусов Коксаки без использования ка-

дающих различными размерами, морфологией и

ких-либо контрастирующих веществ или меток.

типами генома. Проточная цитометрия представ-

В этом случае чувствительность метода составила

ляет собой аналитический метод, в котором спе-

10⁸ БОЕ/мл [20]. Методом АСМ показана воз-

циальная система с помощью гидрофокусировки

можность детекции бактериофага M13KO7, при

формирует струю из последовательно пролетаю-

этом чувствительность метода также составила

щих исследуемых частиц. При прохождении ча-

стиц через лазерный луч измеряются их оптиче-

10⁸ БОЕ/мл [21].

ские характеристики: величины светорассеяния,

Возможности использования АСМ были про-

аутофлуоресценции (либо флуоресценции, если

демонстрированы на примере детекции ряда ви-

частицы предварительно окрасили), временного

русов, содержащихся в водных пробах, с учетом

профиля оптических сигналов. Эти данные соби-

их морфологических характеристик (формы и

раются датчиками, обрабатываются при помощи

размера). Были использованы три модельных

компьютера и на их основании получают сведе-

объекта - вирус полиомиелита, ротавирус и аде-

ния о размерах и свойствах частиц [25].

новирус [22], были определены размеры вирусов

Для обнаружения и распознавания широкого

и получены их АСМ-изображения.

спектра различных вирусов впервые метод про-

Несмотря на все преимущества, метод АСМ

точной цитометрии был применен в работе

имеет и недостатки. Требуется оптимизация про-

К. Бруссаард с соавт. [26]. Исследователи, ис-

боподготовки образцов, размер поля сканирова-

пользуя проточный цитометр, оснащенный стан-

ния ограничивается малыми размерами, зонд мо-

дартным аргон-ионным лазером, показали воз-

жет повреждать поверхность образца в случае

можность определения вирусов, принадлежащих

контактного режима работы, требуется разработ-

таким семействам, как Baculoviridae, Herpesviridae,

БИОФИЗИКА том 64

№ 6

2019

МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСОВ

1097

Myoviridae, Phycodnaviridae, Picornaviridae, Podovir-

достоинствами которого являются быстрота про-

idae, Retroviridae и Siphoviridae.

ведения и легкость применения [31].

Цитологические методы для детекции вирусов

Радиоиммунный анализ основан на введении

на сегодняшний день применяются достаточно

в один из компонентов реакции радиоактивной

редко, но, тем не менее, при ряде инфекций по-

метки и ее дальнейшей детекции радиоспектро-

прежнему используются при исследовании мате-

метром. При этом для визуализации взаимодей-

риалов биопсии, мазков и др. К примеру, так оце-

ствия «антиген-антитело» в качестве метки ис-

нивают состояние тканей печени при диагности-

пользуются не красители и ферменты, а радиоак-

ке хронических гепатитов [27].

тивные соединения. Радиоиммунный анализ

является высокочувствительным и специфичным

методом и в настоящее время часто применяется

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

для определения гормонов. Имеются данные о

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИРУСОВ

применении этого метода для ранней диагности-

ки туберкулезной инфекции и определения виру-

К распространенным методам определения ви-

са лейкоза у мышей. К недостаткам метода стоит

русов относятся и иммунологические методы, ос-

отнести высокую стоимость применяемого обо-

нованные на определении вирусных антигенов.

рудования (гамма-счетчиков) и использование

Серологическая диагностика позволяет идентифи-

радиоактивных веществ [3].

цировать вирус даже в том случае, когда выделение

вирусных частиц из образца не дает никаких ре-

Для типирования вирусов традиционно при-

зультатов. Один из наиболее распространенных

меняется реакция связывания комплемента. В

методов - метод иммуноферментного анализа (en-

основу метода положен принцип связывания об-

zyme-linked immunosorbent assay - ELISA). В осно-

разующегося иммунного комплекса «антиген-

ву метода положено явление взаимодействия «ан-

антитело» глобулярными белками системы ком-

тиген-антитело». Для визуализации данного взаи-

племента. Реакция связывания комплемента про-

модействия используют фермент в качестве метки,

водится в два этапа. На первом этапе происходит

а затем анализируют сигнал физико-химическими

специфическое взаимодействие между антиге-

методами. Существует большое количество вари-

ном и антителом. На втором - к образовавшемуся

антов этого метода. Метод иммуноферментного

комплексу через Fc-фрагмент антитела присо-

анализа обладает высокой чувствительностью и

единяется комплемент. В случае если специфиче-

быстротой анализа. Недостатком метода является

ское взаимодействие между антигеном и антите-

возможность получения ложноположительных и

лом не происходит, комплемент остается не свя-

ложноотрицательных результатов, а также необхо-

занным.

Однако

реакция

связывания

димость использования метки [28].

комплемента обладает недостаточно высокой

чувствительностью и является сложной при про-

Другой разновидностью серологических мето-

ведении стандартизации реагентов [30].

дов является реакция иммунофлуоресценции, ос-

нованная на использовании антител, связанных

В вирусологических лабораториях для сероло-

не с ферментом, а с красителем, например флуо-

гической идентификации ряда вирусов широко

ресцеинизотиоцианатом. Принцип метода был

используется реакция торможения гемагглюти-

нации. Суть метода заключается в способности

разработан А. Кунсом в 1942 г. [29]. Различают

противовирусных антител предотвращать агглю-

разновидности метода - прямой и непрямой [30].

Методика иммунофлуоресценции отвечает кри-

тинацию эритроцитов гемагглютининами виру-

териям высокой чувствительности и специфич-

сов. Если же в сыворотке крови отсутствуют спе-

ности, метод относительно дешев, прост в выпол-

цифичные противовирусные антитела, то проис-

ходит агглютинация эритроцитов вирусными

нении, не требует специального дорогостоящего

белками. В противном случае антитела нейтрали-

оборудования, позволяет быстро получить ре-

зультат (в течение 30-50 мин), но требует испол-

зуют вирус. Использование метода может быть

нения опытным и компетентным лабораторным

ограничено из-за наличия в сыворотке крови лю-

работником. К недостаткам метода относится

дей неспецифических ингибиторов вирусов, а

также естественных антител - агглютининов [32].

низкая достоверность для мелких объектов, по-

скольку вирусы остаются за пределами разреша-

Реакция пассивной гемагглютинации основана

ющей способности микроскопа [30]. Для успеш-

на том, что на поверхности эритроцитов фиксиро-

ного проведения реакции иммунофлуоресцен-

ваны антигены возбудителя, при этом их агглюти-

ции требуется достаточно высокая концентрация

нация происходит только в присутствии специ-

вирусных частиц в образце, причем даже незна-

фичных к данному возбудителю антител [3].

чительная его контаминация способна давать не-

Реакция обратной пассивной гемагглютинации

специфическое свечение [3].

в основе имеет принцип, противоположный пас-

Для диагностики вирусов успешно применя-

сивной гемагглютинации, при этом индикатором

ется метод иммунохроматографического анализа,

является агглютинация эритроцитов, которые бы-

БИОФИЗИКА том 64

№ 6

2019

1098

ГУЛИЙ и др.

ли подвергнуты сенсибилизации специфическими

рецепторы и нуклеиновые кислоты. Система де-

антителами, в присутствии вирусных антигенов.

текции может быть оптической, калориметриче-

Данная реакция широко применяется для опреде-

ской, акустической, электрической и др. Суще-

ления HBs-антигена крови. Также существует дру-

ствует возможность комбинирования всех воз-

гая разновидность метода гемагглютинации - ре-

можных элементов, что говорит о возможности

акция непрямой гемагглютинации [3].

создания огромного числа разнообразных биосен-

сорных систем [34].

М. Лос с соавт. [35] для быстрого обнаружения

МЕТОД ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ

фаговой инфекции и явления лизогении предло-

РЕАКЦИИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИРУСОВ

жили использование электрохимического биочи-

Довольно широко используют методы выделе-

па. Принцип метода заключается в захвате моле-

ния нуклеиновой кислоты вируса и ее детекции с

кул-мишеней (либо нуклеиновых кислот, либо

помощью весьма надежного метода - полимераз-

белков) на чипе с использованием зонда, кото-

ной цепной реакции (ПЦР). ПЦР позволяет де-

рый соединен с ферментом, катализирующим ре-

тектировать присутствие даже незначительных

акцию окисления-восстановления. Электриче-

количеств вирусной нуклеиновой кислоты в ма-

ский сигнал, появляющийся в результате этой ре-

териале посредством значительного увеличения

акции, измеряется с помощью микроэлектрода. В

определенных участков вирусных генов. Метод

работе были использованы два вида биочипов -

является высокочувствительным и был впервые

для обнаружения нуклеиновых кислот бактерио-

предложен К. Муллисом в 1983 г. При помощи

фагов (с использованием ДНК-зондов) и для об-

фрагмента ДНК-полимеразы он предложил ам-

наружения вирионов (с использованием специ-

плифицировать ДНК в ходе многократных цик-

фических антител). Авторы продемонстрировали

лов ее репликации, используя затравки-прайме-

возможность обнаружения фагов М13, P1, Т4 и λ

ры, комплементарные участку ДНК. Метод был

в течение короткого времени (25-50 мин) и в ко-

на тот момент довольно трудоемким и требовал

личестве от 10⁴ до 10⁷ частиц.

для проведения много времени. Позже, с разви-

Разработан оптический имммунодатчик для об-

тием приборного обеспечения и открытием тер-

наружения биомаркера неструктурного белка 1 ден-

мостабильного фермента Taq-полимеразы, по-

ге в клинических образцах, полученных на ранних

явилась возможность автоматизации метода [33].

стадиях инфекции. Принцип действия основан на

Методом ПЦР можно обнаружить не только

определении антигена неструктурного белка 1 на ос-

ДНК-содержащие вирусы, но и вирусы, содержа-

нове иммунофлуоресценции с использованием изо-

щие РНК (методом обратной транскрипции).

тиоцианата флуоресцеина, конъюгированного с

Посредством проведения реакции обратной

IgG-антителом. Датчик характеризуется высокой

транскрипции получают комплементарную ДНК

воспроизводимостью (относительное стандартное

(кДНК), которая и используется в реакции ам-

отклонение составило 2%), хорошей стабильностью

плификации [5]. Главным фактором, ограничи-

в течение 21 суток при 4°C, предел детекции равнял-

вающим широкое применение методики ПЦР в

ся 15 нг · мл^-1 [36].

реальном времени, является высокая стоимость

В работе [37] при помощи биосенсера из тонких

аппаратуры.

пленок нанопористого кремния показана возмож-

ность обнаружения бактериофага MS2. Преиму-

МЕТОДЫ ЭЛЕКТРОФИЗИЧЕСКОГО

щества нанопористого кремния заключаются в

АНАЛИЗА И БИОСЕНСОРНЫЕ

простоте его изготовления и чрезвычайно высокой

ТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ВИРУСОВ

площади поверхности материала, что делает его

идеальной основой для изготовления датчиков.

Для детекции вирусных частиц все чаще при-

Методом ковалентной биоконъюгации на пори-

меняются биосенсоры, обладающие различной

стых пленках были иммобилизованы антитела, а

конструкцией и механизмом действия. Биосенсо-

затем в систему вводили меченые красителем бак-

ры позволяют значительно уменьшить время

териофаги MS2. В ходе измерения флуоресценции

проведения анализа благодаря относительной

была установлена возможность обнаружения ви-

простоте проведения процедур и, как показывают

русных частиц в количестве 2 · 10⁷БОЕ/мл.

литературные данные, являются довольно чув-

ствительными и требуют минимальной предва-

В работе [38] приведены данные по примене-

рительной обработки исследуемого материала.

нию электрохимического биосенсора (геносен-

сора и иммуносенсора) для определения вируса

Биосенсоры, как правило, состоят из двух ком-

понентов - чувствительного биологического эле-

птичьего гриппа.

мента и системы детекции. Биологический эле-

На примере детекции бактериофага Т7 пред-

мент может быть каталитическим и некаталитиче-

ложено использование колориметрического им-

ским. К каталитическим элементам можно

муносенсора, изготовленного на основе наноча-

отнести ферменты и ткани, к некаталитическим -

стиц золота, ковалентно связанных со специфич-

БИОФИЗИКА том 64

№ 6

2019

МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСОВ

1099

ными антителами на бактериофаг T7

[39].

тике взаимодействий, возникающих на поверхно-

Описанная модель иммуносенсора, благодаря об-

сти металлической пленки [41,42].

разованию иммунных комплексов бактериофага

Поверхностный плазмонный резонанс можно

с антителами и наночастицами золота, позволяет

отнести к экспресс-методам. Например, в работе

быстро, просто и селективно детектировать ви-

[42] была показана возможность обнаружения

рус. В результате можно невооруженным взгля-

бактериофагов кишечной палочки при помощи

дом наблюдать изменение окраски раствора от

двухканального микрофлюидного сенсора в ре-

красной до фиолетовой. При этом авторы делают

жиме реального времени. На золотую пленку, ис-

вывод, что данный способ может быть использо-

пользуя авидин в качестве лиганда, наносили

ван для детекции практически любых вирусов.

биотинилированные клетки Escherichia coli WG5.

Иммобилизованные таким образом клетки бак-

На примере бактериофга PhiX17 и клеток

терий использовали как мишени для селективно-

E. coli WG5, чувствительных к данному фагу, был

го детектирования колифагов. После добавления

продемонстрирован быстрый метод обнаружения

к данной системе бактериофагов, выделенных из

вирусных частиц в образце при помощи цельно-

сточных вод, наблюдалось их связывание с клет-

клеточного биосенсора (whole-cell biosensor). На

ками. Чувствительность данного метода состави-

поверхности металлического электрода была

сформирована биопленка из клеток кишечной

ла 102 БОЕ/мл при времени инкубации 120 мин.

палочки. Инфекция клеток биопленки специ-

Все чаще находят свое применение в биологии

фичным бактериофагом проводит к их лизису и

и медицине методы электроакустического анали-

изменению импеданса на поверхности микро-

за, поскольку эти методы характеризуются высо-

электрода. Это изменение регистрировали при

кой чувствительностью, точностью измерений, а

помощи импедансной спектроскопии. Метод яв-

также минимальным временем для проведения

ляется простым и позволяет детектировать бакте-

анализа [43]. Акустические биосенсоры могут

риофаги до тех пор, пока на чипе есть чувстви-

быть выполнены на основе пьезоэлектрических

тельные к нему клетки [40].

кристаллов, таких как кварц, ниобат лития или

танталат лития, поскольку они характеризуются

В конце 60-х годов ХХ века Е. Кретчманном бы-

высокой химической устойчивостью. Кроме того,

ла показана возможность возбуждения поверх-

такие датчики универсальны и в принципе могут

ностных плазмонов поляризованным светом, что

обнаружить различные биомолекулы. Датчики на

послужило толчком к развитию метода поверх-

основе акустических волн классифицируются в

ностного плазмонного резонанса. Спустя

10-

соответствии с генерируемыми ими волнами, та-

20 лет при использовании явления плазмонного

кими как объемные или поверхностные акусти-

резонанса рядом исследователей была показана

ческие волны. Акустические волны, возбуждае-

возможность применения метода для исследова-

мые в пьезоэлектрической среде, представляют

ния биологических объектов, в том числе и виру-

собой привлекательную технологию для создания

сов. Преимуществом данной технологии является

целого семейства датчиков, характеризующихся

возможность наблюдать практически любые меж-

высокой чувствительностью, быстротой проведе-

молекулярные взаимодействия в режиме реально-

ния анализа, дешевизной и небольшими размера-

го времени, не используя специальных меток [41].

ми [43,44]. Например, описана возможность де-

Поверхностный плазмонный резонанс представ-

текции бактериофагов с помощью биосенсоров,

ляет собой явление, возникающее на границе раз-

изготовленных из кристаллов кварца (SiO₂). Как

дела фаз, например, «стеклянная призма - метал-

правило, поверхность такого кристалла покрыва-

лическая пленка». Часть луча света, проходящего

ют специфическими антителами. При адсорбции

через призму и падающего под определенным уг-

веществ на поверхности кристалла меняется ре-

лом на поверхность металла, распространяется в

зонансная частота колебаний, что и регистриру-

металлической пленке в виде затухающей электро-

ется биосенсором (пьезоэлектрическим датчи-

магнитной волны, которая вызывает коллектив-

ком) [45-47]. Помимо SiO2 в качестве резонатора

ные колебательные движения свободных электро-

используют титанат бария, сегнетову соль, турма-

нов. Эти колебательные движения электронов -

лин и др.

поверхностный плазмон - распространяются не

только в металлической пленке, но и выходят за

О. Тамарин и соавт. [48], используя упругие

слой металла и экспоненциально убывают с увели-

волны с горизонтальной поперечной поляриза-

чением расстояния от поверхности диэлектрика

цией в слоистой среде (волны Лява), показали

(призмы). Связывание изучаемого объекта с по-

возможность обнаружения бактериофага М13 в

верхностью металлической пленки приводит к из-

режиме реального времени. Авторы на подложке

менению диэлектрической проницаемости и, сле-

из оксида кремния проводили необратимую им-

довательно, к изменению угла резонанса. Измене-

мобилизацию антител на бактериофаг М13, затем

ние угла резонанса можно отслеживать в режиме

проводили иммунореакцию между бактериофа-

реального времени, получая информацию о кине-

гом М13 и антителами, специфичными к М13, и

БИОФИЗИКА том 64

№ 6

2019

1100

ГУЛИЙ и др.

осуществляли анализ образовавшейся много-

зонатора специфичных антител

[57-61]. Для

слойной поверхности при помощи волн Лява. В

улучшения характеристик резонатора с попереч-

качестве контроля для подсчета титра бактерио-

ным электрическим полем и для подавления па-

фага частицы, связавшиеся с антителами на по-

разитных колебаний часть поверхности резона-

верхности датчика, элюировали, изменяя pH рас-

тора покрывалась специальным поглощающим

твора. При этом количество БОЕ оценивали мик-

покрытием [62].

робиологическими методами.

Возможности разработанного датчика проде-

Некоторые методы основаны на использова-

монстрированы в работах [59,61] для детекции

нии в качестве рецептора антител или мембран,

бактериофагов с помощью специфичных анти-

нанесенных на поверхность пьезоэлектрического

тел и фаговых мини-антител непосредственно в

звукопровода или резонатора [49]. Так, напри-

жидкой фазе без иммобилизации антител на по-

мер, используя иммобилизацию соответствую-

верхности пьезоэлектрика. Установлено, что

щих антивирусных антител на поверхности резо-

нижний предел детекции бактериофагов соста-

натора был разработан иммуносенсор для селек-

вил 10⁶фагов/мл при минимальном времени ана-

тивной детекции вирусов герпеса в человеческой

лиза ~5-10 мин. При этом степень изменения ха-

крови [50], а также в природных водоемах (реки,

рактеристик резонатора зависит от количества

сточные воды, канализация) без предваритель-

фаговых частиц, что открывает перспективы для

ной обработки анализируемого субстрата [51].

проведения не только качественного, но и коли-

Описана возможность изучения биомолеку-

чественного анализа бактериофагов. Полученные

лярных взаимодействий в растворах, контактиру-

зависимости показали возможность использова-

ющих напрямую с поверхностью резонатора, что

ния в качестве аналитического сигнала значение

значительно сокращает время, необходимое для

реальной или мнимой части электрического им-

детекции исследуемого образца. Например, с ис-

педанса на фиксированной частоте вблизи резо-

пользованием резонатора с продольным электри-

нанса. Возможности датчика были продемон-

ческим полем была продемонстрирована воз-

стрированы для бактериофагов, относящихся к

можность детекции эндотоксина в присутствии

разным таксономическим группам бактериофа-

веществ, приводящих к сдвигу резонансной ча-

гов. Например, нитчатый бактериофаг класса I

стоты [52].

М13К07 относится к семейству Inoviridae [57], а

бактериофаги ΦAl-Sp59b и ΦAl-SR65 соответ-

Продемонстрированы возможности акустиче-

ствуют семейству Podoviridae [59,61]. Был разра-

ского датчика с поверхностной акустической вол-

ботан критерий уверенной регистрации специ-

ной для детекции вируса Эбола с возможностью

фичного взаимодействия, который заключается в

его многократного использования [53]. Для обна-

том, что изменение модуля электрического импе-

ружения вируса гепатита В был разработан био-

данса датчика должно быть не менее ~5% при до-

сенсор на основе пьезоэлектрического резонато-

бавлении в суспензию бактериофагов определен-

ра с продольным электрическим полем [54].

ного количества антител. Преимуществами пье-

Описан прототип биосенсора на основе пьезо-

зоэлектрического резонатора является воз-

электрических материалов для определения ви-

можность его многократного использования. Это

русной инфекции в качестве диагностического

объясняется тем, что резонатор выполнен из

устройства для оказания помощи в чрезвычайных

кристалла ниобата лития, который является хи-

ситуациях, требующих быстрого и надежного те-

мически стойким практически ко всем химиче-

стирования на наличие патогенов, передающихся

ским соединениям. Кроме того, поверхность ре-

через кровь [55].

зонатора, обработанная по 14 классу чистоты, не

Весьма перспективными являются пьезоэлек-

допускает никакой адсорбции. Поэтому после

трические резонаторы с поперечным электриче-

промывки резонатора на его поверхности не оста-

ским полем, в которых отсутствует контакт ис-

ется никаких следов от суспензии, подтвержде-

следуемого материала с металлическими электро-

нием этому является полное восстановление всех

дами. Эти резонаторы используются для

его характеристик после всех экспериментов.

исследования свойств различных жидкостей,

включая и биологические. Такой резонатор пред-

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ставляет собой пьезоэлектрическую пластину, на

одной стороне которой нанесены два электрода.

Вирусные инфекции до сих пор представляют

Исследуемая жидкость контактирует с противо-

опасность для человечества, что стимулирует раз-

положной стороной пластины. Известно, что из-

витие новых экспресс-методов определения ви-

менение вязкости и проводимости контактирую-

русов. Количество методов, позволяющих полу-

щей жидкости приводит к изменению характери-

чать информацию о вирусной опасности, не-

стик резонатора [56]. Это позволяет проводить

уклонно растет. При этом основным требованием

анализ биологических объектов непосредственно

к новым методам кроме высокой чувствительно-

в жидкой фазе без нанесения на поверхность ре-

сти является возможность проведения анализа в

БИОФИЗИКА том 64

№ 6

2019

МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСОВ

1101

краткие сроки на большом количестве образцов,

A. Lesniewski, M. Los, M. Jonsson-Niedziółka, et al.,

а также порой и в «полевых условиях». Анализ на-

Bioconjugate Chem. 25, 644 (2014).

учной литературы, посвященной исследованию и

Н. Н. Носик и В. М. Стаханова, Клин. микробио-

развитию технологий в данном направлении, по-

логия и антимикробная химиотерапия 2 (2), 70

(2000).

казывает значительный потенциал биосенсорных

F. N. Dultsev, R. E. Speight, M. T. Fiorini, et al., Anal.

систем, в том числе акустических датчиков. Био-

Chem. 73 (16), 3935 (2001).

сенсоры зарекомендовали себя как надежные

K. P. O'Connell, J. R. Bucher, P. E. Anderson, et al.,

аналитические устройства, подходящие для обна-

Appl. Environ. Microbiol. 72 (1), 478 (2006).

ружения вирусов. Низкая стоимость, небольшие

требования к образцу и возможность миниатюри-

J. H. Lee, D. W. Domaille, and J. N. Cha, ACS Nano.

6 (6), 5621 (2012).

зации оправдывают их растущее развитие. Основ-

А. С. Лабинская, Микробиология с техникой микро-

ным моментом для всех датчиков является то, что

биологических исследований (Медицина, М., 1978).

датчики позволяет четко разграничивать ситуа-

В. В. Алексеев, Медицинские лабораторные техно-

ции, когда происходит взаимодействие вирусов

логии. Руководство по клинической лабораторной

со специфическими реагентами от контрольных

диагностике, под ред. А. И. Карпищенко (ГЭО-

экспериментов, когда такого взаимодействия не

ТАР-Медиа, М., 2013).

происходит. Несмотря на то что акустические

М. Адамс, Бактериофаги (Медгиз, М., 1961).

датчики используются для определения микроб-

10.

Э. Каттер, Бактериофаги. Биология и практическое

ных клеток, их применение для определения ви-

применение, под ред. Э. Каттер и А. М. Сулаквелид-

русов описано крайне скудно. Тем не менее дат-

зе (Научный мир, М., 2012).

чики на основе пьезоэлектрического резонатора

11.

M. H. V. van Regenmortel and B. W. J. Mahy Desk,

характеризуются отдельными преимуществами

Encyclopedia of General Virology (Acad. Press, San Di-

по сравнению с аналогичными методами и могут

ego, 2010).

занять одно из лидирующих позиций для реше-

12.

A. M. Kropinski and M. R. J. Clokie, Bacteriophages:

ния вопроса детекции вирусов. Неоспоримым до-

Methods and protocols, Еd. by M. R. J. Clokie and

стоинством акустических датчиков на основе

A. M. Kropinski (Humana Press, LLC, New Jersey,

пьезоэлектрического резонатора являются про-

2009), V. 1.

стая пробоподготовка, чувствительность, опера-

13.

H. W. Ackermann, Res. Microbiol. 154 (4), 245 (2003).

тивность и возможность многократного исполь-

14.

K. E. Ashelford, M. J. Day, and J. C. Fry, Аppl. Envi-

зования датчика. Дальнейшая стандартизация и

ron. Microbiol. 69, 285 (2003).

автоматизация метода электроакустического ана-

15.

А. К. Сироткин, Дисс. … канд. биол. наук (Санкт-

лиза позволит расширить круг его применения и

Петербург, 2004).

использования в микробиологии, биотехноло-

16.

H.-W. Ackermann and M. Heldal, in Manual of Aquatic

гии, ветеринарии, медицине, в том числе в обла-

Viral Ecology, Ed. by S. W. Wilhelm, M. G. Weinbauer,

сти фаговой терапии.

and C. A. Suttle (ASLO, 2010), pp. 182-192.

17.

И. В. Сафенкова, А. В. Жердев и Б. Б. Дзантиев,

Успехи биол. химии 52, 281 (2012).

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

18.

Yu. G. Kuznetsov, A. J. Malkin, R. W. Lucas, et al., J.

Gen. Virol. 82 (9), 2025 (2001).

Работа выполнена при частичной финансовой

19.

А. Н. Никиян и Е. Б. Татлыбаева, Вестн. Оренбург-

поддержке Российского фонда фундаментальных

ского гос. ун-та 6 (167), 112 (2014).

исследований (проекты №№ 19-07-00304 и 19-07-

20.

S. R. Nettikadan, J. C. Johnson, C. Mosher, and

00300).

E. Henderson, Biochem. Biophys. Res. Commun. 311

(2), 540 (2003).

21.

C. Qi, Y. Lin, J. Feng, et al., Virus Res. 140 (1-2), 79

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

(2009).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

22.

Т. Е. Игнатюк, И. А. Голутвин, Н. С. Насикан и

интересов.

др., Вопр. вирусологии 48 (6), 17 (2003).

23.

M. M. Ferris, C. L. Stoffel, T. T. Maurer, and

K. L. Rowlen, Anal. Biochem. 304 (2) 249 (2002).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

24.

К. Wen, A. C. Ortmann, and C. A. Suttle, Appl. Envi-

ron. Microbiol. 70 (7), 3862 (2004).

Настоящая работа не содержит описания ка-

25.

J. J. McSharry, Microbiol. Rev. 7 (4) 576 (1994).

ких-либо исследований с использованием людей

26.

C. P. D. Brussaard, D. Marie, and G. Bratbak, J. Virol.

и животных в качестве объектов.

Methods 85 (1-2), 175 (2000).

27.

C. Bergeron, J. Ordi, D. Schmidt, et al., Am. J. Clin.

Pathol. 133 (3) 395 (2010)/

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

28. А. М. Егоров, А. П. Осипов, Б. Б. Дзантиев и Е. М.

1. J. Carter and V. Saunders, Virology: principles and appli-

Гаврилова, Теория и практика иммуноферментного

cations (John Wiley & Sons Ltd, London, 2007).

анализа (Высш. шк., М., 1991).

БИОФИЗИКА том 64

№ 6

2019

1102

ГУЛИЙ и др.

29. А. H. Coons, H. J. Creech, R. N. Jones, and E. Berlin-

45.

E. Uttenthaler, M. Schräml, J. Mandel, and S. Drost,

er, J. Immunol. 45, 159 (1942).

Biosens. Bioelectron. 16 (9-12),735 (2001).

30. W. B. Cherry, In Manual of clinical microbiology, 3^rd

46.

M. R. Gajendragad, K. N. Y. Kamath, P. Y. Anil, et al.,

Ed., Ed. by E. H. Lennette, A. Balows, W. J. Hausler,

Veterinary Microbiol. 78, 319 (2001).

Jr, et al., (Am. Soc. Microbiol., Washington D.C.,

47.

S. Kurosawa, J. W. Park, H. Aizawa, et al., Biosens.

1980), pp. 501-508.

Bioelectron. 22 (4).473 (2006).

31. R. C. Wong and H. Y. Tse, Lateral Flow Immunoassay

48.

O. Tamarin, S. Comeau, C. Déjous, et al., Biosens.

(Humana Press, New Jersey, 2009).

Bioelectron. 18 (5-6), 755 (2003).

32. R. H. Yolken, D. A. Lennette, T. F. Smith, and J. L.

49.

D. S. Ballantine, R. M. White, S. J. Martin, et al.,

Waner, In Manual of Clinical Microbiology, 7^th Ed., Ed.

Acoustic Wave Sensors: Theory, Design, and Pysico-

by P. R. Murray, E. J. Baron, M. A. Pfaller, et al. (Am.

chemical Applications (Acad. Press, San Diego, 1997).

Soc. Microbiol., Washington D.C., 1999), pp. 843-

50.

B. Koenig and М. Graetzel, Anal. Chem. 66, 341

846.

(1994).

33. О. С. Антонова, Г. Е. Рудницкая, А. Н. Тупик и др.,

51.

M. Bisoffi, B. Hjelle, D. C. Brown, et al., Biosens. Bio-

Науч. приборостроение 21 (4), 5 (2011).

electron. 23 (9), 1397 (2008).

34. Э. Тернер, И. Карубе, Дж. Уилсон и др., в кн. Био-

52.

H. Muramatsu, E. Tamiya, M. Suzuki, and I. Karube,

сенсоры: основы и приложения (Мир, М., 1992),

Anal. Chim. Acta 217, 321 (1989).

сс. 457-487.

53.

J. T. Baca, V. Severns, D. Lovato, et al., J. Virol. 78,

35. M. Los, J. Los, and G. Wegrzyn, Microb. Cell Facto-

4330 (2004).

ries 5, S38 (2006). DOI: 10.1186/1475-2859-5-S1-S38.

54.

L. Zhou, M. Liu, L. Hu, et al., J. Pharm. Biomed. Anal.

36. N. T. Darwish, S. D. Sekaran, Y. Alias, and S. M. Khor,

27, 341 (2002).

J. Pharm. Biomed. Anal. 149,

591

(2018). DOI:

55.

M. Bisoffi, J. Clin. Microbiol. 51 (6), 1685 (2013).

10.1016/j.jpba.2017.11.064.

56.

B. D. Zaitsev, A. M. Shikhabudinov, A. A. Teplykh,

37. A. M. Rossi, L. Wang, V. Reipa, and T. E. Murphy, Bi-

and I. E. Kuznetsova, Ultrasonics 63, 179 (2015).

osens. Bioelectron. 23 (5), 741 (2007).

57.

B. D. Zaitsev, I. E. Kuznetsova, A. M. Shikhabudinov,

38. I. Grabowska, K. Malecka, U. Jarocka, et al., Acta Bio-

et al., Trans. Ultrason., Ferroel and Freq. Contr, 59 (5)

chim. Pol. 61 (3), 471 (2014).

963(2012).

39. A. Lesniewski, M. Los, M. Jonsson-Niedziółka, et al.,

58.

О. И. Гулий, Б. Д. Зайцев, И. Е. Кузнецова и др.

Bioconjugate Chem. 25, 644 (2014).

Биофизика 61 (1) 60 (2016).

40. X. Muñoz-Berbel, C. García-Aljaro, and

59.

О. И. Гулий, Б. Д. Зайцев, И. А. Бородина и др.

F. J. Muñoz, Electrochim. Acta 53, 5739 (2008).

Биофизика 62 (3), 472 (2017).

41. N. J. De Mol, M. J. Е. Fischer, Surface Plasmon Reso-

60.

О. И. Гулий, Б. Д. Зайцев, А. В. Смирнов и др.,

nance. Methods and Protocols (Humana Press, N.-Y.,

Прикл. биохимия и микробиология. 53 (6), 642

2010).

(2017).

42. C. Garcia-Aljaro, X. Munoz-Berbel, A. T. A. Jenkins,

61.

О. I. Guliy, B. D. Zaitsev, I. A. Borodina, et al., Talanta

et al., Appl. Environ. Microbiol. 74 (13), 4054 (2008).

178, 743 (2018).

43. E. Don, O. Farafonova, S. Pokhil, et al., Sensors 16 (1),

62.

Б. Д. Зайцев, И. Е. Кузнецова, А. М. Шихабудинов

96 (2016). DOI: 10.3390/s16010096.

и А. А. Васильев, Письма в журн. тех. физики 37

44. M. Pohanka, Int. J. Electrochem. Sci. 12, 496 (2017).

(11), 27(2011).

Virus Detection Methods and Biosensor Technologies

O.I. Guliy*^, **, B.D. Zaitsev***, O.S. Larionova**, and I.A. Borodina***

*Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms, Russian Academy of Sciences,

prosp. Entuziastov 13, Saratov, 410049 Russia

** Saratov State Vavilov Agrarian University, Teatralnaya pl. 1, Saratov, 410012 Russia

***Saratov Branch of Kotelnikov Institute of Radio Engineering and Electronics, Russian Academy of Sciences,

ul. Zelenaya 38, Saratov, 410019 Russia

This paper provides a brief overview of the modern and classical virus detection methods using bacteriophag-

es as an example. Great attention has been paid to screening assays for the detection of viruses while analyzing

a large number of samples, due to these approaches the overall cost savings for the laboratory is significant.

One of the most high-demand tendencies in microbiology is the development of rapid and sensitive biosen-

sors for detection of viruses, on the basis of the methods of electrophysical analysis. The interest in biosensor

systems for virus detection in aqueous solutions is due to their simplicity, cost-effectiveness, and relatively

high sensitivity. The prospects of using electro-acoustic sensors in the development of biosensor methods for

determining viruses are shown.

Keywords: virus detection, bacteriophages, antibodies, biosensors

БИОФИЗИКА том 64

№ 6

2019