БИОФИЗИКА, 2019, том 64, № 6, с. 1134-1137

БИОФИЗИКА КЛЕТКИ

УДК 577.24:612.014.462.4

ЦИТОТОКСИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ АТМОСФЕРНОЙ ХОЛОДНОЙ

ПЛАЗМЫ НА ОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТКИ HeLa И ЕГО ИЗМЕНЕНИЕ

В ПРИСУТСТВИИ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ

А.В. Пулиш*, Н.Г. Гусейн-заде*^, **, Л.В. Колик*^, **, Е.М. Кончеков*^, **

*Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова,

117997, Москва, ул. Островитянова, 1

**Институт общей физики им. А.М. Прохорова РАН, 119991, Москва, ул. Вавилова, 38

E-mail: artura777@mail.ru

Поступила в редакцию 23.07.2019 г.

После доработки 23.08.2019 г.

Принята к публикации 29.08.2019 г.

Показано, что низкотемпературная неравновесная плазма прямого пьезоразряда оказывает дозоза-

висимое цитотоксическое действие на культуру опухолевых клеток HeLa. Противоопухолевый ан-

тибиотик доксорубицин увеличивал данный эффект холодный плазмы, а антиоксидант дигидро-

кверцетин - ослаблял.

Ключевые слова: холодная плазма, цитотоксичность, опухолевые клетки, апоптоз, доксорубицин.

DOI: 10.1134/S0006302919060127

В последние годы в ряде исследований показа-

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ны возможности применения низкотемператур-

Воздействие на культуры клеток проводили с

ной плазмы при атмосферном давлении в биоло-

помощью лабораторного источника низкотемпе-

гии и медицине для стерилизации различных

ратурной плазмы на основе прямого пьезоразря-

поверхностей и живых тканей, регуляции коагу-

да, получаемого с помощью пьезотрансформато-

ляции крови, стимуляции заживления тканей и

ра ТП-Р1 (ИОФ РАН, Москва). Этот источник

пролиферации клеток [1]. Особый интерес пред-

создавал в воздухе короткие плазменные каналы

ставляют возможности применения холодной

(10-100 нс) с частотой, приблизительно соответ-

плазмы в онкологии [2].

ствующей двойной резонансной частоте пьезо-

Согласно литературным данным [3], преиму-

трансформатора (~40 кГц). Оптимальные значе-

ществом плазменных технологий в онкологии

ния КПД и выходной мощности достигались при

работе на резонансной частоте пьезотрансформа-

может являться их способность к дифференциро-

ванному воздействию на здоровые и опухолевые

тора или ее гармониках. Потребляемая мощность

клетки. Большинство исследователей связывают

прибора не превышает 10 Вт при энерговкладе в

механизм цитотоксических эффектов плазмен-

обрабатываемую среду 75 Дж/мин. Спектр излу-

ного облучения с генерацией активных форм кис-

чения прямого пьезоразряда в воздухе при атмо-

сферном давлении, представлен на рис. 1.

лорода и активных форм азота, в частности Н₂О₂

Для экспериментов по облучению клетки вы-

и NO^• [4,5]. Так как существуют различные ле-

севали на шестилуночные планшеты в концен-

карственные соединения, влияющие на образо-

трации 200 тыс. клеток на лунку. Общая доза воз-

вание радикалов, представляет интерес изучить

действия плазмы регулировалась временем облу-

действие таких веществ на цитотоксическую ак-

чения в интервале от 30 до 300 с.

тивность холодной плазмы. Для этого в данной

работе мы оценили комбинированное цитоток-

Жизнеспособность клеток до и после облуче-

сическое действие холодной плазмы, противо-

ния оценивали с помощью МТТ-теста [8]. Клетки

опухолевого средства доксорубицина (индуктора

рака шейки матки человека HeLa культивировали

образования радикалов в процессе его метаболиз-

с использованием среды для культивирования

ма) [6] и флавоноида дигидрокверцетина, облада-

RPMI (Sigma-Aldrich, США) со стабильным глу-

ющего антиоксидантными и антирадикальными

тамином GlutaMax и добавлением 10% эмбрио-

свойствами [7], на культуру опухолевых клеток.

нальной телячьей сыворотки во флаконах Т75 с

1134

ЦИТОТОКСИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ АТМОСФЕРНОЙ ХОЛОДНОЙ ПЛАЗМЫ

1135

Рис. 1. Спектр излучения прямого пьезоразряда в воздухе при атмосферном давлении в диапазоне 200-500 нм.

культуральным покрытием и вентилируемой

HeLa с пороговым значением дозы, соответству-

крышкой при температуре 37°С в атмосфере, со-

ющей времени облучения 30 с.

держащей 5% CO₂. Статистическую обработку ре-

Так как увеличение времени инкубации с 24 до

зультатов проводили с помощью t-критерия

48 ч практически не влияло на цитотоксичность

Стьюдента при уровне значимости Р ≤ 0,05.

холодной плазмы, можно считать, что это дей-

ствие сохраняется и пролиферация клеток со вре-

В качестве фармакологических веществ ис-

менем не восстанавливается.

пользовали доксорубицин («Тева», Израиль) и

Как и ожидалось, добавление к среде инкуба-

дигидрокверцетин («Биотехпром», Россия). Кон-

ции клеток индуктора образования радикалов

центрация

доксорубицина

составляла

доксорбуицина повышает (рис. 2б и 3б), а инги-

0,3 мкмоль/л [9], а концентрация дигидрокверце-

битора их образования дигидрокверцетина

тина - 0,1 мкмоль/л [7], что соответствует их кон-

уменьшает цитотоксичность холодной плазмы

центрациям, при которых наблюдается антипро-

(таблица). Дигидрокверцетин добавляли в инку-

лиферативное и антиоксидантное действие соот-

бационную среду клеточной культуры как до, так

ветственно.

и после облучения.

Оценку количества образовавшихся радика-

Эти результаты подтверждают существующие

лов после воздействия холодной плазмы прово-

представления об основной роли радикалов в ан-

дили с помощью метода стимулированной хеми-

типролиферативном действии холодной плазмы

люминисценции. В качестве активатора свечения

на опухолевые клетки и показывают возможность

использовали люминол в стандартной концен-

его усиления при сочетанном действии с проти-

трации (0,177 г/мл). В качестве контрольного об-

воопухолевым препаратом доксорубиином.

разца использовали соответствующие необлучен-

Совместный цитотоксический эффект доксо-

ные растворы, а количество радикалов оценивали

рубицина и холодной плазмы возрастал с увели-

по отношению интенсивности хемилюминесцен-

чением дозы воздействия. Этот результат, воз-

ции исследуемой пробы к интенсивности хеми-

можно, связан с тем, что при метаболизме доксо-

люминесценции контрольной пробы. Измерение

рубицина вырабатываются свободные радикалы

интенсивности хемилюминесценции проводили

кислорода, повреждающие ДНК и нарушающие

на биохемилюминесцентном анализаторе «Lum-

биосинтетические процессы в клетках [6,10].

100» (ООО «ДИСофт», Москва).

Относительно высокая чувствительность опу-

холевых клеток к активным формам кислорода

обусловлена метаболическими различиями по

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

сравнению с нормальными клетками. Уровни ак-

Результаты исследования цитотоксического

тивных форм кислорода в раковых клеток выше,

в связи с чем воздействие плазмы активирует апо-

действия холодной плазмы на линию клеток

птоз в опухолевых клетках интенсивнее, чем в

HеLа при различных дозах воздействия и време-

нах инкубации представлены на рис. 2а и 3а. В ка-

здоровых [4,11]. Влияние свободных радикалов на

честве контроля служили клетки, не облученные

пролиферацию опухолевых клеток носит дозоза-

в ходе экспериментов. Обнаружено, что суще-

висимый характер [4].

ствует дозовая зависимость подавления холодной

Исследования, проведенные методом хемилю-

плазмой жизнеспособности культуры клеток

минесценции с применением люминола, в кото-

БИОФИЗИКА том 64

№ 6

2019

1136

АКОПДЖАНОВ и др.

Рис. 2. Жизнеспособность клеток линии HeLa (в %) в зависимости от дозы воздействия холодной плазмой в отсут-

ствие (а) и в присутствии (б) доксорубицина. Время инкубации 24 ч, число экспериментов n = 6.

ром интенсивность зарегистрированной вспыш-

относительно невысокой проникающей способ-

ки пропорциональна количеству свободных ра-

ностью плазмы, что указывает на перспектив-

дикалов в исследуемом растворе доксорубицина,

ность применения ее в дерматологии, в том числе

показали увеличение амплитуды сигнала при воз-

при терапии меланомы. Существуют возможно-

действии холодной плазмы более чем в 10 раз при

сти как непосредственного воздействия на ново-

дозе облучения 75 Дж.

образования, так и опосредованное воздействие с

Очевидным преимуществом применения

помощью плазменно-активированной жидкой

плазменных технологий в онкологии является

среды (PALM - plasma activated liquid media) [12].

возможность локального воздействия на новооб-

Применение методик совместного воздействия

разование и относительно низкая дозовая нагруз-

плазменного облучения и противоопухолевого

ка, что позволит существенно снизить побочное

препарата может повысить избирательность хи-

действие холодной плазмы на здоровые ткани. В

миотерапии и существенно снизить системные

то же время локальность воздействия сочетается с

побочные эффекты как химиотерапевтического

Рис. 3. Жизнеспособность клеток линии HeLa (в %) в зависимости от дозы воздействия холодной плазмой в

отсутствие (а) и в присутствии (б) доксорубицина. Время инкубации 48 ч, число экспериментов n = 6.

БИОФИЗИКА том 64

№ 6

2019

ЦИТОТОКСИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ АТМОСФЕРНОЙ ХОЛОДНОЙ ПЛАЗМЫ

1137

Жизнеспособность клеточной линии Hela в зависимости от дозы воздействия холодной плазмой при добавлении

дигидрокверцетина и последующей инкубации клеток в течение 48 ч

Доза облучения, Дж

112,5

150

225

300

Облучение

100

93,28 ± 8,52

80,74 ± 8,07*

67,37 ± 6,31*

20,16 ± 2,17*

12,26 ± 1,31*

Облучение +

+ дигидрокверцетин,

94,08 ± 9,21

94,33 ± 9,53

94,81 ± 9,41

91,39 ± 9,21

89,41 ± 8,99*

61,98 ± 6,19*

0,1 мкМоль/л

Дигидрокверцетин,

0,1 мкМоль/л +

94,08 ± 9,21

94,91 ± 9,49

91,36 ± 9,14

90,36 ± 9,09

81,98 ± 8,18*

60,12 ± 6,01*

+ облучение

Примечание. Результаты приведены в % от контроля (клетки без облучения). * - Достоверное отличие от контроля, р < 0,05.

Число экспериментов n = 6.

препарата, так и самого излучения за счет сниже-

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ния дозовых нагрузок на организм.

1. M. Laroussi, Plasma 1 (1), 47 (2018).

В то же время сочетанное применение антиок-

2. J. Gay-Mimbrera, M. Carmen, G. Isla-Tejera, et al.,

сидантов типа дигидрокверцетина уменьшает ан-

Adv. Therapy 33 (6), 894 (2016).

типролиферативный эффект холодной плазмы,

3. F. Saadati, H. Mahdikia, H. Abbaszadeh, et al., Sci.

что следует учитывать при разработке методов

Reports 8, 7689 (2018).

практического применения холодной плазмы для

4. R. A. Cairns, I. Harris, S. McCracken, and T. W. Mak,

лучевой терапии опухолей.

Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 76, 299 (2011).

5. D. Yan, J. H Sherman, and M. Keidar, Oncotarget 8,

15977 (2017).

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

6. P. D. S. D. Rocha, J. F. Campos, V. Nunes-Souza,

Работа выполнена при финансовой поддержке

et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 184 (3), 869 (2018).

Российского фонда фундаментальных исследова-

7. В. С. Роговский, А. И. Матюшин, Н. Л. Шиманов-

ний (гpант № 19-02-00378 А).

ский и др., Эксперим. клинич. фармакология 73

(9), 39 (2010).

8. M. Berridge, P. Herst, and A. Tan, Biotechnol. Annu.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Rev. 11, 127 (2005).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

9. А. Г. Акопджанов, Н. Л. Шимановский, В. В. Мин-

интересов.

галев и др. Биофизика 59 (5), 902 (2014).

10. А. Г. Акопджанов, Н. Л. Шимановский, Т. А. Фе-

дотчева и др. Биофизика 61 (6), 1073 (2016).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

11. M. Keidar, R. Walk, A. Shashurin, et al., Br. J. Cancer

Настоящая работа не содержит описания ка-

105, 1295 (2011).

ких-либо исследований с использованием людей

12. H. Hara, M. Kobayashi, M. Shiiba, et al., J. Clin. Bio-

и животных в качестве объектов.

chem. 65 (1), 16 (2019).

Cytotoxicity of Cold Atmospheric Plasma against HeLa Cancer Cells

and Its Modification in the Presence of Pharmaceutical Substances

A.G. Akopdzhanov*, N.L. Shimanovskii*, D.S. Stepanova*, T.A. Fedotcheva*, A.V. Pulish*,

N.G. Gusein-zade*^, **, L.V. Kolik*^, **, and E.M. Konchekov*^, **

*Pirogov Russian National Research Medical University, ul. Ostrovitianova 1, Moscow, 117997 Russia

**Prokhorov General Physics Institute, Russian Academy of Sciences, ul. Vavilova 38, Moscow, 119991 Russia

It was shown that low-temperature non-equilibrium plasma as piezoelectric direct discharge plasma had a

dose-dependent cytotoxic effect on the HeLa cell culture. Doxorubicin, an antitumor antibiotic, potentiated

the said effect of cold plasma, while dihydroquercetin as an antioxidant weakened it.

Keywords: cold plasma, cytotoxicity, cancer cells, apoptosis, doxorubicin

БИОФИЗИКА том 64

№ 6

2019